Molekylærgenetiske metoder for diagnostisering av arvelige sykdommer

DNA-teknologiske metoder brukes til å bestemme lokaliseringen av et mutantgen i et bestemt kromosom, som er ansvarlig for opprinnelsen til visse former for arvelig patologi. Siden et gen er en del av DNA, og en genmutasjon er skade på DNA-ets primære struktur (mutasjon forstås som alle endringer i DNA-sekvensen, uavhengig av deres lokalisering og innvirkning på et individs levedyktighet), er det mulig å fastslå lokaliseringen av det patologiske genet ved å undersøke preparater av metafasekromosomer hos en pasient med en arvelig sykdom. Molekylære genetiske metoder skaper muligheter for å diagnostisere sykdommer på nivå med endret DNA-struktur, de lar oss bestemme lokaliseringen av arvelige lidelser. Molekylære genetiske metoder kan identifisere mutasjoner assosiert med erstatning av selv én enkelt base.

Det viktigste stadiet i genidentifisering er isoleringen. DNA kan isoleres fra alle typer vev og celler som inneholder kjerner. Stadiene i DNA-isolering inkluderer: rask lysis av celler, fjerning av fragmenter av cellulære organeller og membraner ved sentrifugering, enzymatisk destruksjon av proteiner og deres ekstraksjon fra løsning ved bruk av fenol og kloroform, konsentrering av DNA-molekyler ved utfelling i etanol.

I genetiske laboratorier isoleres DNA oftest fra blodleukocytter, hvoretter 5–20 ml venøst blod tas fra pasienten og legges i et sterilt reagensrør med en antikoagulerende løsning (heparin). Deretter separeres leukocyttene og behandles i henhold til trinnene ovenfor.

Neste trinn i forberedelsen av materialet for forskning er å "kutte" DNA i fragmenter i områder med en strengt spesifikk basesekvens, som utføres ved hjelp av bakterielle enzymer - restriksjonsendonukleaser (restriksjonsenzymer). Restriksjonsenzymer gjenkjenner spesifikke sekvenser på 4-6, sjeldnere 8-12 nukleotider i et dobbelttrådet DNA-molekyl og deler det inn i fragmenter på plasseringene av disse sekvensene, kalt restriksjonssteder. Antallet resulterende restriksjonsfragmenter av DNA bestemmes av hyppigheten av forekomsten av restriksjonssteder, og størrelsen på fragmentene bestemmes av fordelingen av disse stedene langs lengden av det opprinnelige DNA-molekylet. Jo oftere restriksjonsstedene er plassert, desto kortere blir DNA-fragmentene etter restriksjon. For tiden er mer enn 500 forskjellige typer restriksjonsenzymer av bakteriell opprinnelse kjent, og hvert av disse enzymene gjenkjenner sin egen spesifikke nukleotidsekvens. I fremtiden kan restriksjonssteder brukes som genetiske markører for DNA. DNA-fragmentene dannet som et resultat av restriksjon kan ordnes etter lengde ved elektroforese i en agarose- eller polyakrylamidgel, og dermed kan molekylvekten deres bestemmes. Vanligvis identifiseres DNA i en gel ved spesifikk farging (vanligvis etidiumbromid) og ved å se gelen i transmittert ultrafiolett lys. DNA-lokaliseringsstedene er farget røde. Hos mennesker dannes det imidlertid så mange fragmenter av forskjellige lengder når DNA behandles av flere restriksjonsenzymer at de ikke kan separeres ved elektroforese, dvs. det er ikke mulig å visuelt identifisere individuelle DNA-fragmenter på elektroforesen (jevn farging oppnås langs hele gelens lengde). For å identifisere de ønskede DNA-fragmentene i en slik gel, brukes derfor hybridiseringsmetoden med merkede DNA-prober.

Ethvert enkelttrådet segment av DNA eller RNA er i stand til å binde (hybridisere) med en komplementær tråd, der guanin alltid binder seg til cytosin og adenin til tymin. Slik dannes et dobbelttrådet molekyl. Hvis en enkelttrådet kopi av et klonet gen merkes med en radioaktiv markør, oppnås en probe. Proben er i stand til å finne et komplementært segment av DNA, som deretter enkelt identifiseres ved hjelp av autoradiografi. En radioaktiv probe tilsatt et preparat av strukkede kromosomer gjør det mulig å lokalisere genet på et spesifikt kromosom: ved hjelp av en DNA-probe kan spesifikke områder identifiseres under Southern blotting. Hybridisering skjer hvis DNA-seksjonen som testes inneholder et normalt gen. I tilfeller der en unormal nukleotidsekvens er tilstede, dvs. at de tilsvarende kromosomstrukturene inneholder et mutantgen, vil ikke hybridisering forekomme, noe som gjør det mulig å bestemme lokaliseringen av det patologiske genet.

For å oppnå DNA-prober brukes genkloningsmetoden. Kjernen i metoden er at et DNA-fragment som tilsvarer et gen eller en del av et gen settes inn i en kloningspartikkel, vanligvis et bakterieplasmid (ringformet ekstrakromosomalt DNA som finnes i bakterieceller og bærer antibiotikaresistensgener), og deretter multipliseres bakteriene med plasmidet med det innsatte humane genet. Takket være synteseprosessene i plasmidet kan milliarder av kopier av det humane genet eller dets del oppnås.

De resulterende DNA-kopiene, merket med en radioaktiv markør eller fluorokromer, brukes deretter som sonder for å søke etter komplementære sekvenser blant den studerte mengden DNA-molekyler.

For tiden finnes det mange forskjellige typer metoder som bruker DNA-prober for å diagnostisere genmutasjoner.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]