Enzymer og cytokiners rolle i patogenesen ved artrose

I de senere år har forskere viet mye oppmerksomhet til å identifisere proteaser som er ansvarlige for nedbrytningen av leddbrusk (ECM) ved slitasjegikt. I følge moderne konsepter spiller matriksmetalloproteaser (MMP) en viktig rolle i patogenesen til slitasjegikt. Hos pasienter med slitasjegikt oppdages et økt nivå av tre MMP-er - kollagenaser, stromelysiner og gelatinaser. Kollagenase er ansvarlig for nedbrytningen av naturlig kollagen, stromelysin - type IV kollagen, proteoglykaner og laminin, gelatinase - for nedbrytningen av gelatin, kollagener IV, Vh XI typer, elastin. I tillegg antas tilstedeværelsen av et annet enzym - aggrekanase, som har egenskapene til MMP-er og er ansvarlig for proteolysen av bruskholdige proteoglykanaggregater.

Tre typer kollagenaser er identifisert i menneskelig leddbrusk, og nivåene av disse er betydelig forhøyet hos pasienter med slitasjegikt: kollagenase-1 (MMP-1), kollagenase-2 (MMP-8) og kollagenase-3 (MMP-13). Sameksistensen av tre forskjellige typer kollagenaser i leddbrusk antyder at hver av dem spiller sin egen spesifikke rolle. Faktisk er kollagenase-1 og -2 hovedsakelig lokalisert i den overfladiske og øvre mellomsonen av leddbrusk, mens kollagenase-3 finnes i den nedre mellomsonen og i den dype sonen. Videre viste resultatene av immunhistokjemiske studier at etter hvert som slitasjegikten utvikler seg, når nivået av kollagenase-3 et platå og synker til og med, mens nivået av kollagenase-1 gradvis øker. Det finnes bevis for at kollagenase-1 ved slitasjegikt hovedsakelig er involvert i den inflammatoriske prosessen i leddbrusk, mens kollagenase-3 er involvert i vevsremodellering. Kollagenase-3, uttrykt i brusken hos pasienter med artrose, nedbryter type II-kollagen mer intensivt enn kollagenase-1.

Av representantene for den andre gruppen av metalloproteaser er tre også identifisert i humant stromelysin: stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10) og stromelysin-3 (MMP-11). I dag er det kjent at bare stromelysin-1 er involvert i den patologiske prosessen ved slitasjegikt. Stromelysin-2 påvises ikke i synovialmembranen hos pasienter med slitasjegikt, men det finnes i svært små mengder i synovialfibroblastene hos pasienter med revmatoid artritt. Stromelysin-3 finnes også i synovialmembranen hos pasienter med revmatoid artritt nær fibroblaster, spesielt i fibrosesoner.

I gruppen av gelatinaser i menneskelig bruskvev er bare to identifisert: 92 kD gelatinase (gelatinase B, eller MMP-9) og 72 kD gelatinase (gelatinase A, eller MMP-2); hos pasienter med slitasjegikt bestemmes en økning i nivået av 92 kD gelatinase.

Nylig har en annen gruppe MMP-er blitt identifisert, som er lokalisert på overflaten av cellemembraner og kalles membrantype-MMP-er (MMP-MT). Denne gruppen inkluderer fire enzymer - MMP-MT1 - MMP-MT-4. MMP-MT-ekspresjon er funnet i menneskelig leddbrusk. Selv om MMP-MT-1 har kollagenaseegenskaper, er både enzymene MMP-MT-1 og MMP-MT-2 i stand til å aktivere gelatinase-72 kDa og kollagenase-3. Rollen til denne gruppen MMP-er i patogenesen av artrose krever avklaring.

Proteinaser skilles ut i form av et zymogen, som aktiveres av andre proteinaser eller organiske kvikksølvforbindelser. Den katalytiske aktiviteten til MMP-er avhenger av tilstedeværelsen av sink i enzymets aktive sone.

Den biologiske aktiviteten til MMP-er kontrolleres av spesifikke TIMP-er. Til dags dato er tre typer TIMP-er identifisert som finnes i menneskelig leddvev: TIMP-1–TIMP-3. En fjerde type TIMP er identifisert og klonet, men den er ennå ikke påvist i menneskelig leddvev. Disse molekylene binder seg spesifikt til det aktive setet til MMP-er, selv om noen av dem er i stand til å binde det aktive setet til 72 kD progelatinase (TIMP-2, -3, -4) og 92 kD progelatinase (TIMP-1 og -3). Bevis tyder på at det ved artrose er en ubalanse mellom MMP-er og TIMP-er i leddbrusk, noe som resulterer i en relativ mangel på inhibitorer, muligens delvis på grunn av en økning i nivået av aktive MMP-er i vevet. TIMP-1 og -2 finnes i leddbrusk og syntetiseres av kondrocytter. Ved slitasjegikt påvises bare type I TIMP i synovialmembranen og synovialvæsken. TIMP-3 finnes utelukkende i ECM. TIMP-4 deler nesten 50 % av aminosyresekvensen sin med TIMP-2 og 38 % med TIMP-1. I andre målceller er TIMP-4 ansvarlig for å modulere aktiveringen av 72 kD progelatinase på celleoverflaten, noe som indikerer en viktig rolle som en vevsspesifikk regulator av ECM-ombygging.

En annen mekanisme for å kontrollere den biologiske aktiviteten til MMP-er er deres fysiologiske aktivering. Det antas at enzymer fra serin- og cysteinproteasefamilien, som henholdsvis AP/plasmin og katepsin B, er fysiologiske aktivatorer av MMP-er. Økte nivåer av urokinase (uAP) og plasmin er funnet i leddbrusken hos pasienter med slitasjegikt.

Til tross for at flere typer katepsiner finnes i leddvev, regnes katepsin-B som den mest sannsynlige aktivatoren av MMP-er i brusk. Fysiologiske hemmere av serin- og cysteinproteaser er funnet i humant leddvev. Aktiviteten til AP-1-hemmeren (IAI-1), så vel som cysteinproteaser, er redusert hos pasienter med slitasjegikt. I likhet med MMP/TIMP er det ubalansen mellom serin- og cysteinproteaser og deres hemmere som kan forklare den økte aktiviteten til MMP-er i leddbrusken hos pasienter med slitasjegikt. I tillegg er MMP-er i stand til å aktivere hverandre. For eksempel aktiverer stromelysin-1 kollagenase-1, kollagenase-3 og 92 kD gelatinase; kollagenase-3 aktiverer 92 kD gelatinase; MMP-MT aktiverer kollagenase-3, og gelatinase-72 kDa forsterker denne aktiveringen; MMP-MT aktiverer også gelatinase 72 kDa. Cytokiner kan deles inn i tre grupper – destruktive (inflammatoriske), regulatoriske (inkludert antiinflammatoriske) og anabole (vekstfaktorer).

Typer cytokiner (ifølge van den Berg WB et al)

Destruktiv	Interleukin-1 TNF-a Leukemihemmende faktor Interleukin-17
Reguleringsmessig	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzymhemmere
Anabole	Mnsulin-lignende vekstfaktorer TGF-b Benmorfogenetiske proteiner Morfogenetiske proteiner avledet fra brusk

Destruktive cytokiner, spesielt IL-1, induserer en økning i frigjøringen av proteaser og hemmer syntesen av proteoglykaner og kollagener av kondrocytter. Regulatoriske cytokiner, spesielt IL-4 og -10, hemmer IL-1-produksjon, øker produksjonen av IL-1-reseptorantagonisten (IL-1RA) og reduserer nivået av NO-syntase i kondrocytter. Dermed motvirker IL-4 IL-1 i tre retninger: 1) reduserer produksjonen og forhindrer dens effekter, 2) øker produksjonen av den viktigste "fjerneren" IL-1RA og 3) reduserer produksjonen av den viktigste sekundære "budbringeren" NO. I tillegg reduserer IL-4 enzymatisk nedbrytning av vev. In vivo oppnås den optimale terapeutiske effekten med en kombinasjon av IL-4 og IL-10. Anabole faktorer som TGF-β og IGF-1 forstyrrer faktisk ikke produksjonen eller virkningen av IL-1, men viser motsatt aktivitet, for eksempel stimulerer de syntesen av proteoglykaner og kollagen, undertrykker aktiviteten til proteaser, og TGF-β hemmer også frigjøringen av enzymer og stimulerer deres inhibitorer.

Proinflammatoriske cytokiner er ansvarlige for økt syntese og uttrykk av MMP-er i leddvev. De syntetiseres i synovialmembranen og diffunderer deretter inn i leddbrusken gjennom synovialvæsken. Proinflammatoriske cytokiner aktiverer kondrocytter, som igjen også er i stand til å produsere proinflammatoriske cytokiner. I ledd som er rammet av slitasjegikt, spilles rollen som betennelseseffektor hovedsakelig av celler i synovialmembranen. Det er synovocyttene av makrofagtypen som utskiller proteaser og inflammatoriske mediatorer. Blant dem er IL-f, TNF-α, IL-6, leukemihemmende faktor (LIF) og IL-17 mest "involvert" i patogenesen av slitasjegikt.

Biologisk aktive stoffer som stimulerer nedbrytningen av leddbrusk ved slitasjegikt

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-a
• Kolonistimulerende faktorer: makrofag (monocytt) og granulocytt-makrofag
• Stoff P
• SIDE ₂
• Plasminogenaktivatorer (vevs- og urokinasetyper) og plasmin
• Metalloproteaser (kollagenaser, ellastaser, stromelysiner)
• Katepsiner A og B
• Trilsin
• Bakterielle lipopolysakkarider
• Fosfolipase Ag

Litteraturdata indikerer at IL-1 og muligens TNF-a er de viktigste mediatorene for ødeleggelse av leddvev ved slitasjegikt. Det er imidlertid fortsatt ukjent om de virker uavhengig av hverandre eller om det er et funksjonelt hierarki mellom dem. Dyremodeller av slitasjegikt har vist at IL-1-blokade effektivt forhindrer ødeleggelse av leddbrusk, mens TNF-a-blokade bare fører til en reduksjon i betennelse i leddvev. Økte konsentrasjoner av begge cytokinene ble funnet i synovialmembranen, synovialvæsken og brusk hos pasienter. I kondrocytter er de i stand til å øke syntesen av ikke bare proteaser (hovedsakelig MMP og AP), men også mindre kollagener, som type I og III, og redusere syntesen av kollagener type II og IX og proteoglykaner. Disse cytokinene stimulerer også reaktive oksygenarter og inflammatoriske mediatorer som PGE2 _. Resultatet av slike makromolekylære endringer i leddbrusk ved slitasjegikt er ineffektiviteten til reparative prosesser, noe som fører til ytterligere nedbrytning av brusk.

De ovennevnte proinflammatoriske cytokinene modulerer prosessene for MMP-undertrykkelse/aktivering ved slitasjegikt. For eksempel kan ubalansen mellom TIMP-1 og MMP-nivåer i brusk ved slitasjegikt være mediert av IL-1, siden en in vitro-studie viste at en økning i IL-1 beta-konsentrasjoner fører til en reduksjon i TIMP-1-konsentrasjoner og en økning i MMP-syntese av kondrocytter. AP-syntese moduleres også av IL-1 beta. In vitro-stimulering av leddbruskkondrocytter med IL-1 forårsaker en doseavhengig økning i AP-syntese og en kraftig reduksjon i iAP-1-syntese. IL-1s evne til å redusere iAP-1-syntese og stimulere AP-syntese er en potent mekanisme for plasmingenerering og MMP-aktivering. I tillegg er plasmin ikke bare et enzym som aktiverer andre enzymer, det deltar også i prosessen med brusknedbrytning ved direkte proteolyse.

IL-ip syntetiseres som en inaktiv forløper med en masse på 31 kD (pre-IL-ip), og omdannes deretter, etter spalting av signalpeptidet, til et aktivt cytokin med en masse på 17,5 kD. I leddvev, inkludert synovialmembranen, synovialvæsken og leddbrusk, finnes IL-ip i en aktiv form, og in vivo-studier har vist synovialmembranens evne til å skille ut dette cytokinet ved slitasjegikt. Noen serinproteaser er i stand til å omdanne pre-IL-ip til sin bioaktive form. Hos pattedyr ble slike egenskaper funnet i bare én protease, som tilhører familien av cystein-aspartatspesifikke enzymer og kalles IL-1β-konverterende enzym (ICF, eller caspase-1). Dette enzymet er i stand til spesifikt å omdanne pre-IL-ip til biologisk aktiv "moden" IL-ip med en masse på 17,5 kD. ICF er et 45 kD proenzym (p45) som er lokalisert i cellemembranen. Etter proteolytisk spalting av p45-proenzymet dannes to underenheter kjent som p10 og p20, som er preget av enzymatisk aktivitet.

TNF-α syntetiseres også som en membranbundet forløper med en masse på 26 kDa; ved proteolytisk spalting frigjøres den fra cellen som en aktiv løselig form med en masse på 17 kDa. Proteolytisk spalting utføres av TNF-α-konverterende enzym (TNF-AC), som tilhører adamalizinfamilien. AR Amin et al. (1997) fant økt uttrykk av TNF-AC mRNA i leddbrusken hos pasienter med slitasjegikt.

Biologisk aktivering av kondrocytter og synovocytter av IL-1 og TNF-a medieres ved binding til spesifikke reseptorer på celleoverflaten - IL-R og TNF-R. To typer reseptorer er identifisert for hvert cytokin - IL-IP type I og II og TNF-R type I (p55) og II (p75). IL-1PI og p55 er ansvarlige for signaloverføring i leddvevsceller. IL-1R type I har en litt høyere affinitet for IL-1beta enn for IL-1a; IL-1R type II har derimot en høyere affinitet for IL-1a enn for IL-ip. Det er fortsatt uklart om IL-IP type II kan mediere IL-1-signaler eller om det kun tjener til konkurrerende hemming av assosiasjonen mellom IL-1 og IL-1R type I. Kondroitider og synoviale fibroblaster hos pasienter med slitasjegikt inneholder store mengder IL-1PI og p55, noe som igjen forklarer den høye følsomheten til disse cellene for stimulering av de tilsvarende cytokinene. Denne prosessen fører til både økt utskillelse av proteolytiske enzymer og ødeleggelse av leddbrusk.

Involveringen av IL-6 i den patologiske prosessen ved slitasjegikt kan ikke utelukkes. Denne antagelsen er basert på følgende observasjoner:

• IL-6 øker antallet inflammatoriske celler i synovialmembranen,
• IL-6 stimulerer kondrocyttproliferasjon,
• IL-6 forsterker effekten av IL-1 i å øke MMP-syntesen og hemme proteoglykansyntesen.

IL-6 er imidlertid i stand til å indusere produksjonen av TIMP-er, men påvirker ikke produksjonen av MMP-er, så det antas at dette cytokinet er involvert i prosessen med å hemme den proteolytiske nedbrytningen av leddbrusk, som utføres av en tilbakekoblingsmekanisme.

Et annet medlem av IL-6-familien er LIF, et cytokin produsert av kondrocytter fra pasienter med slitasjegikt som respons på stimulering av de proinflammatoriske cytokinene IL-1p og TNF-a. LIF stimulerer resorpsjon av bruskproteoglykaner, samt MMP-syntese og NO-produksjon. Rollen til dette cytokinet i slitasjegikt er ikke fullt ut klarlagt.

IL-17 er en 20–30 kD homodimer med en IL-1-lignende effekt, men mye mindre uttalt. IL-17 stimulerer syntesen og frigjøringen av en rekke proinflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1p, TNF-α, IL-6 og MMP i målceller, som humane makrofager. I tillegg stimulerer IL-17 NO-produksjon av kondrocytter. I likhet med LIF har IL-17s rolle i patogenesen av artrose blitt dårlig studert.

Det uorganiske frie radikalet NO spiller en viktig rolle i nedbrytningen av leddbrusk ved artrose. Kondrocytter isolert fra pasienter med slitasjegikt produserer høyere mengder NO både spontant og etter stimulering med proinflammatoriske cytokiner sammenlignet med normale celler. Høyt NO-innhold er funnet i synovialvæske og serum fra pasienter med slitasjegikt – dette er et resultat av økt uttrykk og syntese av indusert NO-syntase (hNOC), enzymet som er ansvarlig for NO-produksjon. Nylig ble DNA-et til kondrocyttspesifikk hNOC klonet, og aminosyresekvensen til enzymet ble bestemt. Aminosyresekvensen indikerer 50 % identitet og 70 % likhet med hNOC spesifikk for endotel og nervevev.

NO hemmer syntesen av makromolekyler i ECM i leddbrusk og stimulerer syntesen av MMP. Dessuten er en økning i NO-produksjon ledsaget av en reduksjon i syntesen av IL-IP-antagonisten (IL-1RA) av kondrocytter. Dermed fører en økning i nivået av IL-1 og en reduksjon i IL-1RA til hyperstimulering av NO i kondrocytter, som igjen fører til økt nedbrytning av bruskmatrisen. Det finnes rapporter om den terapeutiske effekten in vivo av en selektiv hNOC-hemmer på progresjonen av eksperimentell slitasjegikt.

Naturlige cytokinhemmere kan direkte forhindre cytokiner i å binde seg til cellemembranreseptorer, noe som reduserer deres proinflammatoriske aktivitet. Naturlige cytokinhemmere kan deles inn i tre klasser basert på deres virkningsmekanisme.

Den første klassen av inhibitorer inkluderer reseptorantagonister som forhindrer bindingen av liganden til reseptoren ved å konkurrere om bindingsstedet. Til dags dato er en slik inhibitor bare funnet for IL-1 – dette er den ovennevnte konkurrerende inhibitoren av IL-1/ILIP-systemet IL-1 PA. IL-1 PA blokkerer mange effekter som observeres i leddvev ved slitasjegikt, inkludert syntesen av prostaglandiner av synovialceller, produksjonen av kollagenase av kondrocytter og nedbrytningen av benmargen i leddbrusk.

IL-1RA finnes i forskjellige former – én løselig (rIL-1RA) og to intercellulære (μIL-lPAI og μIL-1RAP). Affiniteten til den løselige formen av IL-1RA er 5 ganger høyere enn for de intercellulære formene. Til tross for intensiv vitenskapelig forskning er funksjonen til sistnevnte fortsatt ukjent. In vitro-eksperimenter har vist at hemming av IL-1beta-aktivitet krever en konsentrasjon av IL-1RA som er 10–100 ganger høyere enn normalt, mens in vivo-forhold krever en tusen ganger høyere IL-1RA-konsentrasjon. Dette faktum kan delvis forklare den relative mangelen på IL-1RA og overskuddet av IL-1 i synovium hos pasienter med slitasjegikt.

Den andre klassen av naturlige cytokinhemmere er løselige cytokinreseptorer. Eksempler på slike hemmere hos mennesker som er relatert til patogenesen av slitasjegikt er rIL-1R og pp55. Løselige cytokinreseptorer er forkortede former for normale reseptorer; når de binder seg til cytokiner, forhindrer de at de binder seg til membranassosierte reseptorer i målcellene, og virker ved hjelp av mekanismen for konkurrerende antagonisme.

Hovedforløperen til løselige reseptorer er membranbundet IL-1RP. Affiniteten til rIL-IP for IL-1 og IL-1RA er forskjellig. Dermed har rIL-1RN en høyere affinitet for IL-1β enn for IL-1RA, og rIL-1PI viser en høyere affinitet for IL-1RA enn for IL-ip.

Det finnes også to typer løselige reseptorer for TNF - pp55 og pp75. I likhet med løselige IL-1-reseptorer dannes de ved "avskalning". In vivo finnes begge reseptorene i vevet i de berørte leddene. Rollen til løselige TNF-reseptorer i patogenesen av slitasjegikt er omdiskutert. Det antas at de i lave konsentrasjoner stabiliserer den tredimensjonale strukturen til TNF og øker halveringstiden til det bioaktive cytokinet, mens høye konsentrasjoner av pp55 og pp75 kan redusere TNF-aktivitet ved kompetitiv antagonisme. Sannsynligvis kan pp75 fungere som en TNF-bærer, noe som letter bindingen til den membranassosierte reseptoren.

Den tredje klassen av naturlige cytokinhemmere er representert av en gruppe antiinflammatoriske cytokiner, som inkluderer TGF-beta, IL-4, IL-10 og IL-13. Antiinflammatoriske cytokiner reduserer produksjonen av proinflammatoriske og noen proteaser, og stimulerer produksjonen av IL-1RA og TIMP.