Molekylære genetiske metoder for diagnostisering av arvelige sykdommer

DNA-teknologiske metoder brukes til å bestemme lokaliseringen i et bestemt kromosom av et mutantgen som er ansvarlig for opprinnelsen til visse former for arvelig patologi. Siden gen er en DNA-segment og genmutasjon - skade på den primære strukturen til DNA (en mutasjon er forstått av alle endringer i DNA-sekvensen, uavhengig av deres plassering og innflytelsen på de enkelte levedyktighet) deretter sonderings preparater av metafase pasient kromosomer arvelig sykdom, mulig å etablere lokalisering av patologisk gen. Metoder for molekylær genetikk skaper muligheter for å diagnostisere sykdommer på nivået av den endrede DNA-strukturen, de tillater å finne ut lokalisering av arvelige forstyrrelser. Molekylære genetiske metoder kan avsløre mutasjoner assosiert med erstatning av enda en enkelt base.

Det viktigste stadiet i identifikasjonen av et gen er dets isolasjon. DNA kan isoleres fra hvilken som helst type vev og celleholdige kjerner. Trinnene med ekstraksjon av DNA inkludere hurtig lysering av cellene ved sentrifugering med fjerning av fragmenter av celleorganeller og membraner, enzymatisk destruksjon av proteinene og deres ekstraksjon fra oppløsningen med fenol og kloroform, DNA-konsentrasjon ved utfelling i etanol.

I genetiske laboratorier isoleres DNA oftest fra blodleukocytter, hvor pasienten tas 5-20 ml venøst blod i et sterilt rør med en antikoagulantløsning (heparin). Leukocytter separeres deretter og behandles i henhold til trinnene som er skissert ovenfor.

Den neste fasen av materiale som forberedelse til studiet - DNA "kutt" i fragmenter på steder med strengt spesifikke basesekvens gjennomføres ved hjelp av bakterielle enzymer - restriksjonsendonukleaser (restriksjonsenzymene). Restriksjonsenzymer gjenkjenne spesifikke sekvenser på 4-6, minst 8-12 nukleotider til dobbelt-trådet DNA-molekyl og dets separeres i fragmenter av disse sekvenser lokalisere områdene kalt restriksjonsseter. Tall produserte restriksjonsfragmenter av DNA bestemmes av frekvensen av forekomsten av restriksjonsseter og fragmenter av størrelse - naturen av fordelingen av disse steder langs lengden av den opprinnelige DNA-molekylet. Jo oftere restriksjonene er plassert, jo kortere DNA-fragmentene etter restriksjon. For tiden er mer enn 500 forskjellige typer restriktjonsenzymer av bakteriell opprinnelse kjent, og hver av disse enzymer gjenkjenner sin spesifikke sekvens av nukleotider. I fremtiden kan restriksjonsseter brukes som genetiske markører for DNA. De resulterende DNA-restriksjonsfragmenter som kan sorteres etter lengden ved elektroforese i agarose eller polyakrylamidgeler, og således kan bestemmes deres molekylvekt. Vanligvis for påvisning av DNA i gelen som brukes av spesifikk farging (vanligvis etidiumbromid) og visning av gelen i transmitterte lyset det ultrafiolette. Steder av DNA lokalisering har en rød farge. Imidlertid endonukleaser en person i behandlingen av flere DNA-restriksjons dannes så mange fragmenter av forskjellige lengder at de ikke klarer å bli separert ved elektroforese, er det ikke mulig å visuelt identifisere de individuelle DNA-fragmenter til electrophoregram (produsert ensartet farging gjennom hele lengden av gelen). Derfor brukes en hybridiseringsmetode med merkede DNA-prober for å identifisere de ønskede DNA-fragmenter i en slik gel.

Ethvert enkeltstrenget segment av DNA eller RNA er i stand til å binde (hybridisere) til sin komplementære kjede, og guanin er alltid forbundet med cytosin, adenin med tymin. Dette er dannelsen av et dobbeltstrenget molekyl. Hvis en enkeltstrenget kopi av det klonede genet er merket med en radioaktiv etikett, vil en probe bli oppnådd. Sonden er i stand til å finne et komplementært segment av DNA, som så lett blir identifisert ved radioautografi. En radioaktiv sonde lagt til et stoff med strakte kromosomer gjør at genet kan lokaliseres på et bestemt kromosom: enkelte DNA-prøver kan identifiseres med en DNA-probe i Southern blotting. Hybridisering oppstår hvis testdelen av DNA inneholder et normalt gen. I tilfelle når det er en unormal sekvens av nukleotider, dvs. De tilsvarende kromosomstrukturer inneholder et mutantgen, vil hybridisering ikke forekomme, noe som gjør det mulig å bestemme lokaliseringen av det patologiske genet.

For å oppnå DNA-prober, anvendes genkloning-metoden. Det vesentlige ved fremgangsmåten består i at DNA-fragmentet som svarer til hvilket som helst gen eller region som er ført inn i klonings partikkel, vanligvis et bakterielt plasmid-gen (sirkulært ekstrakromosomalt DNA tilstede i bakterieceller, og som bærer resistensgener for antibiotika), og deretter bakterier å ha et plasmid med et innebygd humant gen, multipliseres. På grunn av de synteseprosesser er det mulig å oppnå plasmid milliarder av kopier av det humane gen eller del derav.

Videre blir DNA-kopier merket med en radioaktiv etikett eller fluorokrom anvendt som prober for å søke etter komplementære sekvenser blant undersøkelsen av DNA-molekyler som er studert.

For tiden er det mange forskjellige metoder som bruker DNA-prober til diagnose av genmutasjoner.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],