Laboratoriediagnose av tuberkulose

Tuberkulose er en sykdom som er lett å diagnostisere i moderne forhold og vitenskapelige prestasjoner. Laboratoriediagnostisering av tuberkulose er sentral for andre diagnostiske metoder, andre bare for røntgenforskningsmetoder.

[1], [2], [3], [4],

Klinisk blodprøve

Hos pasienter med tuberkulose er endringer i den generelle analysen av blod ikke patognomoniske. Med begrensede og inaktive former for tuberkulose er erytrocyten hypokromisk i normal mengde. Når massive infiltrater eller caseous lungebetennelse, mens forekomsten av caseous lymfadenitt, spesifikke intestinale lesjoner, samt for stor pulmonal eller postoperativ blødning og note erytrocytopeni microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytose, og spesielt poikilotsitoz, møtes mye mindre ofte, vanligvis med alvorlig anemi. Antall retikulocytter ved trinn tuberkulose kompensert varierer fra 0,1 til 0,6%, med subcompensated - 0,6 til 1,0% og 1% er karakterisert ved dekompensert retikulocytter.

Når tuberkulose i noen tilfeller kan det være en moderat leukocytose (opp til 15 tusen av leukocytter.), Mindre stråling, som forekommer i 2-7% av pasienter med begrenset og enkel prosess forekommende former, og i 12,5% - ved destruktiv og progressiv lungetuberkulose .

De hyppigste skiftene forekommer i leukocytformelen. Merk både relativ og absolutt nøytrofili, et moderat skift av leukocytformelen til venstre før promyelocytter. Myelocytter er svært sjeldne i tilfelle av ukomplisert tuberkulose. En økning i antall nøytrofiler med patologisk granularitet i hemogrammet til en pasient med tuberkulose indikerer alltid varigheten av prosessen: hos pasienter med alvorlig tuberkulose inneholder nesten alle nøytrofile patologisk granularitet. Når det tuberkulære utbruddet opphører, nærmer kjernevirksomheten seg relativt raskt. Den patologiske granulariteten til nøytrofiler holder vanligvis lenger enn andre endringer i hemogrammet.

Innholdet av eosinofiler i perifert blod varierer også avhengig av fase i prosessen og organismens allergiske tilstand. Deres antall reduseres til aneozinofiliya i alvorlig og langvarig utbrudd av sykdom og omvendt, øker etterhvert som resorpsjons- infiltrater og pleural effusjon, samt tidlige former av primær tuberkulose.

De fleste former for primær tuberkulose er ledsaget av lymfopeni, noe som iblant observeres i flere år, selv etter at det er blitt gjort spesielle endringer. Sekundær tuberkulose i fasen av eksacerbasjon, avhengig av alvorlighetsgraden av prosessen, kan være ledsaget av enten et normalt antall lymfocytter eller lymfopeni.

Det opptar et spesielt sted bestemmelse senknings Ytterligere tester for å evaluere tuberkuløs prosess (ESR) som har en verdi på å evaluere strømnings tuberkulose prosessen og identifisere dets aktive former. Økning i ESR indikerer tilstedeværelsen av den patologiske prosess (smittsom-inflammatorisk, purulent septisk, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Og er en indikasjon på dens alvorlighetsgrad, men normale nivåer ESR ikke alltid indikere fravær av patologi. Accelerasjon av erytrocytsedimentering blir lettere ved en økning i innholdet av globuliner, fibrinogen, kolesterol i blodet og en reduksjon i viskositeten i blodet. Nedbremsing av erytrocytsedimentering er karakteristisk for tilstander ledsaget av hemokoncentrasjon, en økning i innholdet av albuminer og gallsyrer.

Hemogrammet hos pasienter med tuberkulose endres under behandlingen. Hematologiske skift forsvinner jo raskere, desto mer vellykket den terapeutiske intervensjonen. Imidlertid bør man huske effekten på hemopoiesis av ulike antibakterielle stoffer. De forårsaker ofte eosinofili, i noen tilfeller - leukocytose, og oftere leukopeni opp til agranulocytose og lymfoid-retikulær reaksjon. Systematisk hematologisk kontroll og korrekt analyse av de oppnådde dataene er avgjørende for å vurdere pasientens kliniske tilstand, dynamikken i prosessen og effektiviteten av behandlingen som brukes.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinisk analyse av urin

Med tuberkulose i urinsystemet er urinalyse den viktigste laboratoriediagnostiske metoden. Du kan observere leukocyturi, erytrocyturi, proteinuri, hypoisostenuri, tuberkulose mykobakterium, ikke-spesifikk bakteriuri.

Leukocyturi - det vanligste symptom av tuberkulose i urinveiene før kjemoterapi, og det er ingen spesifikk bare i unntakstilfeller, slik som fullstendig utslettelse av lumen av ureter. Nechyporenko test (bestemmelse av antall leukocytter i 1 ml urin) bidrar til mer objektivt vurdere graden leukocytturi nefrotuberkuloze med, og i noen tilfeller for å identifisere det ved normal urinanalyse. Det må imidlertid tas i betraktning at leukocyturi kan oppstå i akutt og kronisk pyelonefrit, cystitis, uretritt, nyre og ureter steiner.

Eritrotsiturii. Så vel som leukocyturi. Regnes som et av de hyppigste laboratorie tegnene på tuberkulose i genitourinary systemet. Hyppigheten av hematuri avhenger av utbredelsen av prosessen, den øker ettersom den destruktive tuberkulose-prosessen utvikler seg i nyre. Erytrocyturia uten leukocyturi er mer typisk for tidlige stadier av nyre tuberkulose. Hematuri, som dominerer over leukocyturi, er et viktig argument til fordel for nyre tuberkulose i sin differensiering med ikke-spesifikk pyelonefrit.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokjemisk blodprøve

Med tuberkulose avhenger endringer i enkelte biokjemiske parametere hovedsakelig av fase i prosessen, komplikasjoner og ulike sammenhengende sykdommer. Hos pasienter med inaktiv tuberkulose i lungene og andre organer, er de totale protein- og proteinfraksjonene av blodserum uendret og bestemmer deres normale innhold.

I akutte former av sykdommen, samt med forverring og progressjon av kroniske former for tuberkulose, reduseres albumin-globulinkoeffisienten.

Viktig i vurderingen av den funksjonelle tilstand av organisk skade og lever i tuberkulose og dens komplikasjoner er bestemmelse av serum-total og direkte bilirubin, og AST (ACT), alaninaminotransferase (ALT). Dynamisk bestemmelse av nivået av aminotransferaser. Bilirubin ved behandling av tuberkulosepasienter, spesielt i alvorlige former, er en obligatorisk komponent i en biokjemisk undersøkelse av tuberkulosepasienter og utføres månedlig.

Vurdering av nyres funksjonelle tilstand inkluderer bestemmelse av serumkreatinin og beregning av glomerulær filtreringshastighet i henhold til Cockcroft-Gault-formelen. Beregning av glomerulær filtreringshastighet ved bruk av Rebergs prøve gir mindre nøyaktige resultater.

Hovedmålet med dynamiske biokjemiske studier av tuberkulosepasienter er å overvåke løpet av prosessen, rettidig deteksjon av bivirkninger av legemidler og tilstrekkelig korreksjon av de oppstått hemostatiske lidelsene.

[17], [18], [19]

Anvendelse av biokjemiske undersøkelsesmetoder i ekstrapulmonell tuberkulose

Den mest informative indikatoren er innholdet av tuberkulostearinsyre i biologiske væsker, men definisjonen er knyttet til tekniske vanskeligheter (behovet for gasskromatografi og massespektrometri).

Prospektiv måling av aktiviteten av adenosin deaminase - et enzym, bestemt i væsker: synovial, perikardial, ascitisk eller spinal. De viktigste produsentene av adenosin deaminase er lymfocytter og monocytter. Bestemmelse av aktiviteten av adenosin deaminase i biologiske væsker letter diagnosen tuberkulose synovitt, tuberkulose av lymfeknuter, tuberkulose meningitt, tuberkulose serositis.

Noen biokjemiske indikatorer på grunn av deres ikke-spesifisitet bestemmes bare i biologiske væsker, nær lesjonens fokus. Mål nivået av indikatorer som respons på subkutan eller intradermal injeksjon av tuberkulin (vanligvis før og 48 og 72 timer etter det). Etter dette beregnes graden av stigning av markørnivået (i%) i forhold til startnivået.

Optimal bestemmelse i urinen av aktiviteten til et organspesifikt enzym av transamnidase, hvis utseende er kjent i nederlaget av nyrer av forskjellig art. Studien av transamidinase er begrunnet bare under betingelser for subkutan injeksjon av tuberkulin for å forverre den lokale inflammatoriske prosessen. Bestem transamidinaktiviteten i urinen i utgangspunktet og 24-72 timer etter introduksjonen av 50 TE tuberkulin. Utvidelsen av fermentia i 2 ganger og mer tillater i 82% av tilfellene å differensiere aktiv tuberkulose av nyrene fra forverring av kronisk pyelonefrit.

Med tuberkulose av kvinnelige kjønnsorganer, er konsentrasjoner av haptoglobin og malonisk dialdehyd i blodet bestemt under betingelser for en provokerende tuberkulinprøve. Subkutant injisert tuberkulin i en dose på 50 TE og 72 timer senere utført en andre biokjemisk studie. I tilfelle tuberkulose etiologi er graden av økning i nivået av haptoglobin ikke mindre enn 28%, og nivået av malondialdehyd er 39% eller mer. Bestemmelsen av aktiviteten av adenosin-deaminase i en peritoneal væske oppnådd fra Douglas-rommet benyttes også. Punktatet blir undersøkt 72 timer etter intradermal injeksjon av tuberkulin ved doser på 0,1 TE og 0,01 TE i projeksjonen av de indre kjønnsorganene på den fremre bukvegg. Til fordel for tuberkuloseprosessen er en økning i aktiviteten av adenosin deaminase 10% eller mer i sammenligning med den første.

Når øyet påvirkes, undersøkes fokalreaksjonen som oppstår i øyet som svar på antigenstimulering. Det er uønsket å utvikle et uttalt svar, ledsaget av en reduksjon i visuelle funksjoner. Siden vurderingen av minimal fokalreaksjoner ofte er vanskelig, er det for objektiveringen av konklusjonen å orientere parallelt og på vekstgraden i blodserumet av haptoglobin eller adenosin deaminase.

Alle biokjemiske studier skal utføres i forbindelse med andre metoder.

[20], [21], [22], [23],

Blodkoaguleringssystemforskning

Relevansen av den forskning status av blodkoagulasjonssystemet av tuberkulose er forårsaket av tilstedeværelsen av et antall pasienter med lungetuberkulose opphostninger eller lungeblødning, samt hemocoagulation komplikasjoner i kirurgisk behandling av tuberkulose. I tillegg påvirker den latente strømmen av intravaskulær hemokoagulasjon som naturlig følger tuberkulose sykdomsforløpet og effekten av kjemoterapi.

Hos pasienter med lungetuberkulose utbredelsen av eksudativ betennelse komponent av den observerte nedgang i blod antikoagulerende aktivitet. Hos pasienter med en lav forekomst av en bestemt lesjon i lungene med en overvekt av produktiv hemocoagulation intravaskulær inflammatorisk komponent uttrykkes svakt. Hos pasienter med lungetuberkulose med hemoptysis og pulmonal blødning tilstand blodkoagulasjonssystemet er forskjellig: i pasienter med lav blodtap på høyden gemoptoe eller straks etter dens avslutning er det en skarp økning i blodkoagulasjonen evne på grunn av alvorlig intensivering av trombinoobrazovaniya samtidig økt "strukturell" clotting. Hos pasienter med massivt blodtap observeres en reduksjon i koagulasjonspotensialet på grunn av en reduksjon av konsentrasjonen av fibrinogen. Faktor XIII aktivitet, trombocyttall. På scenen av kirurgisk behandling opplever pasienter med begrensede former for tuberkulose ikke milde signifikante forstyrrelser med homeostasesystemet. Pasienter med utbredt prosess i gjennomføringen av pnevmon- eller plevropnevmonektomii ofte utvikler DIC, som kan ta form av "andre sykdom."

For å overvåke tilstanden av blodkoagulasjon i pasienter med lungetuberkulose bør utføres bestemmelse av den aktiverte partielle tromboplastintid (aPTT), fibrinogen, trombin, protrombintid indeks og blødningstiden og koaguleringstid.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonal forskning

Moderne eksperimentelle og kliniske observasjoner indikerer tilstedeværelsen av endringer i hormonstatusen i en spesifikk tuberkuløs lungebetennelse. Det er bevist at korrigeringen av dysfunksjon av hypofyse-binyre, hypofyse-thyroid-systemer og pankreatisk funksjon i forbindelse med anti-TB terapi bidra til aktivering av fibrogenese og reparasjon på et locus spesifikk inflammasjon.

Den funksjonelle tilstanden til hypofyse-thyroid system er dømt av innholdet i blodserumet av trijodtyronin (T ₃ ), tyroksin (T ₄ ), hypofyse thyroid-stimulerende hormon (TSH). Det ble funnet at subklinisk hypothyroidisme er oppdaget i 38-45% av pasienter med lungetuberkulose, og som oftest det er diagnostisert med disseminert og fibro-kavernøse former prosess. Under disse samme former mest dramatisk reduserte nivåer av både T- ₃ og T- ₄, og der kommer en ubalanse av disse hormonene i form av økning av forholdet for T ₄ / T _s.

Adrenokortikal funksjon beregnes ved nivået av kortisol i blodserum, og endokrin funksjon av bukspyttkjertelen - konsentrasjon av den immunreaktive insulin. I den akutte fasen av smittsomme sykdommer øker behovet for endogen kortisol og insulin. Hyperinsulinemi vitner også mot insulinresistensen av kroppsvev, noe som er typisk for enhver aktiv inflammatorisk prosess, spesielt spesifikk. Bestemmelse av glukokortikoidfunksjonen av binyrene med aktiv lungetuberkulose gjør det mulig å avdekke forekomsten av hyperkortisme hos de fleste pasienter. Normale nivåer av kortisol blodkonsentrasjon hos pasienten med infeksiøs betennelse i den akutte perioden bør betraktes som relativt svikt av glukokortikoid funksjon av binyrebarken som kan tjene som et grunnlag for å holde doser adekvate erstatningsterapi av glukokortikoider.

Nesten en tredjedel av pasientene med pulmonell tuberkulose kan konstatere at nivået av insulinemi i dem er ganske lavt og nærmer seg den nedre grensen til normen, mens 13-20% observerer signifikant hyperinsulinisme. Både relativ hypo- og hyperinsulinisme er høyrisikofaktorer for utvikling av brudd på karbohydratmetabolismen i varierende grad. Disse endringene i den funksjonelle aktiviteten til b-celler i bukspyttkjertelen krever regelmessig overvåking av glykemi hos pasienter med tuberkulose og rettidig forebygging av diabetes mellitus. I tillegg. Dette tjener som en ytterligere begrunnelse for hensikten med å bruke fysiologiske doser insulin i komplisert terapi av tuberkulose.

Generelt kan lavere nivåer av thyroidhormoner og deres ubalanse hyper-kortisolemi og hyperinsulinisme størst avstand i pasienter med alvorlig forløp av tuberkulose prosess, med omfattende lungeskader og alvorlige symptomer på tuberkulose rus.

Mikrobiologisk diagnose av tuberkulose

Mikrobiologiske studier er nødvendige for å identifisere pasienter med tuberkulose, verifisere diagnosen, overvåke og korrigere kjemoterapi, evaluere behandlingsresultater, med andre ord fra det øyeblikket pasienten er registrert med tuberkulose før den tas av.

Alle epidemiologiske programmer og prosjekter er basert på en vurdering av antall bakterielle ekskretorer, som ikke kan gjøres uten å bruke laboratoriemetoder for å oppdage mycobakterier tuberkulose. I en undersøkelse av den såkalte uorganiserte befolkningen når andelen bakterielle inntrengere 70 eller mer, noe som gjør laboratoriemetoder til et tilstrekkelig effektivt middel for å identifisere tuberkulosepasienter blant denne befolkningsgruppen.

Tradisjonelle mikrobiologiske metoder for diagnostisering av tuberkulose er bakterioskopiske og kulturelle studier. Moderne metoder vurderer dyrking av mycobacterium tuberkulose i automatiserte systemer, innstillingen av PCR. Imidlertid kombinerer alle disse metodene nødvendigvis med klassiske bakteriologiske metoder.

Innsamling av diagnostisk materiale

Effekten av laboratoriestudier avhenger i stor grad av kvaliteten på det diagnostiske materialet. Overholdelse av reglene for innsamling, lagring og transport av diagnostisk materiale og den nøyaktige gjennomføringen av pasientanalysalgoritmen påvirker direkte utfallet og sikrer biologisk sikkerhet.

For testing på tuberkulose brukes en rekke materialer. På grunn av det faktum at TB logkih- mest vanlige form tuberkuløse lesjoner, den grunnleggende materiale for forskning vurdere sputum og andre typer løsbare trakeobronkiale: øvre luftveis sekret som oppnås etter aerosolinhalator: bronkiale vaskevæsker; bronchoalveolar skyller; materiale oppnådd ved bronkoskopi, og intrapulmonær transtrakeal biopsier fra bronkial-aspirater, laryngeal vattpinner, eksudater fra sår og utstryk al.

Effektiviteten av forskningen øker dersom en kontrollert samling av materiale fra en pasient utføres. Til dette formålet er et spesielt utstyrt rom tildelt eller spesielle drosjer er kjøpt. Samlingen av materiale er en farlig prosedyre, derfor er det nødvendig å samle materiale for forskning, i henhold til regler for smittsom sikkerhet.

Materialet for testing på mycobacterium tuberculosis samles i sterile flasker med tett skruede caps for å forhindre forurensing av miljøet og beskytte det oppsamlede materialet mot forurensning.

Beholdere for innsamling av diagnostisk materiale må oppfylle følgende krav:

• må være laget av slagfast materiale;
• bør smelte lett under autoklavering;
• være tilstrekkelig volum (40-50 ml):
• ha en bred åpning for sputuminnsamling (diameter ikke mindre enn 30 mm);
• være lett å håndtere, gjennomsiktig eller gjennomskinnelig, slik at du kan vurdere mengden og kvaliteten på prøven samlet uten å åpne lokket.

For å oppnå optimale forskningsresultater, må følgende forhold følges:

• Samle materialet før starten av kjemoterapi;
• Materialet til studien må samles inn før morgeninntaket av mat og medisin;
• For forskning er det ønskelig å samle minst 3 prøver av morgenslem. Samle sputum i 3 påfølgende dager;
• Det samlede materialet skal leveres til laboratoriet så snart som mulig:
• I tilfelle der det umiddelbart er umulig å levere materialet til laboratoriet, oppbevares det i kjøleskapet ved en lufttemperatur på 4 ° C i ikke mer enn 48 timer;
• Ved transport av materialet er det nødvendig å nøye overvåke hetteglassets integritet.

Korrekt oppsamlet sputum er slim eller mucopurulent. Det optimale volumet av testet sputum er 3-5 ml.

Sputum er samlet under tilsyn av en medisinsk faglig. Personer med ansvar for sputuminnsamling bør følge implementeringen av visse regler:

• det er nødvendig å forklare pasientens formål med studien og behovet for å hoste opp ikke spytt eller nasopharyngeal slim, men innholdet i dyp luftveiene. Dette kan oppnås som et resultat av en produktiv hoste som oppstår etter flere (2-3) dype åndedrag. Det er også nødvendig å advare pasienten om at han skal skylle munnen med kokt vann for å fjerne hoveddelen av mikrofloraen som vokser i munnhulen og matrester som hindrer undersøkelsen av sputum;
• en medisinsk arbeidstaker som deltar i sputuminnsamling, i tillegg til en badekåpe og en lue, må ha på seg en maske, gummihansker og et gummiforkle;
• står bak pasienten, anbefales han å holde flasken så nært som mulig på leppene og umiddelbart skille seg inn i slem som det hoster, og det må sikres at luftstrømmen er rettet bort fra helsearbeideren:
• Etter at sputuminnsamlingen er fullført, bør helsearbeideren nøye lukke hetteglasset med et lokk og vurdere mengden og kvaliteten på sputum som samles inn. Deretter merkes flasken og plasseres i en spesiell bix for transport til laboratoriet.

Hvis pasienten ikke produserer slim, kvelden før og tidlig på morgenen på dagen for innsamling av materiale som er nødvendig for å gi ham en slimløsende :. Et utdrag av røttene til marshmallow (mukaltin), bromheksin, ambroksol, etc. - eller bruke en irriterende innånding bruke utstyr installert i rommet for å samle oppspytt. Materialet som samles på denne måten, er ikke gjenstand for bevaring og bør undersøkes på dagen for innsamling. For å unngå "culling" i laboratoriet i retningen skal du lage et spesielt merke.

Dersom mikrobiologiske undersøkelser ikke utføres på dette anlegget, skal det samlede diagnostiske materialet leveres sentralt til laboratoriet, forutsatt at materialet blir bevart i intervaller mellom leveranser i kjøleskapet eller ved bruk av konserveringsmidler. Lever materiale til laboratoriet i transportkasser, som lett kan desinfiseres. Hver prøve skal forsynes med riktig etikett, og hele partiet skal fylles med en medfølgende formular.

[29], [30], [31],

Modeller og hyppighet av undersøkelse av pasienter

Ved den første, såkalte diagnostiske undersøkelsen av pasienten for tuberkulose, er det nødvendig å undersøke minst 3 sputumpartier i 2 eller 3 dager. Samlet under tilsyn av medisinsk personell, noe som øker effektiviteten av mikroskopi.

Den primære screening for tuberkulose bør utføres av alle medisinske diagnostiske institusjoner i helsevesenet. Nylig har de såkalte mikroskopi-sentrene, utstyrt med moderne mikroskop og utstyr for epidemisikkerhet, blitt organisert på grunnlag av kliniske diagnostiske laboratorier for å forbedre effektiviteten til den første undersøkelsen.

I anti-TB-anlegg brukes en screeningstest som inkluderer sputumundersøkelse eller annet diagnostisk materiale i minst 3 ganger i 3 dager. Under behandlingen utføres mikrobiologiske studier regelmessig minst en gang i måneden under intensiv kjemoterapifase. Ved overgangen til behandlingsfasen utføres studier mindre ofte - med et intervall på 2-3 måneder, mens studienes frekvens reduseres til to.

Funksjoner i samlingen av diagnostisk materiale for ekstrapulmonell tuberkulose

Har patologisk materiale med ekstrapulmonare former på tuberkulose - Mycobacterium tuberculosis lav konsentrasjon på det, noe som krever en mer følsomme metoder for mikrobiologiske undersøkelser, primært for såing teknikker medium.

Med tuberkulose i genitourinary systemet er urin det mest tilgjengelige studiematerialet. Urin samling bør gjøres av en spesialutdannet sykepleier.

De ytre kjønnsorganene vaskes med vann med såpe eller en svak løsning av kaliumpermanganat. Den eksterne åpningen av urinrøret behandles nøye. I et sterilt hetteglass samles en gjennomsnittlig del av morgenurinen: hos menn, naturlig, hos kvinner, ved hjelp av et kateter. Urin fra nyrebjelken samles i sterile rør med kateterisering av en eller to nyrer, i sistnevnte tilfelle - nødvendigvis separat fra hver nyre. En liten mengde av denne urinen blir sentrifugert, sedimentet undersøkes.

Hos menn, sperm, punctate testikler, blir hemmeligheten av prostata underkastet sentrifugering for å oppnå et bunnfall. Med lokalisering av en bestemt prosess i kjønnsområdet hos menn, kan prostata-massasje fremme sekresjonen av sekresjoner som inneholder mycobacterium tuberkulose.

Menstrualblod hos kvinner samles inn ved å suge eller bruke en Kafka cap. Det oppnådde materialet frigjøres fra røde blodlegemer, vasker det med destillert vann etterfulgt av sentrifugering. Bunnfallet undersøkes.

Tildelinger fra livmorhalsens livmoderhalsekanal samles i noen Kafka kapasitet eller cap, det vil si at det er ønskelig å akkumulere 1-2 ml patologisk materiale.

Materiell hentet fra operative inngrep på nyrene, kjønnsorganer. Med biopsier, skrapinger fra endometrium, homogenisere. For å gjøre dette, er den plassert i en steril mørtel og grundig knust med steril saks. Til denne slurryen ble det tilsatt steril elvesand i en mengde lik dets vekt, og deretter toppet med 0,5-1.0 ml isoton natriumkloridoppløsning, og alt ble gnidd inntil en deigaktig masse med tilsetning av isoton natriumkloridløsning (4-5 ml). Da får massen avgjøre i 1-1,5 minutter, supernatanten undersøkes.

Tuberkulose av bein og ledd. Punktet (pus av abscesser) oppnådd med en steril sprøyte, plasseres i sterile retter og leveres umiddelbart til laboratoriet. Steril pipette, tidligere fuktet med steril isotonisk natriumkloridløsning, ta 2-5 ml pus, overfør den til en flaske perler og tilsett ytterligere 2-3 ml isotonisk natriumkloridløsning. Flasken er lukket med en kork og ristet i et jokerapparat i 8-10 minutter. Den homogeniserte suspensjonen undersøkes.

I fistulære former for osteoartikulær tuberkulose blir pus fra fistelen tatt. Den store utladningen samles direkte inn i et reagensrør. I tilfeller lean pyoré fistula vasket med steril isoton natriumkloridoppløsning, og vaskevæskene ble samlet opp i et prøverør, eller den del av tampong impregnert med puss sendt til analyse.

Kirurgisk materiale oppnådd ved kirurgi på knokler og ledd kan bestå av purulent-nekrotisk masser, granuleringer, arr, benvev synovialmembranene og andre substrater. Sin behandling utføres, som i tuberkulose av nyrene.

Mikrobiologisk undersøkelse av synovialvæske i 3% natriumsitratoppløsning (1: 1 forhold) for å forhindre koagulasjon utføres umiddelbart etter punkteringen.

Tuberkulose av lymfeknuter. Pus, ekstrahert under punktering av lymfeknuter, undersøkes også. Som pus av abscessene. Vevene til lymfeknuter oppnådd under kirurgiske inngrep, biopsier, undersøkes, som med andre former for tuberkulose.

Studien av avføring masser på mycobacterium tuberculosis er ekstremt sjelden, på grunn av nesten total mangel på positive resultater.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium mikroskopi

Sputummikroskopi er en relativt rask, enkel og billig metode som bør brukes i alle tilfeller med mistanke om tuberkulose. I tillegg utføres denne studien for å evaluere effektiviteten av kjemoterapi og for å fastslå gjenoppretting eller manglende behandling hvis det ikke foreligger en kulturtest.

To metoder for mikroskopisk undersøkelse brukes:

• metode for direkte mikroskopi, når et smear prepareres direkte fra det diagnostiske materialet;
• Metode for mikroskopi av et sediment fremstilt fra dekontaminantbehandlet materiale for kultur.

Den første metoden brukes i laboratorier hvor det kun utføres mikroskopiske studier (kliniske og diagnostiske laboratorier i det generelle medisinske nettverket).

De beste resultatene av mikroskopisk undersøkelse oppnås ved å konsentrere det diagnostiske materialet (for eksempel ved sentrifugering).

For å oppdage mycobacterium tuberculosis med en sannsynlighet på 50% når mikroskopien utføres, skal 1 ml sputum inneholde mer enn 5000 mikrobielle celler. Sputumet til pasienter med lungeformer av tuberkulose inneholder vanligvis en betydelig mengde syrefaste bakterier, noe som gjør at de kan påvises pålitelig ved bakterioskopi. Den diagnostiske følsomheten til denne metoden kan forbedres ved å undersøke flere prøver av sputum fra en pasient. Et negativt resultat av en bakterioskopisk undersøkelse utelukker ikke diagnosen tuberkulose, da sputum hos enkelte pasienter inneholder mindre mykobakterier enn det som kan påvises ved mikroskopi. Dårlig forberedelse av sputum smøring kan også forårsake negativt resultat av bakterioskopisk undersøkelse.

Den vanligste metoden for påvisning av syrefaste mykobakterier i smeten er farge i henhold til Tsiol-Nelsen. Metoden er basert på penetrasjon av carbolic fuchsin i en mikrobiell celle gjennom en membran som inkluderer et voksholdig lipidlag, samtidig som det oppvarmes og sterkt etseringsvirkning av fenol. Etterfølgende misfarging av smøret med en 25% oppløsning av svovelsyre eller 3% saltsyre fører til misfarging av alle ikke-syrefaste strukturer. De misfargede elementene i smøret er farget med en 0,3% oppløsning av metylenblå. Mykobakterier oppfatter ikke de vanlige anilinfarvestoffene, noe som resulterer i at syrefaste mykobakterier er farget i røde, røde og andre mikrober og cellulære elementer - i blått.

For utstrykninger farget med Ziehl-Nelsenu bruke lys binokulært mikroskop med olje nedsenking linse (90- eller 100-gangers økning) og okularet til 7- eller 10-gangers forstørrelse. Utforsk 100 synsfelt, som er nok til å identifisere enkle mykobakterier i smøret. I tilfelle at resultatet av en slik undersøkelse er negativ, anbefales det å vise ytterligere 200 synsfelt for bekreftelse. Ta opp resultatene, og angi antall oppdagede syrefaste baciller (KUM).

I tillegg til denne teknikken brukes fargefluorokromer til luminescerende mikroskopi, noe som gjør det mulig å oppnå de beste resultatene. Bruken av denne metoden øker effektiviteten av mikroskopien med 10-15%. Ved behandling av mykobakterier med luminescerende fargestoffer (auramin, rhodamin, etc.), binder disse stoffene også til de vokslignende strukturer i mikrobialcellen. Ved bestråling av fargede celler med en spennende lyskilde (et visst spektrum av ultrafiolett stråling), begynner de å lyse med oransje eller lyse rødt lys på svart eller mørkegrønn bakgrunn. På grunn av den høye lysstyrken og kontrasten til det synlige bildet, kan den generelle forstørrelsen av mikroskopet reduseres 4-10 ganger, synsfeltet utvides og tidspunktet for visning av stoffet avtar. Sammen med dette, på grunn av den mye større dybdeskarpheten, kan du øke studienes komfort.

Når fluorescensmikroskopi brukes til å vise det samme området, utbreder smøret betydelig mindre tid enn med lysmikroskopi av Tsiol-Nelsen-fargingen. Hvis en arbeidsdag undersøker et mikroskop om 20-25 slike smører, så ved hjelp av fluorescensmikroskopi, kan han undersøke mer enn 60-80 prøver på samme tid. Erfarne mikroskopere vet at fargen på celler med en blanding av auramin og rhodamin er på en eller annen måte spesifikk for syrefaste baciller, som i dette tilfellet ligner gullpinner. Saprofytter er malt i grønn farge.

En annen viktig fordel ved fremgangsmåten ifølge fluorescerende mikros - evnen til å oppdage endrede mycobacterium, mistet under påvirkning av negative faktorer, inkludert intensiv kjemoterapi, kislotousotoychivosti eiendom og detekteres ikke i forbindelse med denne farging Ziehl-Nelsenu.

Ulempene med metoden for fluorescensmikroskopi inkluderer den relativt høye kostnad for mikroskopet og dens drift. I sentraliserte eller andre store laboratorier, hvor lasten overskrider normen til 3 laboratorie teknikere som arbeider med tre konvensjonelle mikroskoper, er det imidlertid billigere å bruke ett fluorescerende mikroskop istedet.

Bakterioskopiske metoder har ganske høy spesifisitet (89-100%). Om lag 97% av de positive resultatene som er oppnådd ved en hvilken som helst metode for mikroskopi, bekreftes utvetydig av resultatene av såingen.

Det skal bemerkes at ved mikroskopisk undersøkelse av smet av patologisk materiale er det umulig å bestemme arten som tilhører de identifiserte syrefaste mykobakteriene. Mikros metode gjør det mulig å gi en mening bare på nærvær eller fravær av syre ved fremstilling av mikroorganismer, noe som kan forklares ved at det foreligger i naturen av et stort antall av morfologisk like tuberkuløse mykobakterier komplekse nontubercular syreresistente mikroorganismer.

Resultatene av mikroskopi er evaluert i semiquantitative enheter.

For å kunne sammenligne resultatene fra forskjellige metoder for mikroskopi, innføres empiriske koeffisienter. For eksempel, for å sammenlikne resultatene fra utstrykninger farget med fluorescerende fargestoffer, data forskning lysmikroskop (1000 ganger forstørrelse), er det nødvendig å dele antall syrefaste staver detekteres ved fluorescens mikroskop, den tilsvarende koeffisient ved 250 gangers forstørrelse - til 10, 450 ganger - til 4, med 630 ganger - til 2.

Egenskaper av mikroskopi for ekstrapulmonal tuberkulose

Direkte mikroskopi utføres, samt mikroskopi av smører fremstilt etter anrikning, etterfulgt av Tsiol-Nelsen-farging eller luminescerende fargestoffer. Direkte mikroskopi av smører er ineffektiv på grunn av lav konsentrasjon av mykobakterier i materialet, og derfor er det mer rasjonelt å bruke anrikningsmetoder. Den mest effektive er sentrifugering. Hvis det biologiske materialet er viskøst, anvendes sentrifugering med samtidig homogenisering og flytendegjøring av materialet, som utføres ved bruk av høyhastighets sentrifuger med en sentrifugeringskraft på 3000 g og hypoklorittløsninger. Andre anrikningsmetoder, som mikroflotasjon, brukes for tiden ikke på grunn av dannelsen av biologisk farlige aerosoler.

[37], [38],

Den kulturelle metoden for diagnose av tuberkulose

Metoden for såing, eller kulturmetoden, er mer følsom enn smørmikroskopi, og har en rekke fordeler i forhold til sistnevnte. Det gjør det mulig å oppdage flere dusinvis av levedyktige mykobakterier i testmaterialet og har god diagnostisk verdi. Dette er spesielt viktig når man undersøker et materiale fra nylig diagnostiserte eller behandlede pasienter som frigjør en liten mengde mykobakterier.

Sammenlignet med mikroskopi, gjør kulturforskning det mulig å øke antall TB-pasienter som er diagnostisert med mer enn 15-25%, samt å verifisere tuberkulose i tidligere stadier, når sykdommen fortsatt er mottagelig for behandling. En svært viktig fordel ved kulturtesten er muligheten til å oppnå en exciterkultur som kan identifiseres og studeres med hensyn til stoffets følsomhet, virulens og andre biologiske egenskaper.

Ulempene med dyrkningsmetoder inkluderer deres varighet (ventetiden for materialer når 10 uker). Høyere kostnad, kompleksitet av behandling av diagnostisk materiale.

Prinsipper for presowing behandling av diagnostisk materiale

Konvensjonelle mikrobiologiske metoder kan ikke brukes til å utføre studier på tuberkulose. Dette skyldes det faktum. At mycobacterium tuberculosis vokser veldig sakte, og de fleste kliniske prøver inneholder raskt voksende pyogene og putrefaktive mikroorganismer, sopp. Deres raske vekst på rike næringsmedia forstyrrer utviklingen av mykobakterier og tillater ikke isolering av tuberkulose forårsakende middel, så det diagnostiske materialet må forbehandles før sådd. I tillegg er mykobakterier utgitt fra pasientens luftveier vanligvis omgitt av en stor del av mucus, noe som gjør dem vanskelig å konsentrere seg. I denne forbindelse, før planting av sputum og andre lignende materialer, er deres flytende, dekontaminering nødvendig.

Alle vaskemidler og dekontaminer har en mer eller mindre uttalt toksisk effekt på mykobakterier. Som et resultat av behandling kan opptil 90% mykobakterier dø. For å holde nok av det mycobakterielle befolkning, sparsom behovet for å benytte prosesseringsteknikker som tillater, på den ene side, for å undertrykke de raskt voksende pyogenic bakterier og råtten, og på den andre - til å opprettholde levedyktigheten av mykobakterier som er tilstede i materialet.

Avhengig av materialet, dets grad av homogenitet og forurensning for pre-prosessering ved hjelp av ulike dekontaminant: oppspytt - 4% natronlut, oppløsninger trohzameschonnogo natriumfosfat 10%, benzalkoniumklorid, trinatriumfosfat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein natriumhydroksyd) ved en sluttkonsentrasjon på 1% NaOH, i urin og andre flytende materialer - svovelsyreoppløsning 3%, for de forurensede prøver, fettholdige materialer - oppløsning av oksalsyre til 5%. I tillegg brukes i noen tilfeller enzymer, overflateaktive midler (vaskemidler). Bruken av Tween og noen andre vaskemidler er ledsaget av en mindre død av mycobakterielle celler (40-50% overlever). Imidlertid kan de bare brukes til flytende materialer. Den største fordeling i verden var NALC-NaOH. Produsert i sett. Denne metoden tillater å tildele mer enn 85% av befolkningen av mykobakterielle celler. Dekontaminering tkanesoderzhaschih faste stoffer vanskelig å gjette seg fordi graden av spredning av materialet i løpet av homogeniseringen vanskelig. For eksempel er behandling av biopsier av lymfeknuter ofte ledsaget av økt forurensningsfrekvens ved ekstern flora. I dette tilfellet kan 1% etonium brukes.

Ikke-homogen materiale homogeniseres med glassperler i nærvær av dekontaminanter. Væskematerialene blir pre-sentrifugert og bare et bunnfall behandles.

Såings- og inkubasjonsteknikker

Etter forbehandling blir materialet sentrifugert og derved mykobakteriene utfelt og økt innhold i sedimentet ("slamberikning"). Det resulterende bunnfallet nøytraliseres og inokuleres (inokuleres) med tette næringsmedier eller rør med flytende (halvflytende) medium. Fra resten av sedimentet er smears forberedt på mikroskopisk undersøkelse. Såingsteknikken bør forhindre kryskontaminering av det diagnostiske materialet.

For en pålitelig klinisk tolkning av resultatene av en mikrobiologisk studie, må følgende regel overholdes: Mikroskopiske og kulturstudier må utføres parallelt fra samme prøve av diagnostisk materiale.

De inokulerte rørene plasseres i en termostat ved 37 ^° C i 2 dager i en horisontal posisjon. Dette sikrer en jevnere opptak av materialet i kulturmediet. Etter 2 dager overføres rørene i vertikal stilling og hermetisk forseglet med gummi- eller silikonplugger for å forhindre tørking av det såkalte mediet.

Avlinger inkuberes ved 37 ^om C i 10-12 uker med regelmessig ukentlig visning. For hver forhåndsvisning registreres følgende parametere:

• perioden visuelt observert fra dagen for såing vekst;
• vekstraten (antall CFUer);
• forurensning av avlingen med en ekstern mikrobiell flora eller sopp (slike rør fjernes);
• mangel på synlig vekst. Rørene er igjen i termostaten til neste visning.

Næringsmedium

Ulike næringsmedier brukes til dyrking av mykobakterier; tett, halvflytende, flytende. Imidlertid har ingen av de kjente næringsmediene egenskaper som sikrer veksten av alle mycobakterielle celler. I forbindelse med dette anbefales 2-3 næringsmedia med forskjellig sammensetning å brukes samtidig for å øke effektiviteten.

WHO anbefaler Levenstein-Jensen-miljøet som standardmedium for primær isolering av det forårsakende middelet for tuberkulose og for å bestemme dets narkotikafølsomhet. Dette er et tett eggmiljø som veksten av mykobakterier oppnås på den 20.-25. Dag etter sådd av et bakterioskopisk positivt materiale. Avlinger av bakterioskopisk negativt materiale krever en lengre inkubasjonsperiode (opptil 10-12 uker).

I vårt land, foreslåtte E.R. Finn egg miljø Finn-II. Det adskiller seg i at i stedet for L-asparagin bruker det natriumglutamat, som utløser andre måter å syntetisere aminosyrene av mykobakterier. Veksten fremkommer på dette mediet noe tidligere, og frekvensen av tildeling av mykobakterier er 6-8% høyere enn i Lowenstein-Jensen-mediet.

For å forbedre effektiviteten av bakteriologisk diagnose av ekstrapulmonell tuberkulose, er det tilrådelig å inkludere modifisert Finn-II media i komplekset av næringsmedier. For å akselerere veksten tilsettes et natriumtioglykolat på 0,05%, som reduserer oksygenkonsentrasjonen, i tillegg til Finn-II næringsmediet. For å beskytte enzymet fra Mycobacterium systemer giftige produkter av lipidperoksidasjon i næringsmediet Finn-II administrert antioksidant α-tokoferol-acetat i en konsentrasjon på 0,001 mcg / ml. Såing av det diagnostiske materialet utføres i henhold til en standard prosedyre.

I Russlands anti-tuberkuloselaboratorier benyttes også andre modifikasjoner av tette næringsmedier; foreslått G.G. Mordovian næringsmedium "New", utviklet av V.A. Anicic næringsmedium A-6 og A-9, etc.

På grunn av det faktum at i prosessen med kjemoterapi er skade på forskjellige metabolske systemer av mikrobielle celler, mister noen mycobacterial befolkning evnen til å utvikle seg normalt i konvensjonelle næringsmedia og krever osmotisk balansert (eller halvflytende) kulturmedier.

Vurdering og opptak av såddresultat av diagnostisk materiale

Noen stammer og arter av mykobakterier vokser sakte, veksten kan dukke opp selv ved den 90. Dagen. Antallet av slike avlinger er liten, men dette gjør det mulig å motstå avlinger i en termostat i 2,5-3 måneder.

Virulente kulturer av mycobacterium tuberculosis vokser vanligvis på tette eggmiljøer i form av R-form kolonier av forskjellige størrelser og arter. Kolonier tørr, rynket, elfenben, litt pigmentert. I andre medier kan kolonien mycobacterium tuberculosis være mer fuktig. Etter et kjemoterapi eller under behandling kan glatte kolonier med fuktig vekst (S-former) tildeles.

Ved isolering av avlinger brukes et sett med spesielle studier for å skille mycobacterium tuberculosis fra ikke-tuberkulose mykobakterier og syrefaste saprofytter.

En positiv respons er gitt etter en obligatorisk mikroskopisk undersøkelse av den fargede Tsiol-Nelsen-smeten fra de voksne koloniene. Når det gjelder vekst av mykobakterier i smør, er det funnet lyse røde pinner som alene eller i grupper danner klynger i form av filt eller flett. Hos unge kulturer, spesielt isolert fra langtidsbehandling av pasienter med kjemoterapi, mykobakterier skiller det uttrykte polymorfisme, inntil nærværet av stavformede, sammen med korte, nesten coccoide eller langstrakte versjoner som ligner mycel.

Veksthastigheten til mykobakterier er indikert ved følgende skjema: (+) - 1-20 cfu in vitro (skånsom bakteriell utskillelse); (++) - 20-100 CFU in vitro (moderat bakteriell utskillelse); (+++) -> 100 CFU in vitro (rikelig bakteriell utskillelse). I laboratoriediagnostikken av tuberkulose er det ikke nok å svare på om mykobakteriet påvises ved en eller annen metode. Ha en detaljert forståelse av omfanget og naturen av mykobakteriepopulasjonen, dens sammensetning og egenskaper. Det er disse dataene som tillater oss å korrekt tolke prosessens tilstand, planlegge taktikk og rette behandlingen rett.

I de senere årene, for å akselerere veksten av mykobakterier, er næringsmedier på agarbasis med forskjellige veksttilsetninger og bruk av en spesiell gassblanding blitt foreslått. For å oppnå veksten av mykobakterier på disse medier, under dyrking, opprettes en atmosfære med høyt innhold av karbondioksid (4-7%). Spesielle CO ₂ -inkubatorer brukes til dette formålet . Men de mest utviklede automatiserte systemene for dyrking av mykobakterier: MGIT-BACTEC-960 og MB / Bact.

Et slikt system - MGIT system (mykobakterier vekst indikerer rør), som refererer til utvikling av avansert teknologi og er beregnet for hurtig bakteriologisk diagnose av tuberkulose og Mycobacterium mottakelighet for førstelinjepreparater, og noen andre linjemedikamenter. MGIT er fokusert på å bruke den som en del av VASTES-960-enheten. Mikroorganismer dyrkes i spesielle rør med flytende næringsmedium basert på det modifiserte Middlebrook-7H9 medium. For å stimulere veksten av mykobakterier og undertrykke veksten av ekstern mikroflora, brukes MGIT Growth Supplement og en blanding av PANTA antibakterielle stoffer.

Veksten av mikroorganismer registreres optisk. Det er basert på fluorescens, som oppstår når oksygen forbrukes av mykobakterier under vekst. Oksygenavhengig fluorokromisk fargestoff er funnet på bunnen av et spesielt reagensrør og dekket med et lag silikon. Reproduksjon mykobakterier fører til en reduksjon i mengden av oksygen i røret og redusere konsentrasjonen som forårsaker en økning i fluorescens, som blir synlig ved bestråling med ultrafiolett lys-rør og automatisk registrert lysføleren innebygd i apparatet VASTES-960. Intensiteten av luminescens registreres i vekstaggregater (GU-vekst-enheter). Vekstdataene registreres i datamaskinen, hvor de kan lagres automatisk. Datamaskinanalyse av vekstkurvene kan gi informasjon om tilstedeværelsen av en rekke av Mycobacterium bassenger, inkludert nontubercular, og også bidrar til å vurdere vekstegenskapene til mykobakterier.

Som et resultat av tiden for opptreden av slike systemer mycobakteriell vekst er betydelig redusert, i snitt 11 dager VASTES-960 og 19 dager på MB / Bact til 33 døgn på standard fast næringsmedium. Det skal bemerkes at disse systemene krever høyt kvalifisert personell. Podemateriale for flytende medier skal være ledsaget av såing på Lowenstein-Jensen medium, som spiller rollen som stedfortreder i tilfeller der andre medier av Mycobacterium tuberculosis ikke tillater vekst.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Bestemmelse av mykobakterieres narkotikafølsomhet

Bestemmelsen av spekteret og graden av følsomhet for mykobakterier mot anti-tuberkulosemedisiner har stor klinisk betydning, samt for den epidemiologiske evalueringen av spredning av tuberkulose med stoffresistens. I tillegg gjør overvåkning av stoffresistens det mulig å vurdere effektiviteten av tuberkulose-programmet som helhet, som er en integrert indikator for utførelsen av alle bestanddeler av anti-tuberkulose-aktiviteter.

Multiplikasjon og timing av narkotikafølsomhet:

• før behandlingsstart en gang for å bestemme strategi og taktikk for behandling:
• når de isoleres fra syke kulturer fra forskjellige materialer (sputum, BAL-væske, urin, ekssudater, væske, etc.), undersøkes alle isolerte stammer:
• ved slutten av den intensive behandlingsfasen i fravær av klinisk og radiologisk dynamikk:
• hvis det er nødvendig å endre behandlingsregime i følgende tilfeller:
  • fravær av sputum smear;
  • re-isolasjon av kultur etter sputum-smear-negativ;
  • en drastisk økning i antall CMU i swab etter den første nedgangen. Det er velkjent at stammer av mycobacterium tuberkulose, som er heterogene med hensyn til legemiddelfølsomhet, isoleres fra materialet fra en pasient med tuberkulose. Stammenes følsomhet overfor anti-tuberkulosemedisiner kan variere innen rekkevidde av narkotika, grad, frekvens og frekvens av forekomst av resistens.

Graden av legemiddelresistens av Mycobacterium tuberculosis ble bestemt i henhold til etablerte kriterier, som er fokusert på den kliniske betydning og stabilitet avhenger av aktiviteten til anti-TB medikament, farmakokinetikk, er konsentrasjonen i lesjonen. Maksimal terapeutisk dose og så videre.

Bestemmelsen av mykobakteriens narkotikafølsomhet utføres for øyeblikket ved mikrobiologiske metoder:

• Absolutt konsentrasjoner (fortynningsmetode på tett eller flytende næringsmedium),
• proporsjoner,
• motstandskoeffisient.

Vanligvis er motstand manifestert i form av en visuelt observert vekst av koloniene av mycobacterium tuberculosis, men det finnes metoder som fremkaller vekst i de tidlige stadier av cellefordeling av mykobakterier i form av fargereaksjoner. Disse metodene forkorter testtiden fra 3-4 til 2 uker.

Som forenet i Russland har blitt utvidet, anbefalt av WHO Committee kjemoterapi metode for absolutte konsentrasjoner, som er fra et metodisk synspunkt, er den mest enkle, men den krever høy presisjon og standardisering av laboratorieprosedyrer. Medisinens følsomhetstest består av et sett med reagensrør med næringsmedium modifisert med anti-TB-legemidler. Settet består av 2-3 rør med forskjellige konsentrasjoner av hver av stoffene anvendes, kan et kontrollrørene uten medikament til omgivelsene og et rør som inneholdt 1000 mcg / ml av natrium Sali tsilovokislogo eller 500 ug / ml paranitrobenzoynoy syre nontubercular for å påvise vekst av mykobakterier.

For å forberede et sett med medier med preparater, brukes et modifisert Levenstein-Jensen medium (uten stivelse) som helles i kolber. I hver flaske tilsettes et bestemt volum av egnet fortynning av det antituberkuløse preparatet. Innholdet i kolber blandes grundig, helles i rør og brettes i en hellende stilling i 40 minutter ved en temperatur på 85 ° C. Det anbefales å spole mediet i en elektrisk rewinder med automatisk temperaturkontroll. Onsdag med anti-TB-legemidler

1-st-serien kan oppbevares i kjøleskapet ved 2-4 ° C i 1 måned, med preparater av den andre raden - ikke mer enn 2 uker. Lagring av medier med preparater ved romtemperatur er uakseptabelt. Ved fremstilling av oppløsninger av anti-tuberkulosemedisiner blir deres aktivitet tatt i betraktning, beregning av konsentrasjonen justert for molekylvekten til den ikke-spesifikke delen av preparatet, renhet etc. For å bestemme stoffets følsomhet, brukes bare kjemisk rene stoffer.

Prinsippet med metoden er å bestemme konsentrasjonen av et antituberkuløst legemiddel som hemmer veksten av en betydelig del av mykobakteriepopulasjonen. Hvis det gjøres riktig, har denne metoden god pålitelighet.

Før testen er det nødvendig å sørge for at den isolerte kulturen av mycobacterium tuberculosis ikke har ekstern mikroflora. Fra kulturen av mykobakterier i 0,9% natriumkloridoppløsning, fremstilles en homogen suspensjon som inneholder 500 millioner mikrobielle legemer per ml (optisk turbiditetsstandard på 5 enheter). Den resulterende slurry fortynnes med 0,9% natriumkloridoppløsning (1:10) og 0,2 ml oppslemming tilsettes til hvert rør av settet med kulturmedium. De inokulerte rør ble plassert i en inkubator ved 37 ° C og holdt i en horisontal stilling i 2-3 dager til den skrånende overflaten av mediet var jevnt inokulert med en suspensjon av Mycobacterium tuberculosis. Rørene overføres deretter til en vertikal stilling og inkuberes i 3-4 uker. Resultatene registreres etter 3-4 uker.

Siden tidspunktet for ekskretjonsutskillelse fra det kliniske materialet på næringsmedia er minst 1-1,5 måneder, kan resultatene av å bestemme stoffets følsomhet ved denne metoden oppnås ikke tidligere enn 2-2,5 måneder etter sådd av materialet. Dette er en av de viktigste ulempene ved metoden.

Tolk resultatene av å bestemme mycobakteriens medikamentfølsomhet på grunnlag av visse kriterier. På fast kulturmedier er sensitivt for den konsentrasjonen av medikamentet som er inneholdt i det medium, hvis antall kolonier av mykobakterier dyrket in vitro med dette stoffet er ikke mer enn 20 med rikelig vekst i kontrollrøret uten medikamenter. Kun i nærvær av mer enn 20 kolonier anses kulturen å være resistent overfor denne konsentrasjonen. I praksis, når man oppnår vekstresultater i reagensrør nær 20 cfu. Det er nødvendig å varsle den kliniske enheten om at følsomhet eller motstand i dette tilfellet er grense, siden det noen ganger kan forklare den fuzzy dynamikken til kliniske indikatorer.

For ulike legemidler etableres en viss konsentrasjon, hvor reproduksjonen av den kritiske andelen av mycobakteriepopulasjonen blir observert. Disse konsentrasjonene kalles "kritisk". Som et kriterium for stabilitet brukes veksten av befolkningen av mykobakterier på næringsmedium med et preparat ved en kritisk konsentrasjon.

Ved hjemmebasert TB-praksis, ved bestemmelse av stoffresistens, er de ikke begrenset til å bestemme bare kritiske konsentrasjoner. Dette skyldes det faktum. At det utvidete nivået av medikamentresistens gir klinikeren til mer nøyaktig å posisjonere den taktikk kjemoterapi ved bruk av kunnskap av potensiering av virkningen av medikamentkombinasjoner, krysser forventet motstand eller for å bruke en mer effektiv legemidler gruppe anvendt anti-tuberkulosemedisiner.

Den absolutte konsentrasjonsmetoden er den enkleste, men det er også den mest følsomme for feilene som blir gjort når den utføres. Mer pålitelig, spesielt når det gjelder å bestemme følsomheten for andrelinjemedisiner, og vanlig utenfor Russland er metoden for proporsjoner. Det tar hensyn til manglene i metoden for absolutte konsentrasjoner, men i gjennomføring er det mer arbeidskrevende.

Metoden er svært lik den absolutte konsentrasjonsmetoden. Forberedelse av testrør med medisiner utføres på samme måte. Som i absolutt konsentrasjonsmetode. Frøsdosen av suspensjonen av mycobacterium tuberculosis reduseres imidlertid med en faktor på 10. Noe som eliminerer frekvensen av spontan motstand av noen stammer av mycobacterium tuberculosis til slike legemidler som Etambutol, protionamid, capreomycin. Som kontroll brukes 2 eller 3 rør med en frødose som er like i testrørene, fortynnet 10 og 100 ganger. Kriteriet for stabilitet er andelen visuelt observert vekst av mycobacterium tuberkulose. For legemidler av 1. Serie er stabilitetskriteriet overskudd av vekst på 1% av den opprinnelige populasjonen, for narkotika i andre rad - en økning på 1 eller mer enn 10% av den opprinnelige, avhengig av den valgte kritiske konsentrasjon.

I 1997, har en arbeidsgruppe av WHO og International Union for identifisering av god tuberculosis TB medikamentresistens gjort justeringer i disse kriteriene, og tilbyr betraktes motstandsdyktig mykobakterier, som vokser på fast egg media Lowenstein-Jensen i følgende konsentrasjoner:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Etambutol - 2 μg / ml.

I 2001 ble det foreslått kritiske konsentrasjoner for følgende andre legemidler (for en kritisk andel på 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• sykloserin 40 μg / ml;
• aminosalicylsyre - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Vekstresultater evalueres etter 4 uker som foreløpig og etter 6 ukers dyrking - som den endelige.

For å bestemme stoffets følsomhet for pyrazinamid, som er mye brukt i moderne kjemoterapi for tuberkulose, er den anbefalte kritiske konsentrasjonen 200 μg / ml. Imidlertid er det fortsatt ingen generelt akseptert metode for å bestemme stoffresistens mot dette legemidlet på faste næringsmedier, siden dets antibakterielle aktivitet manifesteres bare i surt medium (pH <6), som er teknisk vanskelig å opprettholde. I tillegg vokser mange kliniske kulturer av mykobakterier tuberkulose motvillig på eggmiljøer med et surt miljø.

For å vurdere kvaliteten av resultatene av resistenstesting av Mycobacterium, anbefales at hver ny batch av medium LJ styre parallelle bestemmelse av sensitiviteten av standard museum stamme H37Rv. I tillegg er det visse mikrobiologiske kriterier som må opprettholdes slik at teknikkene gir et godt reproduserbart og korrekt tolket resultat. Disse omfatter levedyktigheten til kulturen av Mycobacterium tuberculosis, reglene for oppnåelse av en homogen suspensjon og suspensjonskulturer av seleksjonsregler Mycobacterium tuberculosis, representativitet av den valgte bakteriemasse. Pålideligheten av bestemmelsen av stoffresistens reduseres med en ekstremt knapt bakteriell frigivelse.

Nylig har en metode for å bestemme stoffets følsomhet ved hjelp av automatiserte systemer blitt ansett som lovende. Den mest perfekte i dette området er utviklingen basert på VASTES MGIT-960. I dette tilfellet bestemmes stoffets følsomhet for mycobacterium tuberculosis på grunnlag av en modifisert fremgangsmåte for proporsjoner. I bestemmelsesprosessen blir vekstraten for mykobakteriet tuberkulose i et kontrollrør og i reagensrør med legemidler sammenlignet. For å bestemme følsomheten for streptomycin, er isoniazid, rifamp-picin og ethambutol, tilsetningsstoffer og antibiotika inkludert i SIRE-settet brukt. For å bestemme følsomheten for pyrazinamid, bruk PZA-settet. I løpet av suspensjonstest Mycobacterium tuberculosis inokulerte reagensglass med legemidler, så vel som kontrollrørene med rekonstituert suspensjon 100 ganger for alle medikamenter bortsett fra pyrazinamid, karakterisert ved at suspensjonen er fortynning på 10 ganger. Kriteriet for stabilitet er vekstindikatoren for mykobakterier på 100 GU når vekst oppnås i kontrollrøret 400 GU (se "Kulturmetoder for isolering av mykobakterier"). Regnskap og tolkning av resultatene utføres automatisk og angis av inngangen eller det valgte programmet.

Som kritiske konsentrasjoner brukes sluttkonsentrasjoner i et reagensrør med flytende næringsmedium. For tiden er kritiske konsentrasjoner utviklet for både 1-linjers og 2-linjers medisiner. Det bør bemerkes at følsomheten av mykobakteri tuberkulose til sykloserin og aminosalicylsyre bare bestemmes på egg næringsmedium.

Omstendelig arbeid protokoll beskrevet systemet gjør det mulig å studere medikamentsensitivitet som dedikert kultur (tett næringsmedium), og ved hjelp av den primære Mycobacterium MGIT-vekst in vitro. Det sistnevnte alternativet reduserer i betydelig grad den tid for kulturen, slik at man for å få full resultatene av kultur av Mycobacterium tuberculosis (inkludert informasjon om medikamentsensitivitet) etter 3 uker fra datoen for samling av materialet, mens den tradisjonelle metoden er det mulig å oppnå bare den tredje måned. Med tiden kan de oppnådde resultatene, når pasienten er i en intensiv behandlingsfase, kompensere for de relativt høye kostnadene ved forskning.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Differensiering av mykobakterier

Med tanke på at det brukte næringsmediet ikke er strengt selektivt. Den påfølgende differensiering av de isolerte mykobakteriene er anerkjent som obligatorisk. Behovet for differensiering av mykobakterier er på grunn av en rekke trekk ved patologiske prosesser forårsaket av slekten: annet forløp og resultat av tuberkulose mvkobakteriose, tilstedeværelse av naturlig medikamentresistens til noen anti-tuberkulosemedisiner.

Det er kjent at primære identifikasjon av Mycobacterium tuberculosis-komplekset M. Nontubercular fra mykobakterier utføres av de følgende egenskaper: vekst på faste næringsmedier, pigmentering, kolonimorfologi, nærvær av syreresistensen og temperatur optimal vekst.

Dessverre er det ikke enkelt laboratoriemetode for pålitelig å skille M. Tuberculosis-komplekset mykobakterier fra andre syrefaste staver, ikke desto mindre en kombinasjon av trekk som er beskrevet ovenfor, med de resultater som er gitt nedenfor av en rekke biokjemiske tester tillater identifikasjon av Mycobacterium tuberculosis kompleks med M. Sannsynligvis vil 95%.

For differensiering av Mycobacterium tuberculosis kompleks M. (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii og andre) fra den langsomtvoksende mykobakterier anvendes nontubercular grunnleggende biokjemiske tester som påviser tilstedeværelsen av følgende symptomer:

• evnen til å produsere nikotinsyre (niacintest):
• nitratreduktaseaktivitet;
• termostabil katalase;
• vekst på medium med natriumsalisylat (1 mg / ml).

Som tilleggstester kan også vekst på et medium som inneholder 500 μg / ml paranitrobenzoesyre eller 5% natriumklorid brukes.

Mange bakteriologiske laboratorier identifiserer disse mikroorganismer bare på kompleksnivå, noe som skyldes laboratoriernes begrensede evner og metodologiske evner hos spesialister.

I de fleste tilfeller, men i praksis for å differensiere M. Tuberculosis og M. Bovis er tilstrekkelig følgende tester: niacin, for tilstedeværelse av nitrat, er tilstedeværelse registrering og pirazinamidazy vekst i medium inneholdende 2 ug / ml hydrazid med tiofen-2-karboksylsyre. Det tas i betraktning at mykobakteriene i M. Tuberculosis-komplekset er karakterisert ved følgende sett av tegn:

• langsom vekst (mer enn 3 uker);
• vekst temperatur i området 35-37 ^o C;
• fravær av pigmentering (elfenben);
• merket syrafast farge;
• en positiv niacin-test;
• en positiv nitratreduktasetest;
• fravær av termostabil katalase (68 ^° C).
• Fraværet av vekst på et Levenstein-Jensen medium som inneholder:
  • 1000 μg / ml natriumsalisylat,
  • 500 μg / ml paranitrobenzoesyre,
  • 5% natriumklorid:
• vekst i nærvær av 1-5 μg / ml tiofen-2-karboksylsyre.

Relevansen av differensiering av isolerte mykobakterier vil øke markant med økningen i hyppigheten av registrering av hiv / aids-tilfeller assosiert med tuberkulose eller mykobakterier. For tiden er det ingen absolutt sikkerhet om beredskapen til praktiske regionale laboratorier for å utføre dette arbeidsmengden på riktig måte.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Immunologisk diagnose av tuberkulose

Det finnes en rekke universelle fenomener, narkotika og immunologiske tester som opprinnelig ble funnet nøyaktig med tuberkulose eller på modell av immunresponsen mot mykobakterier. Disse inkluderer BCG Tuberculin, for eksempel et fenomen som kutan DTH (tuberkulin - Pirquet og Mantoux-reaksjon), idet reaksjonsblandingen til subkutane tuberkulin sensibiliserte dyr (Koch fenomen). En av de første antistoffene i smittsomme sykdommer ble også påvist i tuberkulose. Selvfølgelig, jo dypere forståelsen av mekanismer for antituberkuløs immunitet og deres genetiske kontroll, jo bredere kan det være bruk av immunologiske metoder og legemidler som påvirker immunitet for å løse de praktiske problemene med fisiologi.

Det viktigste og vanskeligste praktiske problemet betraktes for øyeblikket å påvise tuberkulose ved massescreening av befolkningen. Til tross for de mange rapporter om "suksesser" (på begrenset materiale) er det imidlertid ingen egnet immunologisk metode (reproduserbar i "noen armer") og et legemiddel som er egnet for dette formål.

Immunologiske metoder, spesielt serologiske studier (bestemmelse av antigener, antistoffer) og tuberkulinprovokerende tester, brukes svært mye i klinisk praksis.

For det første er det blant de immunologiske studiene som brukes i differensialdiagnose, serologiske metoder - bestemmelse av antigener og antistoffer i ulike miljøer i kroppen.

Specificiteten av antistoffer mot mykobakterier tuberkulose avhenger av antigenene som brukes i immunoassayet. En signifikant mengde antigener er foreslått, den aller første er tuberkulin PPD:

• PAP og andre komplekse preparater fra kulturvæsken;
• ultralydsoppløsning;
• Triton ekstrakt og andre komplekse preparater av cellevegger;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• ledningsfaktor (trehalose-6,6-dikmollat);
• fenol og andre glykolipider;
• lipopolysakkarid;
• fibronektin-bindende antigen;
• proteiner (oftest rekombinante); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, etc.

Som et resultat av mange års forskning av russiske og utenlandske forskere har avdekket grunnleggende lover og effektiviteten av antistoff serologisk diagnostikk av tuberkulose: jo mer komplekse antigenet, jo høyere følsomhet og lavere spesifisitet av testen. Spesifisitet i forskjellige land varierer avhengig av populasjonen av M. Tuberculosis-infeksjon og nontubercular mykobakterier fra bære BCG-vaksinasjon og andre. I barn, er lavere enn hos voksne informasjonsinnholdet i serodiagnosis. I primær tuberkulose (oftere barn) er definisjonen av IgM mer informativ. Med sekundær IgG. Hos HIV-infiserte pasienter reduseres den informative verdien av serodiagnose ved bestemmelse av antistoffer. Effektivitet bestemmelse av antistoffer som er avhengig av antall "kliniske aspekter": prosessaktivitet (i nærvær eller fravær av "isolasjon" mykobakterier nærvær forråtnelse av hulrom, graden av infiltrasjon), utbredelsen av prosessen, varigheten av dets strømning.

Sensitiviteten til metoden for enzymimmunoassay (ELISA) er ca. 70%. Utilstrekkelig effektivitet av studien skyldes lav spesifisitet. Tidligere ble muligheten for bruk av serologisk screening i høyrisikogrupper, særlig blant personer med post-tuberkuloseendringer i lungene, vurdert.

For å øke spesifisiteten til ELISA, fortsetter søk etter mer spesifikke antigener, inkludert de som er oppnådd ved genteknologi: ESAT-6, etc. (se ovenfor). Bruken av strengt spesifikke antigener (38 kDa, ESAT) øker spesifisiteten. Men reduserer sensitiviteten til analysen betydelig. Sammen med IFA (eksperimentell laboratorietestsystemer. For eksempel Pathozyme ELISA-sett) tilveiebringer også kit med lateral Immunokromatografisk filtrering (Mycodot), så vel som andre lignende tester (dot-analyse på membranen) med en visuell vurdering av testresultatet. Under disse testene utføres analysen i 10-30 minutter; de krever ikke spesialutstyr, de krever en visuell evaluering av resultatene, som er knyttet til en viss subjektivitet. Disse metodene har omtrent samme sensitivitet og spesifisitetskarakteristikker (henholdsvis 70% og 90-93%) som den tradisjonelle ELISA.

Bruken av immunanalysemetoder har en bestemt verdi som en ekstra, tatt i betraktning i komplekset av metoder som brukes, i differensialdiagnosen av tuberkulose, særlig ved diagnosen av ekstrapulmonale former. Den mest effektive ELISA-metoden er i diagnosen tuberkulose meningitt i studien av cerebrospinalvæske. I dette tilfellet er sensitiviteten til analysen 80-85%, og spesifisiteten er 97-98%. Det er data om effektiviteten av deteksjon av antistoffer mot mykobakterie tuberkulose i tårevæske ved diagnosen tuberkuløs uveitt.

Induksjon av gamma interferonsyntese in vitro

Gamma interferon (IFN-y) er en spesifikk immunforsvarsfaktor realisert ved å aktivere makrofag enzym systemer. Induksjon av IFN-y-syntese ved sensibiliserte T-lymfocytter forårsaker deres interaksjon med antigener av mykobakterier.

Som antigener som brukes som tuberkulin PPD. Og de spesifikke antigener, fremstilt ved hjelp av genteknologi, spesielt antigener ESAT-6 (tidlig utskilt antigen med en molekylvekt 6 kDa) og CFP-10 (dyrkningsfiltrat protein 10 kDa). Geneteknikk eller rekombinante antigener er fraværende i cellene i BCG-vaksinen og andre mykobakterier. Ved bruk av tuberkulin er resultatene av induksjonstest IFN-y sammenlignbare med resultatene av tuberkulinhudtesten (direkte korrelasjon). Ved bruk av genetisk utviklede antigener er testresultater mer spesifikke og avhenger ikke av tidligere BCG-vaksinasjon. Ved testing av vaksinerte personer som ikke hadde kontakt med tuberkuloseinfeksjon, er testets spesifisitet 99%. Sensitiviteten til testen hos pasienter med tuberkulose varierer fra 81 til 89%.

Tester og diagnoseverktøy er blitt utviklet basert på kortsiktige dyrking av celler eller hel blod mononukleære celler isolert fra blodet med antigener av Mycobacterium tuberculosis in vitro med påfølgende bestemmelse av IFN-γ konsentrasjon eller ved å telle antallet av T-lymfocytter som syntetiserer IFN-γ. Konsentrasjonen av interferon syntetisert in vitro ble bestemt ved ELISA ved anvendelse av monoklonale antistoffer som binder seg til IFN-γ. Deretter, ved bruk av en kalibreringsstandard av IFN-γ bestemmes av dens konsentrasjon i prøverøret eller brønner i platen.

Ved utførelse av Elispot-testen, antall T-limocytter som syntetiserer IFN-y. Regnes på overflaten av en plate belagt med antistoffer mot IFN-y.

Utviklere Diagnosticum på IFN-γ in vitro gjennom induksjon, som er godkjent av Direktoratet for Legemidler og amerikanske produkter, hevder at en test er umulig å skille mellom latent tuberkulose smitte fra aktiv tuberkulose. Derfor, i regioner med høyt infeksjonsnivå, er testen ikke direkte diagnostisk. Men i vårt land kan det brukes til å skille tuberkuloseinfeksjon hos barn fra vaksinasjonsallergi og å vurdere nivået av spesifikk immunitet i behandlingsprosessen.

I dag studeres det innenlandske testsystemet for å bestemme induksjon av IFN-y-syntese ved spesifikke tuberkuloseantigener in vitro.

Immunstatus og tuberkuloseforløp, immunkorreksjon

I prosessen med behandling av tuberkulose hos mennesker, er det endringer i antigenemi og tilstanden i immunsystemet.

Data om endringer i ekssudater og vev er i stor grad motstridende. Det eneste som kan bemerkes med god grunn er at i tuberkulære granulomer blir det vanligvis registrert et betydelig antall aktiverte T-lymfocytter.

Det er fornuftig å dvele på to andre bestemmelser som er nødvendige for å forstå rollen som immunologiske mekanismer ved behandling av tuberkulose hos mennesker:

• AIDS-pasienter har en særlig høy forekomst av flere stoffresistens;
• med flere medikamentresistens (og i fravær av HIV-infeksjon), er immunitetsforstyrrelser (spesielt T-cellelinken) spesielt signifikante.

Når tuberculosis allment anvende forskjellige fremgangsmåter for immunmodulering: det er i første rekke legemidler som virker primært på T-celle-immunitet og et system av mononukleære fagocytter (thymiske hormoner, isoforon, likopid, polioksidony et al.). Samt hele (dempet) mykobakterier og deres komponenter.

Molekylærbiologisk diagnose av tuberkulose

For molekylærbiologiske metoder for diagnose av infektiøse sykdommer omfatter, i hovedsak, fremgangsmåter basert på å manipulere med det genomiske materialet av bakterielle og virale patogener for å identifisere spesifikke genetiske materiale - DNA-segmenter som har en nukleotid sekvens som er spesifikk for en bestemt type eller patogene stammer for å analysere spesifikt DNA-sekvenser i gener som bestemmer patogenes følsomhet for visse medisinske stoffer, og også for funksjonell analyse aktivitet av visse gener av patogenet. Molekylærbiologiske teknikker var i stor utstrekning i vitenskapelig forskning og praktisk anvendelse i diagnose og registrering av forskjellige bakterielle og virale infeksjoner etter åpning i 1985, Carrie Myullisom (vinner av Nobels. 1989) polymerase kjedereaksjon.

Prinsipper og muligheter for polymerasekjedereaksjonsmetoden

PCR tillater å amplifisere (multiplisere) in vitro en nukleotidsekvens (DNA-fragment av patogenet) i flere timer i millioner ganger. Reaksjonen i nærvær av enkle DNA-kjeder bestemmer analysens ekstremt høy følsomhet.

Nukleotidsekvensen av visse regioner i DNA-kjeden bestemmer den genetiske identiteten til mikroorganismen, noe som forklarer PCRs høye spesifisitet.

Verdien av denne teknikk for påvisning og undersøkelse av egenskapene som følge av Mycobacterium tuberculosis biologiske egenskapene til en mikroorganisme som har meget langsom vekst: doblingstid på Mycobacterium tuberculosis DNA når dyrkingen er 12-24 timer.

Prinsippet med PCR-metoden består i forsterkning - flere, millioner ganger. Multiplikasjon av seksjonene av en spesifikk DNA-sekvens i en rørmikrovolum under en syklisk tilbaketrekking av de følgende tre reaksjonstrinn, som hver passerer i et annet temperaturregime:

• Trinn I - denaturering av dobbeltstrenget DNA ved oppvarming med en divergens av dens kjeder;
• II-stadium - komplementær binding (hybridisering) av primere (priming-oligonukleotider) med terminale seksjoner av kjente av strengt spesifikk, valgt for multiplikasjon av DNA-fragmentet;
• Trinn III - fullføring av kjeden av DNA-fragmentet ved bruk av en termostabil DNA-polymerase.

For amplifisering in vitro må det være molekyler av matrised DNA. Fire typer deoksynukleosidtrifosfater (nukleotider) som inneholder de tilsvarende nitrogenbasene: adenin (A), tymin (T), guanin (D), cytosin (C); kunstig syntetiserte primingoligonukleotider (primere) bestående av 18-20 basepar; termostabile DNA polymerase-enzym som har en optimal temperatur på 68 til 72 ⁱ C, og magnesiumioner.

Specificiteten av PCR avhenger av valget av DNA-fragmentet. I overensstemmelse med dette syntetiseres flankefrøoligonukleotider. Specificitet av hybridisering og fullføring av DNA-kjeden skyldes prinsippet om komplementaritet av de følgende par nitrogenholdige baser: adenin-tymin, guanin-cytosin.

For å bestemme den genomiske tuberkuløse mykobakterier kompleks mest effektive mål amplifikasjon i de fleste testsystemer valgt DNA-fragment av IS6110, hvilket i de fleste stammer av Mycobacterium tuberculosis genomet har et betydelig antall (10-20) repetisjoner, som gir, sammen med spesifisitet, høye følsomheten til analysen. Samtidig beskrives stammer av Mycobacterium tuberculosis med et lite antall gjentakelser eller fraværet av IS6110-fragment.

Isolering av DNA-molekyler fra en biologisk prøve

For å utføre PCR, bør patogenes DNA-molekyler isoleres fra det biologiske materialet i et minimalt volum, med en minimums mengde ikke-spesifikt DNA og forskjellige inhibitorer av enzym-DNA-polymerasen.

Fremstillingen av prøver bør utføres under forhold som hindrer krysskontaminering av prøvene ved hjelp av de isolerte DNA-molekylene. For å gjøre dette, er forbehandling av rommet med ultrafiolett, gulv og arbeidsflater på arbeidsbord og apparater nødvendig med klorholdige løsninger. Også obligatorisk bruk av rene hansker, engangstestrør og tips til automatiske pipetter.

For å isolere DNA fra Mycobacterium tuberculosis fra kliniske prøver (cerebrospinalvæske, bronkial vask) ikke inneholdende et stort antall celler, cellulært avfall, eller salter derav, tilstrekkelig til å sentrifugere prøven ved 3-4000. Rpm, til slam 20-30 ul av 2% løsning triton X-100 og oppvarmet til 90 ^omtrent C i 30 min.

For fremstilling av spyttprøver må være effektiv flytendegjøring, som vanligvis brukes for en 4% løsning av natriumhydroksyd og N-acetyl-L-cystein (NALC) i en mengde på 50-80 mg per prøve - avhengig av prøvens viskositet. NALC-løsningen må fremstilles ex tempore eller NALC pulver kan tilsettes tørr til prøven direkte. Etter kondensering skal prøvene sentrifugeres i 15 minutter ved 3,5-4000 rpm (3000 g) i 50 ml hetteglass med skruehett, i. E. Under de samme forholdene som anbefales for preparering av slim.

For ekstraksjon av DNA fra pelleten metoden benyttes mest ofte basert på bruk av en 5-6 molar løsning av guanidinisotiocyanat lysis reagens som de mikroporøse partikler og silisiumoksyd ( "diatomerjord") å adsorbere DNA-molekyl. Uspesifikke stoffer, inkludert inhibitorer mulig, så vasket i en 2,5 molar oppløsning av guanidinisotiocyanatmetoden og etanol-løsning, hvoretter DNA-molekyl er desorbert i vann, og disse prøver ble anvendt for å utføre PCR. For å forenkle DNA-ekstraksjons teknologi, erstattes "diatoméjord" ofte med magnetiske mikropartikler belagt med silisiumoksyd. I dette tilfellet brukes et spesielt magnetisk stativ for mikrotubes i stedet for sentrifugering for å utfelle partiklene.

I Russland ble en original metode for immunomagnetisk separasjon av mykobakterier utviklet, etterfulgt av ekstraksjon av DNA fra patogenet. For Mycobacterium tuberculosis immunomagnetisk separasjon ved å bruke ferroparticles størrelse på 3-5 mikron, belagt med silisiumoksyd, til hvilken det er festet ved hjelp av kjemisk binding polyklonale (kanin) antistoffer mot Mycobacterium tuberculosis. Prøver av sputum etter alkalisk lysis nøytraliseres med en sur tris-HCl-løsning og inkuberes med en immunomagnetisk sorbent. Deretter oppsamles immunoferropartiklene med en magnetstang med en utskiftbar spiss, overføres til en mikrotube og utfelles. Tilsett 20-30 μl av en 2% Triton X-100-løsning og varm i 30 minutter ved 90 ^° C. Supernatanten brukes som en DNA-mal for PCR-analyse.

Et vanskelig problem er isoleringen av mycobacterium tuberculosis DNA fra biopsiprøver. For enzymbiopsi blir enzymproteinet K brukt i en sluttkonsentrasjon på 200-500 mg / l ved en temperatur på 56 ^° C over natten. Videre er en av de kjente metoder brukt. Overdreven ikke-spesifikk DNA i PCR-analysen av biopsier forårsaker ofte inhibering av reaksjonen, hvilket krever gjentatt ekstraksjon av DNA.

Metoder for å oppdage resultater

Etter fullføring av reaksjonen identifiseres de amplifiserte DNA-fragmentene av patogenet ved forskjellige metoder.

Gelelektroforese-metoden er velkjent. Det resulterende DNA-fragment identifiseres ved en positiv kontroll som inneholder det ønskede spesifikke DNA-fragment, eller i henhold til en kjent størrelse (antall nukleotidpar) av fragmentet, som bestemmes ved bruk av en standard molekylær markør.

I nærvær av et spesifikt fargestoff er etidiumbromid inkludert i dobbeltstrenget DNA. Det syntetiserte DNA-fragmentet detekteres som et bånd som lyser under virkningen av ultrafiolett.

Størrelsen på DNA-fragmentet, bestemt ved elektroforese fra avstanden fra starten, må korrespondere med en kjent molekylvektmarkør eller positiv kontroll.

Andre metoder for bestemmelse av PCR-resultater basert på hybridisering av et enkeltkjedet PCR-produkter med et oligonukleotid som er komplementær til disse - DNA-probe merket med biotin, etterfulgt av deteksjon via enzymatiske reaksjoner, for eksempel ved binding til streptavidin-biotin alkalisk fosfatase.

Basert på denne typen deteksjon ble PCR-analysatorer opprettet der deteksjon av PCR-resultater utføres automatisk som et resultat av å lese den optiske tettheten i prøvene etter manifestasjonen av den enzymatiske reaksjonen.

Ulempene med disse metodene er mulighetene for intralaboratorisk forurensning av ganske korte fragmenter av DNA-molekyler. Når molekyler går inn i nye prøver, blir de en matrise for PCR og fører til falske positive resultater.

I dette henseende, for å forhindre falsk positive resultater, innføres strenge regler for separasjon og isolering av lokaler: å trekke ut DNA fra biologiske prøver; lokaler for påvisning av resultater (elektroforese) fra ren sone. Disse lokalene er en sone med sannsynlig forurensning. Et annet isolert område er et rent rom for å introdusere DNA-prøvene som skal testes i rør med en reaksjonsblanding for PCR. Til slutt antas det at hovedenheten - DNA-forsterkeren - skal plasseres i et separat, eventuelt kontorlokal.

For å hindre forurensning av produktene fra de foregående reaksjoner - en systemtest Likon-amp PCR istedenfor dezoksinukleozidtimidina inneholde dezoksinukleoziduridin som, når den in vitro syntese krets som inngår i stedet i riktig stilling, dvs. Den nitrogenholdige base av tymin som er tilstede i naturlig DNA, erstattes av uracil. Uracil-DNA glycosylase tilsettes til reaksjonsblandingen for å analytten, bare ødelegger kontaminerende fragmenter deoksyuridin, men ikke DNA nativt analysert. . Senere oppvarming ved 94 ^° C inaktiverer dette enzymet og forstyrrer ikke amplifisering i PCR.

Det er et testsystem basert på isotermisk amplifisering av rRNA, for hvilken revers transkripsjon og syntese av DNA-molekyler utføres først. Som i sin tur er en matrise for den etterfølgende syntese av RNA-molekyler. RNA-amplikoner påvises ved bruk av en akridin-farget DNA-probe når den hybridiseres i en reaksjonsrøroppløsning. Denne metoden, i tillegg til høy følsomhet, har fordelen av å analysere i ett rør, som forhindrer forurensning. Ifølge forfatterne når sensitiviteten til denne metoden i respiratoriske prøver 90% med en spesifisitet på 99-100%.

Nye påvisningsmetoder implementeres i sanntidspatron. Disse metodene avviker primært i den PCR og deteksjon av dens resultater utføres samtidig i ett lukket rør. Dette forenkler ikke bare teknikk for analyse, men forenkler også forurensning av laboratorierom og testprøver med produkter fra tidligere PCR.

I sanntids-PCR deteksjonsresultatene er på grunn av fluorescens som oppstår under en fluorogen probe-DNA hybridisering med amplifitsi Rui-PCR i løpet av et bestemt DNA-fragment. Struktur fluorogene DNA-prober konstruert slik at den fluorescerende markør frigjøres som et resultat av enzymatisk reaksjon, eller i avstand fra quencher molekyl fluorescens bare i henhold til spesifikk hybridisering med den ønskede DNA-molekylet som skal forsterkes i løpet av PCR. Ettersom antallet av sondemolekyler hybridisert med økningen i fluorescens er proporsjonal med den detekterte nivå av antallet molekyler av det amplifiserte produkt. Da ved hver syklus antall PCR-fragmentet DNA-molekyl er multiplisert med halvparten, det syklusnummer som ved fluorescens blir bestemt og øker omvendt proporsjonalt med antallet av DNA-molekyler i den opprinnelige prøve. Hvis reaksjonen er å introdusere som kalibratoren flere forskjellige kjente konsentrasjoner av molekyler tilsvarende DNA-fragment fra Mycobacterium tuberculosis, ved hjelp av dataprogrammet kan beregnes og mengden av genomisk DNA i testmaterialet.

Hver standardprøve dupliseres. Det kvantitative kriteriet er det minste antall PCR-sykluser som er nødvendige for utbruddet og veksten av den bestemt fluorescens. På abscissen - antall sykluser; ordinatet er fluorescensverdien. DNA-konsentrasjonene er omvendt proporsjonal med antall sykluser som kreves for utseendet av fluorescens. I høyre kolonne (21-32) er syklusstallene for de tilsvarende konsentrasjoner merket. Forskjeller mellom 10 ganger konsentrasjoner av DNA-fragmenter 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 sykluser. For to pasienter var konsentrasjonene av IS6110-fragmenter ca. 10 ³ / ml og 10 ⁴ / ml. Med tanke på antall repetisjoner (6-20) av fragmentene analysert i genomet av Mycobacterium tuberculosis, er antallet mykobakterier i kliniske prøver henholdsvis ca. 100 og 1000 celler.

Bruk av PCR i diagnosen tuberkulose

PCR-metoden er mest brukt for akselerert diagnose av tuberkulose - påvisning av mycobacterium tuberculosis i kliniske prøver: sputum. Bronkial vanning, pleural ekssudat, urin, cerebrospinalvæske, osteolyse punctate, kvinnelige kjønnsorganer aspirater og ulike biopsi prøver. Når man studerte ca 500 prøver av sputum og bronkialspyler fra 340 pasienter med bekreftet diagnose av pulmonell tuberkulose i Nederland, ble den sammenlignende sensitiviteten til PCR, kultur og smearmikroskopi undersøkt. Sensitiviteten til analysen var henholdsvis 92,6,88,9 og 52,4%. Specificiteten av alle metodene var ca 99%.

Effektiviteten av deteksjon av mycobacterium tuberkulose ved smearmikroskopi, sådd på Levenstein-Jensen medium, VASTES test system og PCR analyse ble sammenlignet. PCR viste en sensitivitet på 74,4%, mikroskopi - 33,8%, såing på et tett medium - 48,9% og VASTES - 55,8%. Gjennomsnittlig deteksjonstid for såing på et Levenstein-Jensen medium er 24 dager. VASTES - 13 dager, PCR - 1 dag.

Mulighetene for å bruke PCR som en sensitiv og rask metode for å overvåke effekten av tuberkulosebehandling, diskuteres også.

Påvisning av Mycobacterium tuberculosis DNA ved hjelp av PCR med effektiv kjemoterapi bestemt over en lengre tid - i gjennomsnitt 1,7 måneder, sammenlignet med smøre definert under fluorescerende mikroskopi, og etter 2,5 måneder sammenlignet med bakteriologisk undersøkelse.

Diagnostisering av ekstrapulmonale former for tuberkulose

Verdi som en følsom PCR-metode er spesielt stor for ekstrapulmonare former, som den danner under disse klinisk og radiografiske metoder vanlige bakteriologiske metoder for bestemmelse av Mycobacterium tuberculosis i diagnostiske materialer ineffektive.

Ved undersøkelse av urinprøver ble PCR-resultater positiv i 16 av 17 pasienter med aktiv tuberkulose og negativ urin 4 pasienter inaktive nyre tuberkulose og 39 pasienter med urinveiene sykdom nontubercular.

Effektiviteten av PCR-analyse i studien av benmargsaspirater hos pasienter med feber av ukjent opprinnelse ble påvist i tilfeller av mistanke om tuberkulose. For å diagnostisere tuberkuløs lymfadenitt ble 102 punkterings aspirater og en biopsiprøve av 67 barn med mistanke om tuberkuløs lymfadenitt studert hos barn. Positive resultater ble oppnådd: 71,6% sanntids-PCR. Fluorescensmikroskopi - 46,3%. Kulturforskning - 41,8%. I studien av 50 lymfeknudebiopsier hos pasienter med katteskrap-sykdom var alle resultatene negative. Således ble 100% spesifisitet av PCR-analyse påvist. I det samme arbeidet med punkteringsbiopsi av lymfeknuter ble det vist muligheten for deteksjon av M. Avium.

Diagnose av tuberkulose av det kvinnelige kjønnsområdet infertilitet, som kjent, er en av de vanskeligste problemene med diagnose. I en PCR-studie av endometriebiopsier, endometrielle aspirater og væskeprøver fra Douglas-rommet, ble 14 (56%) av 25 pasienter undersøkt laparoskopisk med mistanke om tuberkulose mottatt positive resultater. Ved å bruke smearmikroskopi og kultur ble henholdsvis 1 og 2 resultater oppnådd. Disse tilfellene var også PCR-positive. De fleste PCR-positive resultater var relatert til tilfeller med karakteristiske tegn på tuberkulose i henhold til den histologiske studien; et mindre antall - med mistanke om tuberkulose i henhold til laparoskopi data. Bare ett positivt resultat av PCR-analyse ble oppnådd i fravær av laparoskopiske data for tuberkulose.

Ved diagnosering av ekstrapulmonale former for tuberkulose har klinikere ofte spørsmål om muligheten for å oppdage et patogen ved test av blodprøver med PCR-metoden. Litterære data indikerer at deteksjon av DNA fra mycobacterium tuberculosis fra blodprøver er mulig med vidtgående former for HIV-infeksjon. DNA av mycobacterium tuberculosis ble bare oppdaget med generalisert tuberkulose av forskjellige organer hos pasienter med transplantert nyre og immunosuppresjon.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Arteridentifikasjon av mykobakterier

PCR-metoden kan være ganske effektive for rask identifisering av mycobakterier av tuberculosis-komplekset og noen arter av mykobakterier nontubercular etter å ha fått sin opprinnelige vekst. I dette tilfellet kan bruk av PCR spare 7-10 dager, som er nødvendig for den etterfølgende kulturelle identifikasjonen av et positivt resultat. PCR-testen er teknisk veldig enkel, da det ikke krever komplisert prøvepreparering av det kliniske materialet for å oppnå høy følsomhet. I studien 80 positive i dette testsystemet (MB Vasto. Organon selskap) var strengt bestemt og holdt for en dag alle positive kulturer av PCR. For å identifisere andre arter av mykobakterier ved fremstilling av DNA fra organismen kultur hybridisert med spesifikke DNA-prober merket med acridin og stammer som detekteres av utseendet av kjemiluminescens via chemiluminometer eller nitrocellulosestrimler med en visuell vurdering etter hybridisering. Ved hjelp av et slikt sett, identifiseres et begrenset antall arter: mycobacterium tuberculosis komplekset. M. Avium, M. Avium kompleks, M. Kansasii og M. Gordonae.

A.Telenti et al. Også utviklet en forholdsvis enkel og billig metode for identifisering av arter av klinisk viktige arter av mykobakterier ved hjelp av PCR og etterfølgende behandling med to restriksjonsenzymer (enzymer med egenskaper skjære et DNA-molekyl på bestemte punkter). DNA-fragmentet amplifiseres. Som koder for et varmesjokkprotein (65 kDa), og deretter behandlet i det resulterende PCR-DNA-fragment av 439 nukleotid-par hver for seg to enzymer - BstE II og Hae III. Deretter analysert ved hjelp av agarosegel-elektroforese oppnås to produkter, bestemmelse av deres størrelse (antall basepar) ved anvendelse av et standard sett av DNA-fragmenter (molekylære DNA-markører) i lengde fra 100 til 1000 basepar. I hver av de spesifikke typer (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) påvise to eller tre DNA-fragmenter av forskjellig størrelse for hvert restriksjonsenzym. Kombinasjonen av forskjellige DNA-størrelser som er oppnådd, gjør det mulig å differensiere disse artene hverandre.

Teknologien for biologiske DNA-mikroarrays utvikles. Som vil bidra til å identifisere mer enn 100 arter av mykobakterier i en studie.

Identifisering kan også bli utført ved PCR-amplifisering av 16S rRNA variable region, etterfulgt av sekvensering av amplikonene som ble sammenlignet med den tilsvarende primærstruktur som tillater identifisering av mer enn 40 arter av mykobakterier.

Ved hjelp av PCR kan en artidentifikasjon innen mycobacterium tuberculosis-komplekset også utføres, inkludert differensiering av M. Bovis og M. Bovis BCG. For å gjøre dette, er nærvær eller fravær av noen gener i de genomiske områdene av RD1 analysert. RD9 og RD10. RD1 er fraværende i M. Bovis BCG, men er tilstede i virulente arter, inkludert M. Bovis.

Bestemmelse av medikamentfølsomhet av Mycobacterium tuberculosis ved PCR

Mål av molekylærgenetiske metoder for resistens eller motstand av Mycobacterium tuberculosis redusere til å identifisere mutasjoner i spesifikke nukleotidsekvenser av kjente gener. Hovedmetoder er basert på enten direkte prochityvanii (sekvensering) av disse sekvensene etter forsterkning eller hybridisering av biotin-merket DNA-fragmenter amplifisert ved PCR-DNA-prober. Begge alternativer omfatte det å identifisere nukleotidsubstitusjoner i de sekvenser som ved hjelp av DNA-prober fører til fravær eller ufullstendig hybridisering til en nitrocellulosemembran ved hjelp av enzym-konjugat (streptavidin-alkalisk fosfatase) - Metode LIPA-Rif-TB.

Metode for måling av fluorescens i et lokalt festet på microsections DNA-sonder komplementære til kjente mutasjoner i PCR-amplifikert gen områdene som er ansvarlige for resistens eller medikamentsensitivitet, kalt mikrobiochipov metode. Hovedalgoritmen for å gjennomføre denne undersøkelsen er som følger. Etter isolering av DNA fra en klinisk prøve eller kultur av mykobakterier er nødvendig for å utføre PCR-amplifikasjon av relevante fragmenter av rpoB genet er ansvarlig for medikamentsensitivitet til rifampicin eller katG og Inha gener som koder for proteiner med Mycobacterium er ansvarlige for sensitivitet til Isoniazid. PCR resultater ble vurdert ved agarose gelelektroforese, hvor bekrefter mottak av egnede DNA-fragmenter av den ønskede lengde. Deretter utføres en andre runde PCR for å introdusere en fluorescerende etikett inn i DNA'et. Resultatene av PCR bekreftes igjen ved gelelektroforese. Deretter ble hybridisering utført (inkubasjon over natten), etterfulgt av vasking av det resulterende materialet på biochip, som er et stort antall løst i et lite glass plate korte DNA-tråder (prober), som er komplementære til nukleotidsekvenser av medikamentet-følsom type Mycobacterium tuberculosis ved punktene for mulige mutasjoner. Så vel som til de mutante sekvensene som er ansvarlige for rusmiddelresistens. Plassering av DNA-prober på plate - strengt definert, og nivået av fluorescens observert ved hybridisering for å bestemme resultatet ved bruk av en spesiell leseenhet er installert. I denne forbindelse bestemmes resultatene av analysen ved hjelp av et spesielt dataprogram.

I de senere år har alternative metoder for å bestemme stoffets følsomhet for mykobakteri tuberkulose blitt utviklet på grunnlag av sanntids-PCR-teknologi, noe som gjør det mulig å gjennomføre disse studiene i en lukket rørprøve.

På fig. 13-13 viser resultatet av analyse av kliniske isolater av Mycobacterium tuberculosis i å bestemme motstand mot rifampicin ved PCR i sanntid: 218 - kontrollprøve (følsom overfor rifampicin); 93 - positiv kontroll for mutasjonen av Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - positiv kontroll for mutasjon av Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - eksperimentelle prøver. Resultat av beregning av kinetiske kurver av amplifikasjon på 4 kanaler: kanal 1: 393 - positiv kontroll for mutasjon av Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - positiv kontroll for mutasjon av Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - eksperimentelle prøver; kanal 4: kinetiske kurver for amplifisering av alle prøver som deltar i forsøket. Positiv kontroll av amplifikasjonsreaksjonen. Konklusjon: Resultatene av analysen viste følgende mutasjoner som bestemmer resistens overfor rifampicin: i prøvene 162,163,172,295 - Ser-Leu-TCG TTG. Det samme prinsippet ble brukt for å bestemme stoffets resistens mot isoniazid for generne katG og inhA, som bestemmer de hyppigste mutasjonene.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Strainidentifikasjon av mycobacterium tuberculosis

Den mest grundig studert metoden for identifisering av stammer av Mycobacterium tuberculosis er en teknikk som kalles restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme (RFLP RFLP,. Eller i den engelske versjon), og som er basert på fragmentirovanin (begrensning) av Mycobacterium tuberculosis DNA enzymet PvuII, og fragmentene oppnådd påfølgende hybridisering med visse spesifikke sekvenser for DNA det gjentatte elementet IS6110. Intraspesifikk variasjon realisert gjennom ulike antall repetisjoner IS6110 og deres plassering på DNA. Så vel som en rekke avstander mellom visse angrepspunkter restriksjonsenzym (restriksjonsseter) og elementet IS6110. Denne teknologien er svært komplisert og tidkrevende. Etter behandling med DNA ekstrahert fra en kultur av Mycobacterium tuberculosis, blir gelelektroforese utført med et restriksjonsenzym, og deretter overført DNA-fragmenter med forskjellige lengder på en nitrocellulosemembran, hybridisering ble utført med fragmenter av IS6110-element og detekteres ved hjelp av enzymatiske reaksjoner. Det resulterende bestemte mønster av bånd karakteriserer DNA-en av en spesifikk stamme av Mycobacterium tuberculosis. Ved hjelp av dataanalyse avsløres identiteten eller relateringen av stammene. Til tross for at RFLP-metoden er den mest diskriminerende, dvs. Identifiserer det største antall av forskjeller i de analyserte stammene, er det ineffektivt for et lite antall (mindre enn 5) IS6110-gjentakelser er observert i noen stammer. På fig. 13-14 viser resultatene av RFLP-typing av stammer.

Et alternativ kan være metoden for spoligotyping - analyse av polymorfismen av spacer-DNA-sekvenser - mellomliggende mellom direkte gjentagelser av DR-regionen. Ved utføring av spoligotyping av stammene utføres PCR med primere som begrenser DR-regionen, hvoretter fragmenter av forskjellig lengde dannes som hybridiserer med de variable mellomliggende regioner av DNA. Analyse av avstandssekvensene til DR-regionen presenteres. Ifølge forskere, enklere, produktive og egnet for primær screening av stammer og foreløpig epidemiologisk analyse, samt forskning direkte klinisk materiale.

Tydeligvis er en mer effektiv og teknologisk tilgjengelig metode VNTR (forkortelse av engelske ord), eller en metode for å bestemme det variable antall eksakte tandem-gjentagelser i DNA av mycobacterium tuberculosis. Denne metoden er bare basert på bruk av PCR og krever ikke ytterligere manipulasjon. Siden antall tandem-gjentagelser i forskjellige stammer og i forskjellige steder er forskjellige, bestemmes fragmentene av forskjellige størrelser og analyseres på det resulterende elektroforegrammet av PCR-produkter. Ifølge forskerne oppnår VNTR en større grad av diskriminering av stammer enn med RFLP-metoden.

Mye oppmerksomhet har blitt betalt de siste årene for distribusjon av stammer av Mycobacterium tuberculosis av W-Beijing familien (noen ganger kalt Beijing-stammen), som i stor grad er narkotikabestandige.

Grunnleggende krav til kvaliteten på molekylær biologisk forskning

[72], [73], [74], [75],

Grunnleggende regulatoriske dokumenter for PCR

Bestillinger russiske Ministry of Health: №45 fra 02.07.2000 g .. Nummer 109 fra 21.03.2003 g .. Nummer 64 fra 21.02.2000 Retningslinjene: 1.3.1888-04 "Organisering av arbeidet i studier med PCR materialet infisert med sykdomsfremkallende biologisk midler av gruppe III-IV av patogenitet "; 1.3.1794-03 "Arbeidsorganisasjon i studien av PCR-materiale, infisert med mikroorganismer av I-II-patogenitetsgruppene". 2003.; 3.5.5.1034-01 "dekontaminering av materialet, infiserte bakterier I-IV patogenitet grupper ved bruk av PCR," 2001 tillegget 11 til den felles instruksjoner for mikrobiologisk undersøkelse metoder i identifisering, diagnostisering og behandling av tuberkulose.

[76], [77], [78]

Personalet

Utførelse av molekylærbiologisk forskning kan holde legene i kliniske laboratoriediagnostikk, leger bakteriologer, virologists, leger, biologer, klinisk diagnostisk laboratorium, samt spesialister med sekundær medisinsk utdannelse, passerte fordypning og avansert opplæring på foreskreven måte.

Arrangement av laboratorielokaler

Følgende laboratorierom er påkrevd:

• Prøvehåndteringsområde er et laboratorium tilpasset arbeid med infeksiøse midler av III-IV-patogenitetsgrupper, i henhold til Methodical Instruction 13.1888-04.
• Sone for fremstilling av reaksjonsblandinger PCR - laboratorierom, som gir beskyttelse mot intern laboratorieforurensning - "ren" sone.
• • Hvis elektroforese eller hybridisering brukes til å analysere PCR-produkter. Laboratorium rom i hvilke de formerte DNA-fragmentene ekstraheres fra rørene og forsterkning, henholdsvis, kan komme ut i omgivelsene, i overensstemmelse med kravene for PCR-laboratorier (1.3.1794-03 retningslinjer, Guidance 1.3.1888-04) må være fullstendig er isolert fra lokalene som er angitt i de forrige avsnittene. Det bør utelukkes fra bevegelsen sone til sone elektroforese for prøvehåndtering og et "rent" område av eventuelle personell, utstyr, materiale og gjenstander, såvel som overføring av luft gjennom ventilasjonssystemet, eller som et resultat av trekk. Denne sonen er ikke nødvendig for fluorimetrisk deteksjon av PCR-produkter.
• Rom for dokumentasjon og behandling av resultater er utstyrt med datamaskiner og nødvendig kontorutstyr. Dette rommet kan inneholde utstyr som gir deteksjon av PCR-produkter uten å åpne røret. - Fluorescerende PCR-detektorer og termiske sikluser for sanntids-PCR.

Sanitære og epidemiologiske krav til primærbehandling av sputum ligner de vanlige mikrobiologiske kravene til arbeid med mykobakterie tuberkulose.

[79], [80], [81], [82],

Fullføring av laboratorieutstyr for PCR-diagnostikk

Laboratoriet inneholder utstyr for følgende rom.

• rom for prøvepreparasjon, inneholder følgende utstyr: laminar av II-klassen av beskyttelse "SP-1.2": solid-state termostat med oppvarmingsdeksel for prøverør av typen "Eppendorf"; mikrocentrifuge ved 13 000 rpm; en sentrifuge (vortex); kjøleskap med et temperaturområde fra -20 ^til C-10 til ^omtrent C; pipetter med variabelt volum av "Rroline" serien; en pumpe med en OM-1-fellekolbe; et stativ for pipetter; stativ arbeidsstasjon 200x0,5 ml; stativ arbeidsstasjon 50x1,5 ml; Stativ til oppbevaring av testrør 80x1,5 ml;
• Reaksjonsblandingspreparasjonsrom: PCR-boks med beskyttende kammer ("Laminar-C. 110 cm); sentrifuge - Vortex; Variable volum pipetter av Proline serien; et stativ for pipetter; stativ arbeidsstasjon 200x0,2 ml; Stativ til oppbevaring av testrør 80x1,5 ml; kjøleskap med et temperaturområde fra -20 ^ї С til + 10 ^о С;
• rom for elektroforese: kamera for horisontal elektroforese; strømforsyning; transilluminator;
• DNA-forsterkere eller nukleinsyreanalysator (PCR i sanntid) med en datamaskin og programvare; kan plasseres i noe ekstra rom. Hvis sanntids-PCR-teknologi brukes. Rom for elektroforese er ikke nødvendig.

[83], [84], [85], [86]

Ekstern kvalitetskontroll

For å være trygg på å skaffe objektivt pålitelige resultater, bør laboratorier delta i systemet med ekstern evaluering av kvaliteten på laboratorieforskningen.

Deltakere i kvalitetsstyringssystemet mottar; 12 ampuller med frysetørkede bakteriecellesuspensjoner, hvorav to inneholder E. Coli E. Kokos, 3 hetteglass med Mycobacterium tuberculosis (avirulent stamme) ved 10 ² / ml; 3 ampuller med celler av en lignende stamme i en konsentrasjon på 10 ⁴ / ml; 2 ampuller med ikke-tuberkulose mykobakterier M. Avium-intracellulare og M. Kansasii i en konsentrasjon på 10 ⁵ / ml.

Distribuerte tester for ekstern kvalitetsvurdering er forhåndsprøvd i to uavhengige laboratorier med stor erfaring på dette feltet.

[87], [88]