Immunologiske studier innen urologi

Å foreskrive et immunogram til en urologisk pasient betyr at den behandlende legen mistenker tilstedeværelsen av lidelser i immunsystemet. Gjentatte bakterielle, virus-, soppinfeksjoner, allergiske manifestasjoner, systemiske sykdommer kan være tegn på disse lidelsene, som er preget av en rekke syndromer (infeksiøse, onkologiske, allergiske, autoimmune, lymfoproliferative). Én pasient kan ha flere syndromer. For eksempel kan kroniske infeksjonssykdommer (infeksiøst syndrom) forårsake immunsvikt, og immunsvikt kan manifestere seg som en predisposisjon for infeksjonssykdommer og onkologiske sykdommer (onkologisk syndrom). Predisposisjon for infeksjoner kan oppstå på bakgrunn av sekundær immunsvikt, som utviklet seg som et resultat av en lymfoproliferativ sykdom, som leukemi. Det er tre hovedgrupper av patologiske forandringer i immunsystemet:

• kvantitativ eller funksjonell mangel på en eller annen kobling i immunsystemet, som fører til utvikling av en immunsviktstilstand;
• en forstyrrelse i immunsystemets gjenkjenning av antigener, noe som fører til utvikling av autoimmune prosesser;
• en hyperreaktiv eller "pervertert" immunrespons, manifestert ved utvikling av allergiske sykdommer.

Det finnes screening- (nivå 1-tester) og avklaringsmetoder (nivå 2-tester) innen immundiagnostikk. Førstnevnte brukes til å registrere forstyrrelser i immunsystemet, sistnevnte til å etablere mekanismene som er involvert i implementeringen av disse, med det formål å utføre ytterligere immunkorreksjon.

B-celleimmunitet

Screeningsmetoder

• Bestemmelse av det relative og absolutte antallet B-lymfocytter ved bruk av immunofluorescens eller flowcytofluorometri med monoklonale antistoffer mot B-celleantigener (CD19, CD20, hvor CD er differensieringsklynger). Normalinnholdet av B-lymfocytter hos voksne er 8–19 % av det totale antallet leukocytter eller 190–380 celler/μl. En økning i innholdet av B-lymfocytter forekommer ved akutte og kroniske bakterielle og soppinfeksjoner, kroniske leversykdommer, systemiske bindevevssykdommer, kronisk lymfatisk leukemi og myelomatose.
• Bestemmelse av konsentrasjonen av uspesifikke immunoglobuliner (F, M, G, E) ved enkel radial immunodiffusjon, nefelometri eller turbometri, radioimmunoassay eller enzymimmunoassay (ELISA). Normer for voksne: immunoglobulin (Ig) A 0,9–4,5 g/l. IgM 03–3,7 g/l. IgG 8,0–17 g/l. En økning i konsentrasjonen av immunoglobuliner forekommer under de samme patologiske tilstandene som en økning i innholdet av B-lymfocytter. En reduksjon i konsentrasjonen av immunoglobuliner forekommer ved medfødt hypogammaglobulinemi, neoplasmer i immunsystemet, fjerning av milten, proteintap, nyre- eller tarmsykdommer, behandling med cytostatika og immunsuppressiva.

Avklaringsmetoder

• Bestemmelse av sirkulerende immunkomplekser i blodet ved selektiv utfelling i polyetylenglykol etterfulgt av spektrofotometrisk tetthetstesting (normal 80–20 U). En økning i sirkulerende immunkomplekser er typisk for akutte bakterielle, sopp- og virusinfeksjoner, autoimmune sykdommer, immunkomplekssykdommer, serumsyke og allergiske reaksjoner av type 3;
• Bestemmelse av spesifikke immunoglobuliner i blodet i forhold til bakterielle og virale antigener, deoksyribonukleinsyre (DNA) ved autoimmune sykdommer, påvisning av antisperm (autoimmun infertilitet) og antirenale antistoffer (pyelonefritt og glomerulonefritt) ved hjelp av radial immunodiffusjons- eller ELISA-metoden.
• Bestemmelse av antisperm-antistoffer i sædceller [MAR-test (blandet antiglobulinreaksjon)], normalt - negativt resultat.
• Bestemmelse av konsentrasjonen av immunoglobuliner i urin med det formål å differensialdiagnostisere mellom pyelonefritt og glomerulonefritt (selektivitet av proteinuri).
• Bestemmelse av IgE-innhold i prostatajuice for å diagnostisere allergisk prostatitt ved bruk av radial immunodiffusjonsmetoden eller ELISA.
• Studie av responsen i reaksjonen av B-lymfocytt-blasttransformasjon på B-celle-mitogen (kermesbærmitogen for stimulering av reaksjonen av B-lymfocytt-blasttransformasjon i nærvær av T-lymfocytter), hvis normative verdi er 95–100 %.

T-cellekobling av immunitet

Screeningsmetoder

• Bestemmelse av det relative og absolutte antallet modne CD3 T-lymfocytter ved hjelp av immunofluorescensreaksjon eller flowcytofluorometri ved bruk av monoklonale anti-CD3-antistoffer. Normen for voksne er 58–76 % eller 1100–1700 celler/μl. En reduksjon i antall T-lymfocytter er en indikator på utilstrekkelighet av den cellulære immunitetskoblingen. Dette er typisk for noen sekundære og primære immunsvikttilstander (kroniske bakterielle og virusinfeksjoner: tuberkulose, ervervet immunsviktsyndrom, ondartede svulster, kronisk nyresvikt, skader, stress, aldring, underernæring, behandling med cytostatika, eksponering for ioniserende stråling). En økning i antall T-lymfocytter forekommer mot bakgrunn av immunhyperaktivitet eller ved lymfoproliferative sykdommer. Ved betennelse øker antallet T-lymfocytter først og reduseres deretter. Fravær av en reduksjon i T-lymfocytter indikerer en kronisk inflammatorisk prosess.
• Evaluering av lymfocyttsubpopulasjoner.
  • Bestemmelse av antall T-hjelpere (anti-CD4-antistoffer). Normalt 36–55 % eller 400–1100 celler/mcl. En økning i antallet av disse cellene forekommer ved autoimmune sykdommer, Waldenströms sykdom, aktivering av antitransplantasjonsimmunitet; en reduksjon i antall T-hjelpere forekommer ved kroniske bakterielle, virale og protozoiske infeksjoner, tuberkulose, ervervet immunsviktsyndrom, ondartede svulster, brannskader, skader, underernæring, aldring, behandling med cytostatika, eksponering for ioniserende stråling.
  • Bestemmelse av antall T-suppressorer (anti-CD4-antistoffer). Normalt 17–37 % eller 300–700 celler/μl. En økning i antall T-suppressorer skjer under de samme forholdene der antallet T-hjelpere synker, og reduksjonen av disse skjer under de samme forholdene der innholdet av T-hjelpere øker.
  • Immunoregulatorisk indeks CD4/CD8, normalt 1,5–2,5. Hyperaktivitet med verdier over 2,5 (allergiske og autoimmune sykdommer); hypoaktivitet – mindre enn 1,0 (predisposisjon for kroniske infeksjoner). Ved begynnelsen av den inflammatoriske prosessen øker den immunoregulatoriske indeksen, og når den avtar, normaliseres den.

Avklaringsmetoder

• Bestemmelse av antall naturlige drepere (NK-celler) - anti-CD16 og anti-CD56 antistoffer. Normen for CD 16 lymfocytter er 6–26 %, CD56 - 9–19 %. En økning i antall NK-celler skjer ved transplantatavstøtning, en reduksjon - ved virusinfeksjoner, kreft, primære og sekundære immunsvikter, brannskader, skader og stress, behandling med cytostatika og eksponering for ioniserende stråling.
• Bestemmelse av antall T-lymfocytter med en reseptor for interleukin-2 (aktiveringsmarkør) - anti-CD25-antistoffer. Normen er 10-15 %. En økning i antallet observeres ved allergiske sykdommer, transplantatavstøtning, respons på tymusavhengige antigener i den akutte perioden med primærinfeksjon, en reduksjon - ved de samme sykdommene der det er en reduksjon i antall NK-celler.
• Studie av uttrykk av aktiveringsmarkør - klasse II histokompatibilitetsmolekyl HLA-DR. Økt uttrykk forekommer i inflammatoriske prosesser, hos pasienter med hepatitt C, cøliaki, syfilis, akutte luftveissykdommer.
• Evaluering av lymfocytt-apoptose. En grov idé om lymfocytters beredskap for apoptose kan bestemmes ved uttrykket av Fas-reseptoren (CD95) på overflaten deres og bd-2 proto-onkogenet i mitokondriene. Lymfocytt-apoptose vurderes ved å behandle dem med to fluorescerende fargestoffer: propidiumjodid, som binder seg til DNA-fragmenter, og annexin Y, som binder seg til fosfatidylserin, som vises på cellemembranen ved starten av apoptose. Resultatene evalueres ved hjelp av et flowcytofluorometer. Resultatene beregnes basert på forholdet mellom celler farget med forskjellige fargestoffer. Ufargede celler er levedyktige, celler bundet kun til annexin Y er tidlige manifestasjoner av apoptose, mens propidiumjodid og annexin Y er sene manifestasjoner av apoptose, og farging med kun propidiumjodid indikerer nekrose.
• Evaluering av T-lymfocyttproliferasjon in vitro.
  • Endringer i celleblastogenese - lymfocyttblasttransformasjonsreaksjon. Leukocytter inkuberes med et hvilket som helst mitogen av planteopprinnelse (lektiner). Fytohemagglutinin brukes oftest i 72 timer, deretter tas et utstryk, farges og antall blaster telles! Stimuleringsindeksen er forholdet mellom prosentandelen transformerte celler i eksperimentet (kultur med fytohemagglutinin) og prosentandelen transformerte celler i kontrollen (kultur uten fytohemagglutinin). Lymfocyttblasttransformasjonsreaksjonen kan vurderes ved å inkludere en radioaktiv markør (ZN-thymndinum) i de dyrkede cellene, siden DNA-syntesen øker under celledeling. Forstyrrelser i den proliferative responsen forekommer i både primære og sekundære immunsvikt assosiert med infeksjoner, kreft, nyresvikt og kirurgiske inngrep.
  • I disse studiene vurderes uttrykket av aktiveringsmarkører (CD25, transferrinreseptor - CD71) og molekylet til det viktigste histokompatibilitetskomplekset klasse II HLA-DR, som praktisk talt er fraværende på hvilende T-lymfocytter. T-lymfocytter stimuleres med fytohemagglutinin, og etter 3 dager analyseres uttrykket av aktiveringsmarkører ved hjelp av direkte eller indirekte immunofluorescensreaksjon, flowcytofluorometri, ved bruk av monoklonale antistoffer mot de isolerte reseptorene.
  • Måling av mengden mediatorer syntetisert av aktiverte T-lymfocytter [interleukin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon, etc.] ved bruk av radioimmunoassay eller ELISA. Av spesiell betydning er vurderingen av konsentrasjonen av γ-interferon og IL-4 som markører for Th1 og Th2 i supernatanten av aktiverte kulturer og inne i cellen. Hvis mulig er det nyttig å bestemme genuttrykket for det tilsvarende cytokinet ved nivået av matriksribonukleinsyre i produsentcellen og intensiteten av uttrykket av reseptorer for de tilsvarende cytokinene.
    
• Reaksjon for hemming av lymfocyttmigrasjon. Sensibiliserte T-lymfocytter utskiller lymfokiner i reaksjon med antigen, inkludert faktorer som hemmer lymfocyttmigrasjon. Hemmingsfenomenet observeres når mitogener introduseres i cellekulturen. Evaluering av hemmingsgraden lar oss bedømme lymfocyttenes evne til å utskille cytokiner. Normalt er migrasjonsfrekvensen, avhengig av det spesifikke mitogenet, 20–80 %.
• Vurdering av NK-celle-cytotoksisitet. Naturlige drepercellers evne til å drepe målceller i K-562 erytromyeloidlinjen bestemmes. Hvis antistoffavhengig cytotoksisitet vurderes, brukes målceller belagt med IgG-antistoffer. Målcellene merkes med 3H-uridin og inkuberes med effektorceller. Døden av målcellene vurderes ved frigjøring av den radioaktive markøren i løsningen. En reduksjon i cytotoksisitet forekommer i ondartede neoplasmer. I noen tilfeller, når det er nødvendig å forutsi effektiviteten av behandling med interleukiner, vurderes cytotoksisiteten til NK-celler under inkubasjon med visse cytokiner.

Studie av fagocyttfunksjon

Screeningsmetoder

Studie av absorpsjonsintensiteten av mikrobielle celler av fagocytter (fagocytose av latekspartikler, testkultur av stafylokokker, E. coli eller mikroorganismer isolert fra pasienten). Ved sentrifugering av heparinisert blod isoleres en suspensjon av leukocytter, serum av IV-blodgruppe tilsettes for opsonisering (opsoniner er proteiner som forsterker fagocytose). Den mikrobielle suspensjonen fortynnes, blandes med leukocytter og inkuberes i 120 minutter, og prøver tas for analyse 30.90.120 minutter etter inkubasjonsstart. Utstryk tas fra den innsamlede leukocyttsuspensjonen. Følgende fagocytoseindikatorer bestemmes:

• fagocytisk indeks - prosentandelen celler som gikk inn i fagocytose innen 30 minutter og 120 minutter etter inkubasjon; standardverdien for fagocytisk indeks (30) er 94 %, fagocytisk indeks (120) er 92 %;
• fagocyttantall - gjennomsnittlig antall bakterier lokalisert intracellulært; standardverdien for fagocyttantall (30) er 11 %, fagocyttantall (120) er 9,8 %;
• fagocyttantallskoeffisient - forholdet mellom fagocytttallet (30) og fagocytttallet (120); normalt 1,16;
• Neutrofil bakteriedrepende indeks - forholdet mellom antall mikrober drept inne i fagocytter og det totale antallet mikrober absorbert; normalt 66 %.

Avklaringsmetoder

• Studie av fagocytters bakteriedrepende evne i testen med nitroblått tetrazolium (NBT) - NBT-test. Gult nitroblått tetrazoliumfargestoff tilsettes leukocytter. Når en nøytrofil absorberer fargestoffet, skjer en reduksjonsprosess under påvirkning av frie oksygenradikaler, noe som resulterer i blåfarging. Reaksjonen utføres i en 96-brønns flatbunnet plate. Hanks' løsning (spontan NBT) tilsettes de tre første brønnene med en blanding av NBT og leukocytter, og latekspartikler tilsettes den andre; blandingen inkuberes ved 37 °C i 25 minutter. Resultatene avleses ved 540 nm på en avleser og uttrykkes i vilkårlige enheter. Stimuleringskoeffisienten (Kst ₎ beregnes, lik forholdet mellom den optiske tettheten i de stimulerte brønnene og den gjennomsnittlige optiske tettheten i brønnene uten stimulering. Hos friske personer er NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. Rettstrikk = 1,78 ± 0,36 _.
• Studie av adhesjonsmolekyler. Flowcytofluorometri brukes til å bestemme uttrykket av overflateantigenene CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Immunsvikt med nedsatt adhesjon manifesterer seg ved tilbakevendende infeksjoner, langsom sårheling og fravær av puss i infeksjonsfokus.

Studiet av komplementsystemet

Screeningsmetoder

Bestemmelse av komplementets hemolytiske aktivitet er en studie av den klassiske veien for komplementaktivering. Ulike fortynninger av serum fra en syk og frisk person tilsettes til erytrocytter belagt med antistoffer. Enheten for hemolytisk aktivitet er den resiproke serumfortynningen der 50 % av erytrocyttene ødelegges. Graden av hemolyse estimeres fotometrisk ved frigjøring av hemoglobin i løsningen. En reduksjon i komplementets hemolytiske aktivitet observeres ved systemisk lupus erythematosus med nyreskade, akutt glomerulonefritt, kombinert immunsvikt, myasteni, viral hepatitt, lymfomer, en økning - i obstruktiv gulsott, Hashimotos tyreoiditt, revmatisme, revmatisme, revmatoid artritt, nodulær periarteritt, dermatomyositt, hjerteinfarkt, ulcerøs kolitt, Reiters syndrom, gikt.

Avklaringsmetoder

• Bestemmelse av komplementkomponenter. Kvantitativ bestemmelse utføres ved radial immunodiffusjon og nefelometri.
  Studien er ikke informativ med mindre de antigene egenskapene til komplementkomponentene endres.
• Det er fastslått at Clq-komponenten i komplement forsterker fagocytose og medierer cellulær cytotoksisitet. Reduksjonen forekommer ved immunkomplekssykdommer, systemisk lupus erythematosus, purulente infeksjoner og svulster.
• C3-komponenten er involvert i aktiveringen av de klassiske og alternative komplementveiene. En reduksjon i konsentrasjonen er assosiert med kroniske bakterielle og soppinfeksjoner, og tilstedeværelsen av sirkulerende eller vevsmessige immunkomplekser.
• C4-komponenten er involvert i aktiveringen av den klassiske signalveien. En reduksjon i konsentrasjonen er assosiert med langvarig aktivering av komplement av immunkomplekser og en reduksjon i konsentrasjonen av C1-hemmeren, som kontrollerer aktiveringen av den klassiske komplementveien. C4-mangel forekommer ved systemisk lupus erythematosus, en økning i C4 forekommer ved nyresykdom, transplantatavstøtning, akutt betennelse og mage-tarmsykdommer.
• C5a er et lite fragment av C5-molekylet, som spaltes av fra det som et resultat av aktivering av komplementsystemet. Konsentrasjonen øker under betennelse, sepsis, atopiske og allergiske sykdommer.
• Cl-hemmeren er en multifunksjonell faktor. Den kontrollerer aktiveringen av komplementkomponenten C1, hemmer aktiviteten til kallikrein, plasmin og aktivert Hageman-faktor, Cls og Or-proteaser. Mangel på C1-hemmeren fører til angioødem.
• funksjonelle studier av komplement. Testserumet tilsettes et standardserum som mangler komplementkomponenter, og komplementets hemolytiske aktivitet bestemmes. Hvis den hemolytiske aktiviteten ikke gjenopprettes til normalen, anses aktiviteten til denne komplementkomponenten i testserumet å være redusert.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]