Mesenkymale stamceller

Blant regionale stamceller inntar mesenkymale stamceller (MSC) en spesiell plass, hvis derivater utgjør den stromale matrisen til alle organer og vev i menneskekroppen. Representanter for russisk biologisk vitenskap har prioritet i MSC-forskning.

Midt i forrige århundre ble en homogen kultur av multipotente stromale stamceller fra benmarg isolert for første gang i laboratoriet til A. Friedenstein. Mesenkymale stamceller festet til substratet opprettholdt høy proliferasjonsintensitet i lang tid, og i kulturer med lav såtetthet etter fiksering på substratet dannet de kloner av fibroblastlignende celler som ikke hadde fagocytisk aktivitet. Opphøret av MSC-proliferasjon endte med deres spontane differensiering in vitro til celler av bein, fett, brusk, muskel eller bindevev. Ytterligere studier gjorde det mulig å fastslå det osteogene potensialet til fibroblastlignende celler i benmargsstroma hos forskjellige pattedyrarter, samt deres kolonidannende aktivitet. In vivo-eksperimenter har vist at både hetero- og ortotopisk transplantasjon av kolonidannende fibroblastlignende celler resulterer i dannelse av bein, brusk, fibrøst og fettvev. Siden stromale stamceller fra benmarg er preget av en høy kapasitet for selvfornyelse og mangesidig differensiering innenfor en enkelt cellelinje, kalles de multipotente mesenkymale progenitorceller.

Det bør bemerkes at over 45 år med grunnleggende forskning på mesenkymale stamceller har skapt reelle forutsetninger for bruk av deres derivater i klinisk praksis.

I dag er det ingen tvil om at alt vev i menneskekroppen er dannet fra stamceller fra ulike cellelinjer som et resultat av prosesser med proliferasjon, migrasjon, differensiering og modning. Inntil nylig trodde man imidlertid at stamceller i en voksen organisme er vevsspesifikke, dvs. i stand til å produsere linjer med spesialiserte celler kun fra de vevene der de befinner seg. Denne konseptuelle posisjonen ble motbevist av fakta om transformasjon av hematopoietiske stamceller ikke bare til cellulære elementer i perifert blod, men også til ovale celler i leveren. I tillegg viste nevrale stamceller seg å være i stand til å gi opphav til både nevroner og gliale elementer, samt tidlige dedikerte linjer av hematopoietiske progenitorceller. Mesenkymale stamceller, som vanligvis produserer cellulære elementer av bein, brusk og fettvev, er igjen i stand til å transformere til nevrale stamceller. Det antas at i vekstprosessen, fysiologisk og reparerende vevsregenerering, genereres udedikerte progenitorceller fra vevs-uspesifikke stamreserver. For eksempel kan reparasjon av muskelvev realiseres på grunn av mesenkymale stamceller som migrerer fra benmarg til skjelettmuskulatur.

Selv om slik kryssutskiftbarhet av stamceller ikke erkjennes av alle forskere, er muligheten for klinisk bruk av mesenkymale stamceller som kilde til celletransplantasjon og en cellulær vektor for genetisk informasjon ikke lenger bestridt av noen, i likhet med multipotensen til benmargsstromale stamceller, som relativt enkelt kan isoleres og utvides in vitro-kultur. Samtidig fortsetter rapporter om den potensielle pluripotensen til benmargsstromale stamceller å dukke opp i den vitenskapelige litteraturen. Som bevis siteres forskningsprotokoller der MSC-er, under påvirkning av spesifikke transdifferensieringsindusere, transformeres til nerveceller, kardiomyocytter og hepatocytter. Noen forskere har imidlertid alvorlig tvil om muligheten for gjentatt aktivering og uttrykk av gener fra perioden med tidlig embryogenese. Samtidig forstår alle at hvis det finnes betingelser for å utvide multipotensen til mesenkymale stamceller til pluripotensen til ESC-er, vil mange etiske, moralske, religiøse og juridiske problemer innen regenerativ plastisk medisin automatisk bli løst. Siden kilden til regenerativt stampotensial i dette tilfellet blir pasientens autologe stromale celler, er også problemet med immunavstøting av celletransplantasjonen løst. Den nærmeste fremtiden vil vise hvor realistiske disse utsiktene er.

[ 1 ], [ 2 ]

Bruk av mesenkymale stamceller i medisin

I klinikken er bruken av mesenkymale stamcellederivater primært assosiert med restaurering av vevsdefekter som oppstår ved omfattende og dype termiske hudlesjoner. I preklinisk fase ble det utført en eksperimentell vurdering av muligheten for å bruke allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller for å behandle dype brannskader. Det ble vist at beinmargsfibroblastlignende mesenkymale stamceller danner et monolag i kultur, noe som gjør det mulig å transplantere dem for å optimalisere regenereringsprosessene ved dype brannsår. Forfatterne bemerker at embryonale fibroblaster har en lignende egenskap, men deres kliniske bruk er begrenset av eksisterende etiske og juridiske problemer. En dyp termisk brannskade med skade på alle hudlag ble modellert på Wistar-rotter. Brannskadeområdet var 18–20 % av den totale hudoverflaten. Den første eksperimentelle gruppen inkluderte rotter med en dyp termisk brannskade og transplantasjon av allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller. Den andre gruppen besto av dyr med en dyp termisk brannskade og transplantasjon av allogene embryonale fibroblaster. Den tredje gruppen var representert av kontrollrotter med en dyp termisk brannskade som ikke gjennomgikk celleterapi. En suspensjon av fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster ble påført overflaten av brannsåret ved hjelp av en pipette i en mengde på 2 x 10⁴ ^.celler på den andre dagen etter brannsårmodellering og fjerning av den resulterende nekrotiske skorpen. Etter celletransplantasjon ble brannsåroverflaten dekket med en gasbind fuktet med isotonisk natriumkloridløsning med gentamicin. Benmargsceller ble samlet for å oppnå MSC-er med påfølgende induksjon i en linje av fibroblastlignende mesenkymale stamceller fra voksne Wistar-rotter fra femurer. Embryonale fibroblaster ble oppnådd fra lungene til 14–17 dager gamle embryoer. Embryonale fibroblaster og benmargsceller for å oppnå MSC-er ble fordyrket i petriskåler ved en temperatur på 37 °C i en CO2-inkubator, i en atmosfære med 5 % CO2 ved 95 % fuktighet. Embryonale fibroblaster ble dyrket i 4–6 dager, mens dannelsen av et monolag av MSC-er krevde 14 til 17 dager. Deretter ble MSC-er kryokonservert som kildemateriale for fibroblastlignende mesenkymale stamceller, som ble oppnådd ved tining og dyrking av MSC-er i 4 dager. Antallet dannede fibroblastlignende mesenkymale stamceller var mer enn 3 ganger høyere enn antallet embryonale fibroblaster dannet i løpet av samme dyrkingsperiode. For å identifisere de transplanterte cellene i brannsår i dyrkingsstadiet ble genomet deres merket ved hjelp av en viral shuttle-vektor basert på rekombinant adenovirus type V som bærer 1ac-2-genet som koder for E. coli ß-galaktosidase. Levende celler på forskjellige tidspunkter etter transplantasjon ble detektert immunhistokjemisk i kryosnitt med tilsetning av X-Gal-substrat, som gir en karakteristisk blågrønn farge. Som et resultat av dynamisk visuell, planimetrisk og histologisk vurdering av brannsårstilstanden ble det fastslått at allerede på den tredje dagen etter celletransplantasjon oppstod signifikante forskjeller i sårprosessens forløp i de utvalgte gruppene. Denne forskjellen ble spesielt tydelig på den syvende dagen etter celletransplantasjon. Hos dyrene i den første gruppen, hvor fibroblastlignende mesenkymale stamceller ble transplantert, fikk såret en jevnt intens rosa farge, granulasjonsvevet vokste over hele området til epidermisnivået, og brannsåroverflaten minket betydelig i størrelse. Kollagenfilmen som ble dannet på såroverflaten ble noe tynnere, men den fortsatte å dekke hele brannsårområdet. Hos dyrene i den andre gruppen, hvor embryonale fibroblaster ble transplantert, steg granulasjonsvevet til epidermisnivået på sårkantene, men bare steder, mens plasmoré fra såret var mer intens enn i den første gruppen, og den opprinnelig dannede kollagenfilmen forsvant praktisk talt. Hos dyr som ikke fikk celleterapi, var brannsåret blekt, gropete, nekrotisk vev dekket med fibrin på den 7. dagen. Plasmorea ble observert over hele brannsåroverflaten. Histologisk viste dyrene i den første og andre gruppen en reduksjon i cellulær infiltrasjon og utvikling av det vaskulære nettverket.og disse tegnene på den begynnende regenerative prosessen var mer uttalte hos rottene i den første gruppen. I kontrollgruppen ble det observert tegn på cellulær infiltrasjon av såret, det histologiske mønsteret av nydannede kar var fraværende. På observasjonsdagen 15.-30. var arealet av brannsårene hos dyrene i den første gruppen betydelig mindre enn hos rottene i de andre gruppene, og den granulerende overflaten var mer utviklet. Hos dyrene i den andre gruppen ble også arealet av brannsårene redusert sammenlignet med størrelsen på brannsårene hos rottene i kontrollgruppen, noe som oppsto på grunn av marginal epitelisering. I kontrollgruppen forble brannsårene bleke steder med sjeldne granuleringer, vaskulære stjerner dukket opp på den, det var øyer med fibrinøs plakk, moderat plasmoré fortsatte over hele brannsårene, og en skorpe som var vanskelig å separere ble igjen noen steder. Generelt sett ble også sårstørrelsen redusert hos dyrene i den tredje gruppen, men sårkantene forble undergravde.

Under en sammenlignende studie av sårtilhelingshastigheten ved bruk av fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster, samt uten bruk av celleterapi, ble det dermed observert en akselerasjon av helingshastigheten på brannsårsoverflaten som et resultat av transplantasjon av fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster. Ved bruk av allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller var imidlertid sårtilhelingshastigheten høyere enn ved transplantasjon av embryonale fibroblaster. Dette kom til uttrykk i akselerasjonen av faseendringene i den regenerative prosessen - periodene for cellulær infiltrasjon ble redusert, hastigheten på veksten av det vaskulære nettverket økte, samt dannelsen av granulasjonsvev.

Resultatene fra dynamisk planimetri indikerer at spontanhelingsraten for brannsåret (uten bruk av celleterapi) var lavest. På den 15. og 30. dagen etter transplantasjon av allogene fibroblastlignende mesenkymale stamceller var sårhelingsraten høyere enn ved transplantasjon av embryonale fibroblaster. Histokjemisk metode for å detektere beta-galaktosidase viste at etter transplantasjon av fibroblastlignende mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster forblir de transplanterte cellene levedyktige på overflaten og i dybden av de regenererende sårene gjennom hele observasjonsperioden. Forfatterne mener at den høyere raten for regenerering av brannsår ved bruk av fibroblastlignende mesenkymale stamceller skyldes frigjøring av biologisk aktive vekststimulerende faktorer fra disse cellene under modningsprosessen.

Transplantasjon av auto- eller allogene keratinocytter og allogene fibroblaster for behandling av brannsår har også blitt brukt i klinisk praksis. Det skal bemerkes at kirurgisk behandling av barn med omfattende dype brannskader er en kompleks oppgave på grunn av den høye traumatiske naturen og flere kirurgiske inngrep, betydelig blodtap og ulike reaksjoner på infusjonsmediet som brukes. De største vanskelighetene med å utføre hudplastikkirurgi for omfattende dype brannskader, med et areal som overstiger 40 % av kroppsoverflaten, skyldes alvorlighetsgraden av ofrenes tilstand og mangelen på donorhudressurser. Bruk av netttransplantater med høy perforasjonskoeffisient løser ikke problemet, siden cellene som dannes etter perforering epiteliserer veldig sakte, og selve hudklaffene lyserer eller tørker ut. Slike belegg av brannsår som xenoskin, kadaverallografter og syntetiske filmbelegg er ikke alltid effektive nok, derfor utvikles nye metoder for å dekke brannsårsoverflater med lag av dyrkede keratinocytter og fibroblaster. Spesielt har det blitt foreslått en metode for å dekke brannsårsflater ved hjelp av dyrkede allofibroblaster, som ved transplantasjon har en uttalt stimulerende effekt på proliferasjonen av epidermocytter som er bevart i såret ved borderline-brannskader, samt keratinocytter i septaene til netttransplantasjoner. Arbeidet til L. Budkevich og medforfattere (2000) presenterer resultatene av bruk av denne metoden for behandling av brannskader hos barn. Studien inkluderte 31 barn med termisk traume i alderen 1 år til 14 år. Hos tre barn var det totale arealet av brannsår av grad IIIA-B - IV 40 %, hos 25 - 50-70 %, hos ytterligere tre - 71-85 % av kroppsoverflaten. Tidlig kirurgisk nekrektomi ble kombinert med transplantasjon av dyrkede allofibroblaster og autodermoplastikk. Den første behandlingsfasen involverte fjerning av nekrotisk vev, den andre fasen involverte transplantasjon av dyrkede allofibroblaster på bærerfilmer, og den tredje fasen (48 timer etter transplantasjon av dyrkede allofibroblaster) involverte fjerning av matriksen og autodermoplastikk med hudlapper med et perforeringsforhold på 1:4. Tre pasienter innlagt på klinikken med alvorlig brannskade fikk dyrkede allofibroblaster transplantert på granulerende sår. Transplantasjon av dyrkede allofibroblaster ble utført én gang hos 18 barn, to ganger hos 11 barn og tre ganger hos to pasienter. Arealet av såroverflaten dekket med cellekultur varierte fra 30 til 3500 cm2. Effektiviteten av dyrkede allofibroblaster ble vurdert ut fra den totale prosentandelen av hudtransplantatinnpodning, brannskadetilhelingstider og antall dødsfall fra alvorlig termisk traume. Transplantatinnpodning var fullført hos 86 % av pasientene. Delvis manglende innpodning av hudtransplantater ble observert i 14 % av tilfellene. Til tross for behandlingen døde seks (19,3 %) barn. Det totale arealet av hudskader i dem varierte fra 40 til 70 % av kroppsoverflaten.Transplantasjon av dyrkede allofibroblaster var ikke assosiert med dødelighet av brannskader hos noen pasienter.

Forfatterne analyserer behandlingsresultatene og bemerker at tidligere dype termiske hudskader som dekket 35–40 % av kroppsoverflaten ble ansett som uforenlige med liv (for yngre barn – opptil 3 år – er dype brannskader som dekker 30 % av kroppsoverflaten kritiske, for eldre barn – over 40 % av kroppsoverflaten). Ved kirurgisk nekrektomi med transplantasjon av dyrkede allofibroblaster og påfølgende autodermoplastikk med hudlapper med høy perforeringskoeffisient, er brannskader av IIIB–IV grad fortsatt kritiske, men for tiden er det i mange tilfeller utsikter til å redde livene til selv slike ofre. Kirurgisk nekrektomi i kombinasjon med transplantasjon av dyrkede allofibroblaster og autodermoplastikk hos barn med dype brannskader har vist seg å være spesielt effektiv hos pasienter med utbredte hudlesjoner med mangel på donorsteder. Aktiv kirurgisk taktikk og transplantasjon av dyrkede allofibroblaster bidrar til rask stabilisering av den generelle tilstanden til slike pasienter, en reduksjon i antall smittsomme komplikasjoner av brannskader, etablering av gunstige forhold for innpoding av transplantater, en reduksjon i tiden for restaurering av tapt hud og varigheten av innleggelse, en reduksjon i hyppigheten av dødelige utfall hos ofre med omfattende brannskader. Dermed muliggjør transplantasjon av dyrkede allofibroblaster med påfølgende autodermoplastikk med hudlapper rekonvalesens hos barn med alvorlige brannskader, som tidligere ble ansett som dødsdømte.

Det er generelt akseptert at hovedmålet med behandling av brannskader er den mest komplette og raske restaureringen av skadet hud for å forhindre toksiske effekter, infeksjonskomplikasjoner og dehydrering. Resultatene av bruk av dyrkede celler avhenger i stor grad av hvor godt selve brannsåret er klargjort for transplantasjon. Ved transplantasjon av dyrkede keratinocytter på såroverflaten etter kirurgisk nekrectomi, innpodes i gjennomsnitt 55 % (etter areal) av de transplanterte cellene, mens innpodingsraten ved granulerende sår synker til 15 %. Derfor krever vellykket behandling av omfattende dype hudforbrenninger først og fremst aktive kirurgiske taktikker. Ved brannsår av grad IIIB-IV frigjøres brannoverflaten umiddelbart fra nekrotisk vev for å redusere rus og redusere antall komplikasjoner ved brannskader. Bruk av slike taktikker er nøkkelen til å redusere tiden fra brannsårene pådrar seg til sårene lukker seg, og lengden på sykehusoppholdet til pasienter med omfattende brannskader, og reduserer også antallet dødelige utfall betydelig.

De første rapportene om vellykket bruk av dyrkede keratinocytter for å dekke brannsår dukket opp tidlig på 1980-tallet. Deretter ble denne manipulasjonen utført ved hjelp av lag med dyrkede keratinocytter, oftest hentet fra autoceller, mye sjeldnere fra allokeratinocytter. Teknologien for autokeratinocytoplastikk tillater imidlertid ikke opprettelse av en cellebank, mens tiden som kreves for å produsere en keratinocytttransplantasjon av tilstrekkelig areal er lang og beløper seg til 3-4 uker. I løpet av denne perioden øker risikoen for å utvikle infeksjonssykdommer og andre komplikasjoner av brannsår kraftig, noe som forlenger pasientenes totale sykehusopphold betydelig. I tillegg slår autokeratinocytter praktisk talt ikke rot når de transplanteres på granulerende brannsår, og den høye kostnaden for spesielle vekstmedier og biologisk aktive stimulatorer av keratinocyttvekst begrenser deres kliniske bruk betydelig. Andre bioteknologiske metoder, som kollagenplastikk, transplantasjon av kryopreservert xenoskin og bruk av forskjellige biopolymerbelegg øker effektiviteten av behandling av omfattende overfladiske, men ikke dype brannsår. Metoden for å dekke såroverflaten med dyrkede fibroblaster er fundamentalt forskjellig ved at fibroblaster, snarere enn keratinocytter, brukes som hovedkomponent i det dyrkede cellelaget.

Forutsetningen for utviklingen av metoden var dataene om at pericytter rundt små kar er progenitor-mesenkymale celler som er i stand til å transformere seg til fibroblaster som produserer mange vekstfaktorer og sikrer sårheling på grunn av en sterk stimulerende effekt på proliferasjon og adhesjon av keratinocytter. Bruken av dyrkede fibroblaster for å lukke såroverflater avdekket umiddelbart en rekke betydelige fordeler med denne metoden sammenlignet med bruk av dyrkede keratinocytter. Spesielt krever det ikke bruk av spesielle næringsmedier og vekststimulerende midler for å oppnå fibroblaster i kultur, noe som reduserer kostnadene for transplantasjon med mer enn 10 ganger sammenlignet med kostnadene for å oppnå keratinocytter. Fibroblaster passiveres lett, hvor de delvis mister overflatehistokompatibilitetsantigener, noe som igjen åpner for muligheten for å bruke allogene celler til fremstilling av transplantater og opprettelse av deres banker. Tiden som kreves for å få transplantater klare til bruk i en klinikk reduseres fra 3 uker (for keratinocytter) til 1-2 dager (for fibroblaster). En primær fibroblastkultur kan oppnås ved å dyrke celler fra hudfragmenter tatt under autodermoplastikk, og cellesåingstettheten for å oppnå humane fibroblast-subkulturer er bare 20 x 10³ ^per 1 ^cm².

For å studere effekten av fibroblaster og deres regulatoriske proteiner på proliferasjon og differensiering av keratinocytter, ble det utført en sammenlignende analyse av morfologien og proliferasjonen av keratinocytter på substrater av kollagen type I og III, samt fibronektin i en felleskultur med humane fibroblaster. Humane keratinocytter ble isolert fra hudfragmenter fra pasienter med brannskader, tatt under autodermoplastikk. Keratinocyttsåtettheten var 50 x 103 celler per 1 cm2. Den kliniske effekten av dyrket fibroblasttransplantasjon ble vurdert hos 517 pasienter. Alle pasienter ble delt inn i to grupper: Gruppe 1 - voksne ofre med brannskader av IIA, B - IV grad; Gruppe 2 - barn med dype brannskader av IIIB - IV grad. Evaluering av dynamikken i den strukturelle og funksjonelle organiseringen av monolagskulturfibroblaster, tatt i betraktning rollen til glykosaminoglykaner, fibronektin og kollagen i regenereringsprosessene, tillot forfatterne å bestemme den tredje dagen som den gunstigste perioden for bruk av fibroblastkulturer for å lage transplantasjoner. En studie av effekten av fibroblaster på proliferasjon og differensiering av keratinocytter viste at in vitro-fibroblaster har en uttalt stimulerende effekt, først og fremst på prosessene med keratinocyttadhesjon, og øker antallet festede celler og fikseringshastigheten deres med mer enn 2 ganger. Stimulering av adhesjonsprosesser ledsages av en økning i intensiteten av DNA-syntese og nivået av keratinocyttproliferasjon. I tillegg viste det seg at tilstedeværelsen av fibroblaster og den ekstracellulære matrisen som dannes av dem er en nødvendig betingelse for dannelsen av det tonofibrillære apparatet til keratinocytter, intercellulære forbindelser og til slutt for differensiering av keratinocytter og dannelsen av basalmembranen. Ved behandling av barn med dype brannskader er det etablert høy klinisk effektivitet av transplantasjon av allofibroblastkultur, spesielt i gruppen pasienter med omfattende hudlesjoner ved tilstander med donorstedsdefekt. En omfattende morfofunksjonell studie har vist at transplanterte fibroblaster kjennetegnes av aktiv syntese av DNA, samt kollagen, fibronektin og glykosaminoglykaner, som er en del av den ekstracellulære matrisen som dannes av celler. Forfatterne peker på en høy prosentandel av innpoding av transplanterte fibroblaster (opptil 96 %), en kraftig reduksjon i mottakstiden (innen 24–48 timer i stedet for 2–3 uker ved bruk av keratinocytter), en betydelig akselerasjon av epitelisering av brannsårsoverflaten, samt en betydelig reduksjon i kostnadene (med 10 ganger) for teknologien for å dyrke et transplantat fra fibroblaster sammenlignet med keratinocyttransplantasjon. Bruken av transplantasjon av dyrkede allofibroblaster gjør det mulig å redde livene til barn med kritiske brannskader – termisk skade på mer enn 50 % av kroppsoverflaten.som tidligere ble ansett som uforenlig med liv. Det bør bemerkes at transplantasjon av allogene embryonale fibroblaster har ikke bare overbevisende bevist raskere sårregenerering og rekonvalesens hos pasienter med varierende grad og område av brannskader, men også en betydelig reduksjon i dødeligheten deres.

Autologe fibroblaster brukes også i et så komplekst område av plastikkirurgi som rekonstruktiv korreksjon av stemmebåndsskader. Bovint kollagen brukes vanligvis til dette formålet, hvis virkningsvarighet er begrenset av dets immunogenisitet. Som et fremmed protein er bovint kollagen følsomt for mottakerens kollagenase og kan forårsake immunreaksjoner, og for å redusere risikoen ble det utviklet teknologier for å oppnå kollagenpreparater tverrbundet med glutaraldehyd. Fordelen deres ligger i større stabilitet og lavere immunogenisitet, noe som har funnet praktisk anvendelse for å eliminere defekter og atrofi av stemmebåndene. Injeksjoner av autologt kollagen ble først brukt i 1995. Teknikken sikret bevaring av den primære strukturen til autologe kollagenfibre, inkludert intramolekylære enzymatisk katalyserte tverrbindinger. Faktum er at naturlige kollagenfibre er mer motstandsdyktige mot ødeleggelse av proteaser enn rekonstituert kollagen, der telopeptidene er kuttet. Integriteten til telopeptider er viktig for den kvaternære strukturen til kollagenfibre og dannelsen av tverrbindinger mellom tilstøtende kollagenmolekyler. I motsetning til bovine kollagenpreparater forårsaker ikke autologt kollagen immunreaksjoner hos mottakeren, men det er ikke effektivt nok som et påfyllingsmiddel. En stabil korreksjon kan oppnås gjennom lokal kollagenproduksjon ved transplantasjon av autologe fibroblaster. Imidlertid ble det identifisert visse vanskeligheter under studiet av effektiviteten av autolog fibroblasttransplantasjon i klinikken. I den tidlige perioden etter fibroblasttransplantasjon var den kliniske effekten svakere sammenlignet med etter introduksjon av bovint kollagen. Ved dyrking av autologe fibroblaster kan ikke muligheten for transformasjon av normale fibroblaster til patologiske, de såkalte myofibroblastene, som er ansvarlige for utviklingen av fibrose og arrdannelse, noe som fremgår av sammentrekningen av kollagengelen forårsaket av den spesifikke interaksjonen mellom fibroblaster og kollagenfibriller. I tillegg mister fibroblaster evnen til å syntetisere ekstracellulære matriksproteiner etter seriell passage in vitro.

Imidlertid er det nå eksperimentelt utviklet en metode for dyrking av autologe humane fibroblaster som eliminerer de ovennevnte manglene og ikke resulterer i onkogen transformasjon av normale fibroblaster. Autologe fibroblaster oppnådd ved hjelp av denne metoden brukes til å gjenopprette defekter i bløtvev i ansiktet. I en studie av G. Keller et al. (2000) ble 20 pasienter i alderen 37 til 61 år med rynker og atrofiske arr behandlet. Hudbiopsier (4 mm) fra den retroaurikulære regionen ble transportert til laboratoriet i sterile reagensrør som inneholdt 10 ml kulturmedium (Eagles medium med antibiotika, mykoseptisk middel, pyruvat og føtalt kalveserum). Materialet ble plassert i 3–5 kulturskåler med en diameter på 60 mm og inkubert i en termostat med en atmosfære som inneholdt 5 % CO2. Etter 1 uke ble cellene fjernet fra skålene ved trypsinering og plassert i 25 cm2-ampuller. Cellene ble injisert i pasienter i en mengde på 4 x 107. En signifikant og vedvarende klinisk effekt ble observert hos pasienter under korreksjon av nasolabiale folder, samt hos pasienter med arr 7 og 12 måneder etter den tredje transplantasjonen av autologe fibroblaster. I følge flowcytometri produserte de dyrkede fibroblastene en stor mengde type I-kollagen. In vitro-studier har vist normal kontraktilitet hos de injiserte fibroblastene. To måneder etter subkutan administrering av dyrkede fibroblaster i en dose på 4 x 107 celler ble det ikke påvist svulster hos nakne mus. De injiserte fibroblastene forårsaket ikke arrdannelse eller diffus fibrose hos pasienter. Ifølge forfatteren er de innpodede autologe fibroblastene i stand til å produsere kollagen konstant, noe som vil gi en kosmetisk foryngelseseffekt. Samtidig, siden levetiden til differensierte celler er begrenset, er fibroblaster tatt fra en ung pasient mer effektive enn de som er oppnådd fra eldre mennesker. I fremtiden antas det at det vil være mulig å kryokonservere en kultur av fibroblaster tatt fra en ung donor for senere å transplantere sine egne unge celler til en eldre pasient. Avslutningsvis er det ikke helt riktig å konkludere med at autologe fibroblaster, forutsatt at de er funksjonelt bevart, er et ideelt middel for å korrigere defekter i bløtvev i ansiktet. Samtidig bemerker forfatteren selv at det oppsto noen problematiske situasjoner knyttet til bruken av det autologe fibroblast-kollagen-systemet under studien. Den kliniske effekten var ofte svakere enn ved bruk av bovint kollagen, noe som forårsaket skuffelse hos pasientene.

Generelt sett ser litteraturdataene om utsiktene for klinisk bruk av mesenkymale stamceller ganske optimistiske ut. Det gjøres forsøk på å bruke autologe multipotente mesenkymale progenitorceller fra benmarg for å behandle degenerative leddskader. De første kliniske studiene av bruk av dyrkede mesenkymale progenitorceller i behandlingen av komplekse beinbrudd gjennomføres. Auto- og allogene mesenkymale stromale celler fra benmarg brukes til å lage bruskvev for transplantasjon ved korrigering av leddbruskdefekter på grunn av traumer eller autoimmune lesjoner. Metoder utvikles for klinisk bruk av multipotente mesenkymale progenitorceller for å eliminere beindefekter hos barn med en alvorlig form for ufullstendig osteogenese forårsaket av mutasjoner i type I-kollagengenet. Etter myeloablasjon transplanteres mottakerbarn med beinmarg fra HLA-kompatible friske donorer, siden ufraksjonert beinmarg kan inneholde et tilstrekkelig antall mesenkymale stamceller til å kompensere for en alvorlig beindefekt. Etter transplantasjon av allogen benmarg har slike barn vist positive histologiske forandringer i trabekulære bein, en økning i vekstraten og en reduksjon i forekomsten av beinbrudd. I noen tilfeller oppnås et positivt klinisk resultat ved å transplantere nært beslektet allogen benmarg og osteoblaster. MSC-transplantasjon brukes også til å behandle medfødt beinskjørhet forårsaket av en ubalanse mellom osteoblaster og osteoklaster i beinvevet. I dette tilfellet oppnås gjenoppretting av beindannelse gjennom kimerisering av bassenget av stam- og progenitorstromale celler i pasientens beinvev.

Forbedring av metoder for genetisk modifisering av donor-mesenkymale stamceller med det formål å korrigere genetiske defekter i stromalt vev fortsetter. Det antas at mesenkymale progenitorceller i nær fremtid vil bli brukt i nevrologi for målrettet kimerisering av hjerneceller og etablering av et sunt cellebasseng som er i stand til å generere mangelfullt enzym eller faktor som er ansvarlig for kliniske manifestasjoner av sykdommen. Transplantasjon av mesenkymale stamceller kan brukes til restaurering av benmargsstroma hos kreftpasienter etter stråle- og cellegiftbehandling, og i kombinasjon med benmargsceller - for restaurering av hematopoiesen. Utvikling av erstatningsterapi rettet mot eliminering av defekter i muskel- og skjelettsystemet ved hjelp av MSC-er fremmes av tekniske utviklinger innen design av matriksbiomaterialer eller biomimetikk som danner rammeverk befolket av avkom av mesenkymale stamceller.

Kilder til mesenkymale stamceller

Hovedkilden til mesenkymale stamceller er benmarg, hvis hematopoietiske stamceller i pattedyrs kropp konstant differensierer til blod- og immunsystemceller, mens mesenkymale stamceller er representert av en liten populasjon av fibroblastlignende celler i benmargsstroma og bidrar til å bevare den udifferensierte tilstanden til hematopoietiske stamceller. Under visse forhold differensierer mesenkymale stamceller til brusk- og beinvevsceller. Når de sås på et kulturmedium under planteforhold med lav tetthet, danner mononukleære stromale celler i benmargen kolonier av adhesive celler, som faktisk er fibroblastlignende multipotente mesenkymale progenitorceller. Noen forfattere mener at ubundet mesenkymale stamceller avleires i benmargen, som på grunn av deres evne til selvfornyelse og høye differensieringspotensial, forsyner alt vev i kroppen med mesenkymale forløpere til stromale elementer gjennom hele pattedyrorganismens levetid.

I beinmargen danner stromale celleelementer et nettverk som fyller rommet mellom sinusoidene og beinvevet. Innholdet av sovende MSC-er i beinmargen hos en voksen er sammenlignbart med mengden hematopoietiske stamceller og overstiger ikke 0,01–0,001 %. Mesenkymale stamceller isolert fra beinmarg og ikke utsatt for dyrking mangler adhesjonsmolekyler. Slike MSC-er uttrykker ikke CD34, ICAM, VCAM, kollagen type I og III, CD44 og CD29. Følgelig er det in vitro ikke mesenkymale stamceller som er fiksert på kultursubstratet, men mer avanserte progenitorderivater av mesenkymale stamceller som allerede har dannet komponentene i cytoskjelettet og reseptorapparatet for celleadhesjonsmolekyler. Stromale celler med CD34-fenotypen finnes selv i perifert blod, selv om det i beinmargen er betydelig færre av dem enn CD34-positive mononukleære celler. CD34-celler isolert fra blodet og overført til kultur fester seg til substratet og danner kolonier av fibroblastlignende celler.

Det er kjent at i embryonalperioden oppstår det stromale grunnlaget for alle organer og vev hos pattedyr og mennesker fra en felles samling av mesenkymale stamceller før og på stadiet av organogenesen. Derfor antas det at i en moden organisme bør majoriteten av mesenkymale stamceller være i bindevevet og beinvevet. Det er fastslått at hoveddelen av de cellulære elementene i stroma av løst bindevev og beinvev er representert av dedikerte progenitorceller, som imidlertid beholder evnen til å proliferere og danne kloner in vitro. Når slike celler introduseres i den generelle blodbanen, implanteres mer enn 20 % av mesenkymale progenitorceller blant de stromale elementene i det hematopoietiske vevet og parenkymatøse organer.

En potensiell kilde til mesenkymale stamceller er fettvev, og blant stamcellene har man identifisert adipocyttforløpere som er dedikert i varierende grad. De minst modne progenitorelementene i fettvev er stromal-vaskulære celler, som i likhet med multipotente mesenkymale forløperceller i benmarg er i stand til å differensiere til adipocytter under påvirkning av glukokortikoider, insulinlignende vekstfaktor og insulin. I kultur differensierer stromal-vaskulære celler til adipocytter og kondrocytter, og i fettvev av benmargsopprinnelse finnes det celler som danner adipocytter og osteoblaster.

Stromale stamceller er også funnet i muskler. I primærkulturen av celler isolert fra menneskelig skjelettmuskulatur påvises stellatceller og multinukleære myotuber. I nærvær av hesteserum prolifererer stellatceller in vitro uten tegn til cytodifferensiering, og etter tilsetning av deksametason til næringsmediet er differensieringen deres karakterisert ved tilstedeværelsen av cellulære elementer med fenotypen av skjelett- og glattmuskelceller, bein, brusk og fettvev. Derfor er både dedikerte og ikke-dedikerte multipotente mesenkymale progenitorceller tilstede i menneskelig muskelvev. Det har blitt vist at populasjonen av progenitorceller som er tilstede i skjelettmuskulatur stammer fra ikke-dedikerte multipotente mesenkymale progenitorceller i benmargen og skiller seg fra myogene satellittceller.

Adhesive stellatceller som korresponderer med multipotente mesenkymale stamceller i differensieringspotensial ble også funnet i myokardiet hos nyfødte rotter, siden de under påvirkning av deksametason differensierer til adipocytter, osteoblaster, kondrocytter, glatte muskelceller, skjelettmuskulaturmyotuber og kardiomyocytter. Det ble vist at vaskulære glatte muskelceller (pericytter) er derivater av udifferensierte perivaskulære multipotente mesenkymale stamceller. I kultur uttrykker perivaskulære mesenkymale stamceller glatt muskel a-aktin og blodplateavledet vekstfaktorreseptor og er i stand til å differensiere i det minste til glatte muskelceller.

En spesiell plass, fra et stengelreserveperspektiv, inntar bruskvev, hvis ekstremt lave reparasjonspotensial antas å skyldes mangel på multipotente mesenkymale stamceller eller differensierings- og vekstfaktorer. Det antas at multipotente mesenkymale stamceller som er forhåndsdedikert til kondro- og osteogenese, kommer inn i bruskvev fra andre vevskilder.

Vevsopprinnelsen og betingelsene for binding av mesenkymale progenitorceller i sener er heller ikke fastslått. Eksperimentelle observasjoner indikerer at i den tidlige postnatale perioden beholder kanin-achilleseneceller i primærkulturer og ved første passasje uttrykket av type I-kollagen og dekorin, men med videre dyrking mister de differensieringsmarkørene til tenocytter.

Det skal bemerkes at svaret på spørsmålet om hvorvidt multipotente mesenkymale stamceller lokalisert i forskjellige vev faktisk er konstant tilstede i deres stroma, eller om vevsbassenget av mesenkymale stamceller etterfylles ved migrasjon av stromale stamceller fra benmarg, ennå ikke er mottatt.

I tillegg til benmarg og andre mesenkymale vevssoner i en voksen organisme, kan navlestrengsblod være en annen kilde til MSC-er. Det har blitt vist at navlestrengsveneblod inneholder celler som har lignende morfologiske og antigene egenskaper med multipotente mesenkymale progenitorceller, er i stand til adhesjon og ikke er dårligere enn multipotente mesenkymale progenitorceller av benmargsopprinnelse i differensieringspotensial. I kulturer av mesenkymale stamceller fra navlestrengsblod ble det funnet 5 til 10 % ubundet multipotente mesenkymale progenitorceller. Det viste seg at antallet deres i navlestrengsblod er omvendt proporsjonalt med svangerskapsalderen, noe som indirekte indikerer migrasjonen av multipotente mesenkymale progenitorceller til forskjellige vev under fosterutviklingen. Den første informasjonen har dukket opp om klinisk bruk av mesenkymale stamceller isolert fra navlestrengsblod, så vel som de som er oppnådd fra embryonalt biomateriale, som er basert på den kjente evnen til føtale stamceller til å integrere, innpode og fungere i organer og vevssystemer hos voksne mottakere.

Søk etter nye kilder til mesenkymale stamceller

Bruken av mesenkymale stamceller av embryonal opprinnelse, så vel som andre føtale celler, skaper en rekke etiske, juridiske, rettslige og lovgivningsmessige problemer. Derfor fortsetter søket etter ekstraembryonalt donorcellemateriale. Et forsøk på klinisk bruk av humane hudfibroblaster var mislykket, noe som ikke bare var forutbestemt av teknologiens høye økonomiske kapasitet, men også av den raske differensieringen av fibroblaster til fibrocytter, som har et betydelig lavere proliferasjonspotensial og produserer et begrenset antall vekstfaktorer. Ytterligere fremskritt i studiet av biologien til MSC-er og multipotente mesenkymale stamceller fra benmarg tillot oss å utvikle en strategi for klinisk bruk av autologe mesenkymale stamceller. Teknologien for isolering, dyrking, ex vivo-reproduksjon og målrettet differensiering av disse krevde først og fremst studiet av spekteret av molekylære markører for MSC-er. Analysen deres viste at primærkulturer av humant beinvev inneholder flere typer multipotente mesenkymale stamceller. Proosteoblastfenotypen ble påvist i celler som uttrykker markøren for stromale stamceller STRO-1, men ikke bærer osteoblastmarkøren - alkalisk fosfatase. Slike celler er karakterisert ved en lav evne til å danne mineralisert benmatriks, samt fravær av osteopontin og paratyreoideahormonreseptorekspresjon. Derivater av STRO-1-positive celler som ikke uttrykker alkalisk fosfatase, er representert av intermediært og fullstendig differensierte osteoblaster. Det ble funnet at cellulære elementer av klonede linjer av STRO-1-positive humane trabekulære benceller er i stand til å differensiere til modne osteocytter og adipocytter. Retningen for differensiering av disse cellene avhenger av effekten av flerumettede fettsyrer, proinflammatoriske cytokiner - IL-1b og tumornekrosefaktor a (TNF-a), samt antiinflammatorisk og immunsuppressiv TGF-b.

Det ble senere funnet at multipotente mesenkymale progenitorceller mangler en spesifikk fenotype som bare er iboende i dem, men uttrykker et kompleks av markører som er karakteristiske for mesenkymale, endoteliale, epiteliale og muskelceller i fravær av uttrykk av immunofenotypiske antigener i hematopoietiske celler - CD45, CD34 og CD14. I tillegg produserer mesenkymale stamceller konstitutivt og induserbart hematopoietiske og ikke-hematopoietiske vekstfaktorer, interleukiner og kjemokiner, og reseptorer for noen cytokiner og vekstfaktorer uttrykkes på multipotente mesenkymale progenitorceller. Sovende, eller hvilende, celler med en immunofenotype som er nesten identisk med antigenprofilen til 5-fluorouracil-ubehandlede multipotente mesenkymale progenitorceller er funnet blant cellene i den stromale matriksen i menneskekroppen - begge cellene uttrykker CD117, som markerer "voksne" stamceller.

Dermed er det ennå ikke identifisert en cellemarkør som er unik for mesenkymale stamceller. Det antas at hvilende celler representerer en populasjon av ikke-avtalte multipotente mesenkymale progenitorceller, siden de ikke uttrykker markører for celler som er avtalt med osteo- (Cbfa-1) eller adipogenese (PPAR-y-2). Langvarig eksponering av sakte prolifererende hvilende celler for føtalt bovint serum fører til dannelsen av terminalt differensierende, avtalede progenitorceller karakterisert ved rask vekst. Klonal ekspansjon av slike mesenkymale stamceller støttes av FGF2. Det ser ut til at genomet til stromale stamceller er ganske tett "lukket". Det finnes rapporter om fravær av spontan differensiering i MSC-er - uten spesielle betingelser for avtalt transformerer de seg ikke engang til celler av den mesenkymale avstamningen.

For å studere populasjonsstrukturen til mesenkymale stamcellederivater, utføres et søk etter differensieringsmarkørproteiner på stromale cellelinjer og i primærkulturer. In vitro klonal analyse av benmargskolonidannende celler har vist at EGF øker den gjennomsnittlige kolonistørrelsen og reduserer klonal ekspresjon av alkalisk fosfatase når den brukes på primærkulturer, mens tilsetning av hydrokortison aktiverer ekspresjonen av alkalisk fosfatase, som er en markør for den osteogene retningen av MSC-differensiering. Monoklonale antistoffer mot STRO-1 gjorde det mulig å separere og studere populasjonen av STRO-1-positive adhesive celler i et heterogent system av Dexter-kulturer. Et spektrum av cytokiner er bestemt som regulerer ikke bare proliferasjon og differensiering av hematopoietiske og lymfoide celler, men også deltar i dannelse, dannelse og resorpsjon av skjelettvev gjennom para-, auto- og endokrine mekanismer. Reseptormediert frigjøring av sekundære budbringere som cAMP, diacylglycerol, inositoltrifosfat og Ca2+ brukes også til markøranalyse av ulike kategorier av stromale vevsceller som uttrykker de tilsvarende reseptorene. Bruken av monoklonale antistoffer som markører gjorde det mulig å fastslå tilhørigheten til retikulære celler i stroma i lymfoide organer til de T- og B-avhengige sonene.

I en periode fortsatte vitenskapelige debatter rundt spørsmålet om muligheten for at MSC stammer fra en hematopoietisk stamcelle. Når benmargscellesuspensjoner eksplanteres i monolagskulturer, vokser det faktisk separate kolonier av fibroblaster i dem. Det ble imidlertid vist at tilstedeværelsen av forløpere til fibroblastkolonier og forskjellige spirer av hematopoietisk vevsdifferensiering i benmargen ikke er bevis på deres felles opprinnelse fra en hematopoietisk stamcelle. Ved hjelp av diskriminantanalyse av benmargsstamceller ble det fastslått at mikromiljøet under heterotopisk benmargstransplantasjon ikke overføres av hematopoietiske celler, noe som beviser eksistensen av en populasjon av MSC-er i benmargen som er histogenetisk uavhengig av hematopoietiske celler.

I tillegg gjorde den selektive kloningsmetoden det mulig å identifisere en ny kategori av stromale progenitorceller i monolagskulturer av benmargsceller, bestemme antallet deres og studere deres egenskaper, proliferative og differensierende potensialer. Det viste seg at stromale fibroblastlignende celler prolifererer in vitro og danner diploide kolonier, som, når de transplanteres tilbake i kroppen, sørger for dannelsen av nye hematopoietiske organer. Resultatene fra studien av individuelle kloner indikerer at det blant de stromale progenitorcellene finnes en populasjon av celler som, ved sitt proliferative og differensierende potensial, kan gjøre krav på rollen som stamceller i stromalt vev, histogenetisk uavhengige av hematopoietiske stamceller. Cellene i denne populasjonen er preget av selvopprettholdende vekst og differensierer til progenitorcelleelementer av bein, brusk og retikulært vev i benmargen.

Av stor interesse er resultatene fra studiene til R. Chailakhyan og medforfattere (1997-2001), som dyrket stromale stamceller fra benmarg fra kaniner, marsvin og mus på a-MEM-næringsmediet med tilsetning av føtalt kalveserum. Forfatterne utførte eksplantasjon med en initial tetthet på 2-4 x 103 benmargsceller per 1 cm2. Homologe eller heterologe strålingsinaktiverte benmargsceller ble brukt som fôringsmiddel i en dose som beholdt fôringseffekten, men fullstendig blokkerte deres proliferasjon. To uker gamle primære separate kolonier av fibroblaster ble trypsinert for å oppnå monoklonale stammer. Bevis på kolonienes klonale opprinnelse ble oppnådd ved bruk av en kromosommarkør i blandede benmargskulturer av hann- og hunnmarsvin, time-lapse-fotografering av levende kulturer og i blandede kulturer av syngenisk benmarg fra CBA- og CBAT6T6-mus. Transplantasjon av en suspensjon av nylig isolerte benmargsceller eller in vitro-dyrkede stromale fibroblaster under nyrekapselen ble utført i porøse ivalon- eller gelatin-stillas, samt inaktivert svampaktig kaninbenmatrise. For transplantasjon av kloner i en benskjede ble marsvinlårben renset for bløtvev og periosteum, epifysene ble trimmet, og benmargen ble grundig vasket ut. Benet ble kuttet i fragmenter (3-5 mm), tørket og bestrålt med en dose på 60 Gy. Individuelle kolonier av fibroblaster ble plassert i benskjeder og implantert intramuskulært. For intraperitoneal transplantasjon av stromale fibroblaster dyrket in vitro ble diffusjonskamre av typene A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) og O (V=0,15 cm3, h=2 mm) brukt.

Da R. Chailakhyan et al. (2001) studerte vekstdynamikken til klonale stammer, fant de at individuelle celler som danner fibroblastkolonier, så vel som deres etterkommere, har et enormt proliferativt potensial. Ved den 10. passasje var antallet fibroblaster i noen stammer 1,2–7,2 x 109 ^celler. Under utviklingen deres utførte de opptil 31–34 celledoblinger. I dette tilfellet resulterte heterotoptransplantasjon av benmargsavledede stammer dannet av stromale forløpere fra flere dusin kloner i overføring av benmargsmikromiljøet og dannelsen av et nytt hematopoietisk organ i transplantasjonssonen. Forfatterne stilte spørsmålet om individuelle kloner er i stand til å overføre benmargsmikromiljøet til stromale celler, eller om samarbeid mellom flere forskjellige klonogene stromale forløpere er nødvendig for dette? Og hvis individuelle kloner er i stand til å overføre mikromiljøet, vil det være komplett for alle tre hematopoietiske spirer, eller sørger forskjellige kloner for dannelsen av mikromiljøet for forskjellige hematopoietiske spirer? For å løse disse problemene ble det utviklet en teknologi for å dyrke stromale stamceller på en kollagengel, slik at de dyrkede koloniene av fibroblaster kan fjernes fra overflaten for påfølgende heterotopisk transplantasjon. Individuelle kloner av stromale fibroblaster dyrket fra benmargsceller fra CBA-mus og marsvin ble skåret ut sammen med et fragment av gelbelegget og transplantert heterotopisk - under nyrekapselen til syngene mus eller inn i magemuskelen til autologe marsvin. Når koloniene på gelen ble transplantert inn i muskelen, ble de plassert i beinhylstre.

Forfatterne fant at 50–90 dager etter transplantasjon av fibroblastkolonier i benmargen ble det observert utvikling av bein eller bein og hematopoietisk vev i transplantasjonssonen i 20 % av tilfellene. Hos 5 % av mottakerdyrene inneholdt de dannede beinvevsfokusene et hulrom fylt med benmarg. Inne i beinsylindrene hadde slike fokus en avrundet form og en kapsel bygget av beinvev med osteocytter og et velutviklet osteoblastisk lag. Benmargshulrommet inneholdt retikulært vev med myeloide og erytroide celler, hvis proporsjonale forhold ikke skilte seg fra det i normal benmarg. I nyren var transplantatet et typisk benmargsorgan dannet under transplantasjon av naturlig benmarg, der benkapselen bare dekket benmargshulrommet fra siden av nyrekapselen. Det hematopoietiske vevet inkluderte myeloide, erytroide og megakaryocytiske elementer. Stroma i benmargshulrommet hadde et velutviklet sinussystem og inneholdt typiske fettceller. Samtidig ble det funnet beinvev uten tegn til hematopoiese i transplantasjonssonen til noen kolonier under nyrekapselen. Studien av proliferasjons- og differensieringspotensialene til individuelle kloner ble videreført på monoklonale beinmargsstammer fra kaniner, hvis celler ble resuspendert i et næringsmedium og i en separat ivalonsvamp med en masse på 1-2 mg ble transplantert under nyrekapselen til en kanin-beinmargsdonor. Celler av 21 monoklonale stammer ble utsatt for slik autotransplantasjon. Resultatene ble tatt i betraktning etter 2-3 måneder. Forfatterne fant at i 14 % av tilfellene dannet de transplanterte monoklonale stammene et beinmargsorgan bestående av beinvev og et beinmarghulrom fylt med hematopoietiske celler. I 33 % av tilfellene dannet de transplanterte stammene et kompakt bein av varierende størrelse med osteocytter innebygd i hulrommene og et utviklet osteoblastisk lag. I noen tilfeller utviklet det seg retikulært vev uten bein eller hematopoietiske elementer i svampene med transplanterte kloner. Noen ganger ble retikulært stroma med et velutviklet nettverk av sinusoider dannet, men ikke befolket med hematopoietiske celler. Dermed var de oppnådde resultatene lik dataene som ble oppnådd under klontransplantasjon på kollagengel. Men hvis transplantasjon av kloner dyrket på et substrat resulterte i dannelse av benmargsvev i 5 % av tilfellene, benvev i 15 % og retikulært vev i 80 % av tilfellene, ble dannelse av benmargselementer observert i 14 % av tilfellene, benvev i 53 % og retikulært vev i 53 % av tilfellene ved transplantasjon av monoklonale stammer. Ifølge forfatterne indikerer dette at forholdene for implementering av proliferativt og differensierende potensial for stromale fibroblaster under transplantasjon på porøse stillaser var mer optimale enn under transplantasjon i benskjeder og på et kollagensubstrat.Det er mulig at bruk av mer avanserte metoder for dyrking og omvendt transplantasjon av kloner kan forbedre forholdene for realisering av deres differensieringspotensial av kloner og endre disse forholdstallene. På en eller annen måte, men hovedbetydningen av de utførte studiene er at noen kloner av stromale celler er i stand til å danne beinvev og samtidig gi et stromalt hematopoietisk mikromiljø for tre spirer av benmargshematopoiese samtidig: erytroid, myeloid og megakaryocytisk, og skaper ganske store plattformer av hematopoietisk vev og noe beinmasse.

Forfatterne tok deretter opp spørsmålet om individuelle klonogene stromale stamcellers evne til å gjennomgå disse typene celledifferensiering i et lukket system av diffusjonskamre. I tillegg var det nødvendig å avgjøre om individuelle kloner har polypotens, eller om manifestasjonen av differensieringspotensial krever samarbeidende interaksjon mellom flere kloner med en fast cytodifferensieringsegenskap, hvis forskjellige forhold bestemmer den foretrukne dannelsen av bein, retikulært eller bruskvev. Ved å kombinere to metodologiske tilnærminger - å innhente monoklonale stammer av benmargsstromale stamceller og transplantere dem inn i diffusjonskamre - oppnådde R. Chailakhyan og medforfattere (2001) resultater som tillot dem å komme nærmere forståelsen av den strukturelle organiseringen av benmargsstroma. Transplantasjon av monoklonale stammer av stromale stamceller inn i O-type kamre resulterte i dannelsen av både bein- og bruskvev, noe som indikerer evnen til etterkommerne av en enkelt stromal kolonidannende celle til å samtidig danne bein- og bruskvev. Antagelsen om at bein- og bruskvev stammer fra en felles stromal stamcelle har blitt gjentatte ganger fremmet. Denne hypotesen hadde imidlertid ingen korrekt eksperimentell bekreftelse. Dannelsen av bein og brusk i diffusjonskamre var det nødvendige beviset på eksistensen av en felles stamcelle for disse to vevstypene blant stromale stamceller i benmargen.

Deretter ble 29 klonale stammer av andre-tredje passasjene hentet fra primærkulturer av kaninbenmarg plassert i diffusjonskamre og implantert intraperitonealt i homologe dyr. Studiene viste at 45 % av de monoklonale benmargsstammene har osteogent potensial. Ni kamre inneholdt utelukkende retikulært vev, men det var tilstede sammen med bein- og bruskvev i 13 kamre til, som utgjorde 76 % av alle stammene. I type O-kamre, hvor differensiering av både bein- og bruskvev var mulig, ble 16 stammer studert. I fire kamre (25 %) ble både bein- og bruskvev dannet. Det skal igjen bemerkes at i studiene til R. Chailakhyan et al. (2001) gjennomgikk individuelle progenitorceller 31 til 34 doblinger innenfor en cellestamme, og deres avkom besto av 0,9–2,0 x 109 ^celler. Antallet mitoser som progenitorceller av polyklonale stammer gjennomgikk var praktisk talt identisk med antallet monoklonale stammer. Utviklingshastigheten til polyklonale stammer, spesielt i den første fasen av dannelsen, var i betydelig grad avhengig av antall kolonier som ble brukt til å initiere stammene. Diploide stammer av humane embryonale fibroblaster (WI-38) dannet også kolonier som varierte i diameter og celleinnhold når de ble reklonert ved 12-15. doblingsnivå. Store kolonier som inneholdt mer enn 103 celler utgjorde bare 5-10 %. Med en økning i antall delinger, minket prosentandelen av store kolonier. Mono- og polyklonale stammer av stromale fibroblaster fra benmarg beholdt et diploid sett med kromosomer etter 20 eller flere doblinger, og tendensen til utviklingen deres var sammenlignbar med dynamikken i utviklingen av diploide stammer av embryonale fibroblaster. Analyse av differensieringspotensialet til individuelle stromale stamceller fra benmarg, utført ved å transplantere monoklonale stammer inn i diffusjonskamre, viste at halvparten av dem var osteogene. Store kolonier utgjorde 10 % av det totale antallet. Følgelig tilsvarte antallet osteogene kolonidannende celler omtrent 5 % av deres totale populasjon. Den totale massen av osteogene stamceller identifisert av forfatterne inkluderte celler som var i stand til å danne bein- og bruskvev samtidig. Dessuten ble det for første gang fastslått at disse to vevstypene i en voksen organisme har en felles stamcelle: 25 % av de testede klonene ble skapt av slike celler, og antallet deres blant den totale populasjonen av stamceller var minst 2,5 %.

Heterotoptransplantasjon av individuelle kloner av beinmargsfibroblaster har dermed avslørt nye aspekter ved den strukturelle organiseringen av populasjonen av mesenkymale stamceller. Det er funnet stromale stamceller som er i stand til å overføre et spesifikt mikromiljø for alle hematopoietiske spirer samtidig, hvorav antallet blant de store klonene som er studert i forskjellige modeller varierer fra 5 til 15 % (0,5–1,5 % av det totale antallet detekterte stamceller). Sammen med kloner som overfører hele beinmargsmikromiljøet, finnes det stamceller som kun er bestemt til osteogenese, og som, når de overføres i et åpent system, danner beinvev som ikke støtter utviklingen av hematopoiesen. Antallet deres fra det totale antallet stamceller er 1,5–3 %. Noen av disse cellene er i stand til å danne beinvev med en begrenset periode med selvvedlikehold. Følgelig er populasjonen av stromale stamceller heterogen i sitt differensieringspotensial. Blant dem finnes det en kategori celler som hevder å være stromale stamceller, som er i stand til å differensiere i alle tre retninger som er karakteristiske for stromalt vev i benmarg, og danne bein, brusk og retikulært vev. De presenterte dataene gir oss håp om at det, ved hjelp av ulike cellemarkører, vil være mulig å bestemme bidraget fra hver type stromale celler til organiseringen av et spesifikt mikromiljø og støtte til hematopoiesen i Dexter-kulturer.

Funksjoner ved mesenkymale stamceller

I de senere år har det blitt fastslått at multipotente mesenkymale stamceller i stasjonære benmargskulturer er representert av en begrenset populasjon av små agranulære celler (RS-1-celler) karakterisert ved lav kolonidannende kapasitet og fravær av uttrykk av Ki-67-antigenet som er spesifikt for prolifererende celler. De antigeniske parametrene til sovende RS-1-celler skiller seg fra spekteret av antigener til raskt prolifererende, dedikerte stromale stamceller. Det har blitt fastslått at en høy proliferasjonsrate av dedikerte stamceller bare observeres i nærvær av RS-1-celler. RS-1-celler øker igjen vekstraten sin under påvirkning av faktorer som skilles ut av de mest modne derivatene av multipotente mesenkymale stamceller. Det ser ut til at RS-1-celler er en underklasse av ikke-dedikerte MSC-er som er i stand til resirkulering. In vitro er 5-fluorouracilresistente benmargsstromale stamceller karakterisert ved lavt RNA-innhold og høyt uttrykk av ornitindekarboksylasegenet, en markør for ikke-prolifererende celler.

Intensiv proliferasjon av stromale progenitorceller begynner etter at de er festet til substratet. I dette tilfellet uttrykkes markørprofilen til dårlig differensierte celler: SH2 (TGF-(3)-reseptor), SH3 (signalproteindomene), kollagen type I og III, fibronektin, adhesjonsreseptorer VCAM-1 (CD106) og ICAM (CD54), cadherin-11, CD44, CD71 (transferrinreseptor), CD90, CD120a og CD124, men uten uttrykk av karakteristiske markører for hematopoietiske stamceller (CD34, CD14, CD45). Klonal vekst gjør det mulig å gjentatte ganger overføre mesenkymale stamceller med dannelse av en rekke genetisk homogene pluripotente stromale progenitorceller i kultur. Etter 2-3 overganger når antallet deres 50-300 millioner. I en kultur med tilstrekkelig tetthet, etter at proliferasjonen har stoppet, differensierer stromale progenitorceller, i motsetning til hematopoietiske vevsfibroblaster, til adipocytter, myocytter, brusk- og beinceller. En kombinasjon av tre regulatoriske differensieringssignaler, inkludert 1-metyl-isobutylxantin (en induser av intracellulær cAMP-dannelse), deksametason (en hemmer av fosfolipaser A og C) og indometacin (en hemmer av cyklooksygenase, som også reduserer aktiviteten til tromboksansyntase), omdanner opptil 95 % av progenitor-mesenkymale stamceller til adipocytter. Dannelsen av adipocytter fra umodne stromale elementer bekreftes av uttrykket av lipoproteinlipasegenet, histokjemisk deteksjon av apolipoproteiner og peroksisomale reseptorer. Celler av samme klon under påvirkning av TGF-b i et serumfritt medium skaper en homogen populasjon av kondrocytter. Flerlagscellekulturen av dette bruskvevet er karakterisert av en utviklet intercellulær matrise bestående av proteoglykan og type II-kollagen. I et næringsmedium med 10 % effekt av et differensieringssignalkompleks bestående av b-glyserofosfat (en uorganisk fosfatdonor), askorbinsyre og deksametason i samme kultur av stromale stamceller fører til dannelsen av cellulære aggregater. I slike celler observeres en progressiv økning i alkalisk fosfataseaktivitet og osteopontinnivåer, noe som indikerer dannelse av beinvev, hvis mineralisering av cellene bekreftes av en progressiv økning i intracellulært kalsiuminnhold.

Ifølge noen data kombineres mesenkymale stamcellers evne til ubegrenset deling og reproduksjon av ulike typer celler i den mesenkymale differensieringslinjen med en høy grad av plastisitet. Når de introduseres i hjernens ventrikler eller hvite substans, migrerer mesenkymale stamceller til nervevevets parenkym og differensierer til derivater av glial- eller neuronalcellelinjen. I tillegg finnes det informasjon om transdifferensiering av MSC-er til hematopoietiske stamceller både in vitro og in vivo. En mer grundig analyse i noen studier har fastslått en usedvanlig høy plastisitet hos MSC-er, noe som manifesterer seg i deres evne til å differensiere til astrocytter, oligodendrocytter, nevroner, kardiomyocytter, glatte muskelceller og skjelettmuskelceller. En rekke studier av transdifferensieringspotensialet til MSC-er in vitro og in vivo har slått fast at multipotente mesenkymale progenitorceller av benmargsopprinnelse terminalt differensierer til cellelinjer som danner bein, brusk, muskel, nerve- og fettvev, samt sener og stroma som støtter hematopoiesen.

Andre studier klarte imidlertid ikke å avdekke noen tegn på begrensning av pluripotensen til det mesenkymale stamcellegenomet og progenitorpopulasjonene av stromale celler, selv om mer enn 200 kloner av MSC-er isolert fra én primærkultur ble studert for å teste mulig pluripotens av stromale celler. Det overveldende flertallet av klonene in vitro beholdt evnen til å differensiere i osteogen, kondrogen og adipogen retning. Når man utelukker sannsynligheten for migrasjon av mottakerceller ved å transplantere mesenkymale stamceller under nyrekapselen eller i diffusjonskamre, viste det seg at stromale progenitorceller in situ beholder en heterogen fenotype, noe som indikerer enten fravær av restriksjonsfaktorer i transplantasjonssonen eller fravær av MSC-pluripotens som sådan. Samtidig er eksistensen av en sjelden type somatiske pluripotente stamceller, som er vanlige forløpere for alle voksne stamceller, tillatt.

Multipotensen, men ikke pluripotensen, til ekte mesenkymale stamceller, som utgjør en svært liten andel av benmargsceller og er i stand til å proliferere under visse forhold under in vitro-dyrking uten å differensiere, fremgår av deres induserte binding til bein-, brusk-, fett-, muskelvevsceller, samt tenocytter og stromale elementer som støtter hematopoiesen. Som regel fremkaller langvarig eksponering for et kulturmedium med føtalt kalveserum frigjøring av MSC-er i dedikerte stromale progenitorceller, hvis avkom gjennomgår spontan terminal differensiering. In vitro er det mulig å oppnå målrettet dannelse av osteoblaster ved å tilsette deksametason, ß-glyserofosfat og askorbinsyre til kondisjoneringsmediet, mens en kombinasjon av deksametason- og insulindifferensieringssignaler induserer dannelsen av adipocytter.

Det er fastslått at benmargs-MSC-er, før de går inn i stadiet med terminal differensiering, initialt differensierer til fibroblastlignende mesenkymale stamceller under visse kulturforhold. Derivater av disse cellene in vivo deltar i dannelsen av bein, brusk, sener, fett- og muskelvev, samt stroma som støtter hematopoiesen. Mange forfattere forstår begrepet «multipotente mesenkymale progenitorceller» til å bety både MSC-ene i seg selv og dedikerte stromale progenitorceller fra benmarg og mesenkymale vev. Klonal analyse av multipotente mesenkymale progenitorceller av benmargsopprinnelse viste at litt mer enn en tredjedel av alle kloner differensierer til osteo-, kondro- og adipocytter, mens cellene i de gjenværende klonene kun har osteogent potensial og kun danner kondro- og osteocytter. En klon av multipotente mesenkymale stamceller som BMC-9 differensierer under passende mikromiljøforhold til celler med fenotypen og funksjonelle egenskaper ikke bare til osteoblaster, kondrocytter og adipocytter, men også stromale celler som støtter hematopoiesen. En klon av RCJ3.1-celler isolert fra rottefosterbenmarg differensierer til mesenkymale celler av forskjellige fenotyper. Under den kombinerte virkningen av askorbinsyre, b-glyserofosfat og deksametason danner de cellulære elementene i denne klonen først multinukleære myocytter, og deretter, sekvensielt, adipocytter, kondrocytter og øyer av mineralisert beinvev. Populasjonen av granulære celler fra periosteum hos rottefostre tilsvarer ikke-engasjerte multipotente mesenkymale stamceller, siden den er preget av en lav proliferasjonsrate, ikke uttrykker differensieringsmarkører, og under kulturforhold differensierer til å danne kondro-, osteo- og adipocytter, samt glatte muskelceller.

Det bør derfor erkjennes at spørsmålet om pluri- eller multipotensen til genomet til mesenkymale stamceller forblir åpent, noe som følgelig også påvirker ideene om differensieringspotensialet til stromale progenitorceller, som heller ikke er endelig fastslått.

En eksperimentelt bevist og viktig egenskap ved mesenkymale stamceller er deres evne til å forlate vevsnisjen og sirkulere i den generelle blodbanen. For å aktivere det genetiske differensieringsprogrammet må slike sirkulerende stamceller komme inn i det passende mikromiljøet. Det har blitt vist at med systematisk introduksjon av MSC-er i blodbanen til mottakerdyr, implanteres umodne celler i forskjellige organer og vev, og differensieres deretter til blodceller, myocytter, adipocytter, kondrocytter og fibroblaster. Følgelig oppstår det signalregulerende interaksjoner i lokale vevssoner mellom ikke-engagerte og engagerte stromale progenitorceller, samt mellom dem og de omkringliggende modne cellene. Det antas at differensiering induseres av parakrine regulatoriske faktorer av mesenkymal og ikke-mesenkymal opprinnelse (vekstfaktorer, eikosanoider, ekstracellulære matriksmolekyler), som gir romlige og tidsmessige forbindelser i mikromiljøet til multipotente mesenkymale progenitorceller. Derfor bør lokal skade på mesenkymalt vev føre til dannelse av soner i mikromiljøet til multipotente mesenkymale stamceller som er kvalitativt forskjellige fra komplekset av regulatoriske signaler i intakt vev, der fysiologiske snarere enn reparative regenereringsprosesser forekommer. Denne forskjellen er ekstremt viktig når det gjelder spesialisering av den cellulære fenotypen i det normale og skadeinduserte mikromiljøet.

I følge konseptene er det her mekanismene bak den grunnleggende forskjellen mellom de to kjente prosessene - fysiologisk regenerering og inflammatorisk proliferasjon - er innebygd. Den første av dem ender med restaureringen av den spesialiserte cellulære sammensetningen av vevet og dets funksjon, mens resultatet av implementeringen av proliferasjonsprosessen er dannelsen av modne bindevevselementer og tap av funksjon i den skadede vevsområdet. For å utvikle optimale programmer for bruk av multipotente mesenkymale stamceller i regenerativ-plastisk medisin, er det derfor nødvendig med en grundig studie av egenskapene til virkningen av mikromiljøfaktorer på differensieringen av MSC-er.

Avhengigheten av strukturen i stamcellerommet av cellulære para- og autokrine regulatorer, hvis uttrykk moduleres av eksterne signaler, er uten tvil. Blant funksjonene til regulatoriske faktorer er de viktigste kontrollen av asymmetrisk deling av MSC-er og uttrykket av gener som bestemmer stadiene av forpliktelse og antall celledelinger. Eksterne signaler, som videre utvikling av MSC-er avhenger av, leveres av deres mikromiljø. I en umoden tilstand prolifererer MSC-er over lang tid, samtidig som de opprettholder evnen til å differensiere til linjer av adipocytter, myofibroblaster, hematogent vevsstroma, brusk og beinceller. Det er fastslått at en begrenset populasjon av CD34-negative stromale cellulære elementer som sirkulerer i blodet, returnerer fra den generelle blodbanen til benmargsstroma, hvor de transformeres til linjer av CD34-positive hematopoietiske stamceller. Disse observasjonene antyder at resirkulering av progenitor-mesenkymale celler i blodbanen opprettholder vevsbalansen av stromale stamceller i forskjellige organer ved å mobilisere et felles basseng av umodne stromale elementer i benmargen. Differensiering av MSC-er til celler med flere mesenkymale fenotyper og deres deltakelse i regenerering eller reparasjon av bein, brusk, fettvev og sener in vivo har blitt bevist ved bruk av adoptive overføringsmodeller i forsøksdyr. Ifølge andre forfattere kombineres fjern migrasjon av MSC-er langs det vaskulære laget med kortdistanse eller lokal bevegelse av multipotente mesenkymale stamceller i vevet under bruskreparasjon, muskelregenerering og andre gjenopprettende prosesser.

Lokale stamreserver i stromalvevsbasen fungerer som en kilde til celler i prosessene med fysiologisk vevsregenerering og etterfylles ved fjerntransport av MSC-er når stamressurser i stromalvevet forbrukes. Imidlertid, i tilstander med behov for nødmobilisering av reparativt cellulært potensial, for eksempel ved polytraume, deltar hele MSC-sjiktet i prosessene med reparativ regenerering, og mesenkymale stamceller i benmargen rekrutteres til periferien gjennom den generelle blodstrømmen.

Mesenkymal stamcelletransplantasjon

Visse paralleller kan spores mellom prosessene for fysiologisk vevsregenerering og deres dannelse under intrauterin utvikling. I menneskelig og pattedyrs embryogenese skjer dannelsen av ulike typer spesialiserte celler fra ekto-, meso- og endodermale bassenger av kimlag, men med obligatorisk deltakelse fra mesenkymet. Det løse cellulære nettverket av embryonalt mesenkymalt vev utfører en rekke regulatoriske, metabolske, rammeverksmessige og morfogenetiske funksjoner. Legging av provisoriske organer skjer først etter kondensering av mesenkymet på grunn av den klonogene veksten av stamceller, som genererer de primære morfogenetiske signalene for organogenese. Stromale derivater av det embryonale mesenkymet skaper det cellulære rammeverket til provisoriske organer og danner grunnlaget for deres fremtidige energi-plastiske forsyning på grunn av veksten av primære blod- og lymfekar. Med andre ord oppstår de stromale elementene i den mikrosirkulerende enheten til fosterorganer før dannelsen av deres strukturelle og funksjonelle enheter. I tillegg gir aktiv migrasjon av mesenkymale celler under organogenesen romlig orientering av utviklende organer ved å markere deres volumgrenser gjennom begrensning av homeotiske Hox-typer. Det stromale rammeverket fungerer også som grunnlag for sammensetningen av strukturelle og funksjonelle enheter av parenkymatøse organer, som ofte inkluderer morfogenetisk og funksjonelt helt forskjellige celler. Følgelig er mesenkymets funksjoner primære under embryogenesen og realiseres gjennom generering av regulatoriske signaler som aktiverer regional proliferasjon og differensiering av progenitor epitelceller. Embryonale mesenkymceller produserer vekstfaktorer som HGF-b, HGF-b, CSF, som parenkymale progenitorceller har tilsvarende reseptorer for. I differensiert modent vev hos en voksen organisme genererer det stromale nettverket av celler også signaler for å opprettholde levedyktigheten og proliferasjonen av progenitorceller av ikke-mesenkymal opprinnelse. Imidlertid er spekteret av stromale regulatoriske signaler i postnatal ontogenese forskjellig (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) og har som mål å sikre fysiologisk regenerering eller reparasjon av skadede vevssoner. Dessuten er de spektrale egenskapene til stromale regulatoriske faktorer i hver vevstype og til og med innenfor ett organ forskjellige. Spesielt forekommer hematopoiesen og lymfopoiesen med proliferasjon og differensiering av hematopoietiske og immunkompetente celler bare i visse organer, innenfor hvis grenser det stromale mikromiljøet opererer, og gir betingelser for modning av hematopoietiske og lymfoide celler. Evnen til hematopoietiske og lymfoide celler til å repopulere et gitt organ, proliferere og modnes i dets mikrostrukturelle nisjer avhenger av de regulatoriske faktorene i mikromiljøet.

Blant komponentene i den ekstracellulære matrisen som multipotente mesenkymale stamceller produserer, bør fibronektin, laminin, kollagen og proteoglykaner, samt CD44 (hyaluronan- og osteopontinreseptor), nevnes, som spiller en viktig rolle i å organisere intercellulære interaksjoner og danne den ekstracellulære matrisen i benmarg og benvev. Det er bevist at multipotente mesenkymale stamceller i benmarg skaper et stromalt mikromiljø som gir induktive og regulatoriske signaler ikke bare til MSC-er, men også til hematopoietiske stamceller og andre ikke-mesenkymale stamceller i benmargen. Det er kjent at deltakelsen til MSC-er i hematopoiesen bestemmes av deres evne til å differensiere til stromale celler som støtter hematopoiesen, og dette instruksjonssignalet mottas av MSC-er direkte fra hematopoietiske stamceller. Dette er grunnen til at nettverket av stromale stamceller i kultur fungerer som en næringsbase for utvikling av alle kloner av hematopoietiske celler.

I en moden organisme er intensiteten av hemo- og lymfopoiese i en dynamisk likevektstilstand med "forbruket" av modne blodceller og immunsystemceller i periferien. Siden stromale celler i benmargen og lymfoide organer fornyes ekstremt sjelden, forekommer det ikke betydelig omstrukturering av stromale strukturer i dem. Systemet kan bli tatt ut av dynamisk likevekt ved mekanisk skade på hvilket som helst av hemo- eller lymfopoieseorganene, noe som fører til ensartede sekvensielle endringer som ikke bare og ikke så mye angår de hematopoietiske eller lymfoide elementene som de stromale strukturene til det skadede organet. I prosessen med reparativ regenerering dannes først den stromale basen, som deretter gjenoppbygges av hematopoietiske eller immunkompetente celler. Dette lenge kjente faktum gjør posttraumatisk regenerering til en praktisk modell for å studere det stromale mikromiljøet til hematopoietiske organer. Spesielt brukes mekanisk tømming av medullærhulen i rørformede bein til å studere reparativ regenerering av benmarg - curettage, som muliggjør rask og effektiv fjerning av hematopoietisk vev fra dynamisk likevektstilstand. Ved studier av prosessene for reparativ regenerering av de hematopoietiske og stromale komponentene i benmarg etter mekanisk tømming av medullærhulen i tibia hos marsvin, ble det funnet ingen direkte korrelasjon mellom indeksene for regenerering av hematopoietiske og stromale celler (antall hematopoietiske celler, konsentrasjon og antall stromale stamceller). I tillegg viste det seg at en økning i populasjonen av stromale stamceller skjer tidligere etter curettage, og stromale fibroblaster blir selv fosfatasepositive, noe som er typisk for osteogent vev. Det er også fastslått at utskrapning av 3–5 rørformede bein fører til vekst av denne cellepopulasjonen i benmargen til ikke-opererte bein og til og med i milten, som hos marsvin er et utelukkende lymfopoietisk organ.

Det morfologiske bildet av reparative prosesser i beinmargen til kurerte skinneben hos marsvin samsvarer generelt med dataene beskrevet i litteraturen innhentet i eksperimenter på dyr av andre arter, og dynamikken i endringer som oppstår etter fjerning av hematopoietisk vev er den samme for alle dyrearter, og forskjellen gjelder kun tidsparametre. Morfologisk består faserekkefølgen for hematopoiese-restaurering i det tømte medullære hulrommet av suksessive prosesser med blodpropporganisering, dannelse av grovt fibrøst beinvev, dets resorpsjon, utvikling av sinusoider og dannelse av retikulært stroma, som deretter gjenbefolkes av hematopoietiske elementer. I dette tilfellet øker antallet hematopoietiske stamceller i prosessen med regenerering av beinmargsvev parallelt med økningen i innholdet av hematopoietiske stamceller.

Yu. Gerasimov og medforfattere (2001) sammenlignet endringer i antall hematopoietiske celler og antall stromale progenitorceller i individuelle faser av regenereringsprosessen. Det viste seg at kvantitative endringer i benmargsceller i kurert bein samsvarer med dynamikken i de morfologiske egenskapene til regenerering. Forfatterne forbinder reduksjonen i celleinnholdet i regenereringen i løpet av de første tre dagene med døden av hematopoietiske celler på grunn av den ugunstige effekten av mikromiljøet skapt av det prolifererende retikulære vevet i den bevarte benmargen i epifyseregionen, samt med dannelsen av osteoidvevsfokus i sistnevnte og vaskulær skade under kuretasje. På den 7.-12. dagen sammenfaller en økning i nivået av kjerneholdige celler med forekomsten av individuelle fokus for myeloid hematopoiesis i sonene for proliferasjon av stromale elementer. På den 20. dagen dukker det opp betydelige områder med regenerert benmarg og velutviklede bihuler, noe som er ledsaget av en betydelig økning i det totale antallet celler. Imidlertid er antallet hematopoietiske elementer i denne perioden 68 % av kontrollnivået. Dette er i samsvar med tidligere publiserte data som viser at antallet hematopoietiske celler etter utskrapning når normen først på den 35.–40. dagen etter operasjonen.

I den tidlige posttraumatiske perioden er hovedkilden for gjenoppretting av hematopoiesen lokale cellulære elementer som er bevart under skraping. I senere stadier er hovedkilden for regenerering av hematopoietisk vev i benmargen stamceller som repopulerer frie stromale soner. Når det gjelder individuelle kategorier av stromale celler (endotel, retikulær og osteogen), er kildene som sikrer deres dannelse under reorganiseringen av benmargshulen fortsatt uklare. Resultatene av studien av Yu. V. Gerasimov og medforfattere (2001) indikerer at i benmargen som er bevart etter skraping, er konsentrasjonen av celler som danner fibroblasterkolonier betydelig høyere enn i normal benmarg. Forfatterne mener at skraping resulterer i en mer intensiv selektiv utvasking av hematopoietiske celler sammenlignet med kolonidannende stromale celler, som deltar i dannelsen av stroma og er sterkere assosiert med hovedsubstansen enn hematopoietiske celler.

Dynamikken i endringen i antall celler som danner fibroblastkolonier korrelerer med intensiteten av osteogeneseprosesser, påfølgende resorpsjon av bentrabekler og dannelse av retikulært stroma, som er befolket av hematopoietiske celler. De fleste stromale progenitorceller danner under de spesifiserte regenereringsperiodene grovt fibrøst beinvev og retikulært stroma. Ved lårbensfrakturer under forhold med langvarig osteosyntese øker konsentrasjonen og antallet celler som danner fibroblastkolonier på den 5. dagen i regenereringssonen, og i løpet av perioden med intensiv beindannelse øker antallet deres med 6 ganger. Det er kjent at benmargsceller som danner fibroblastkolonier har osteogene egenskaper. Antallet stromale progenitorceller øker før det kurerte benmargsterritoriet er bundet av hematopoietiske celler. Dette stemmer godt overens med dataene om at stromale celler sørger for dannelsen av et hematopoietisk mikromiljø. Tilsynelatende tilsvarer etableringen av et hematopoietisk mikromiljø et visst nivå av stromal vevsregenerering, og antallet hematopoietiske celler øker med utvidelsen av den stromale plattformen som er egnet for hematopoiesis.

Av største interesse er forfatternes data om at antallet stromale progenitorceller i de fjerne delene av skjelettet øker umiddelbart etter kuretasje. Fra den sjette timen og frem til den tjuende dagen observeres en mer enn dobling i både konsentrasjonen og antallet celler som danner fibroblastkolonier i den kontralaterale tibia. Mekanismen bak dette fenomenet er sannsynligvis assosiert med det faktum at massiv benmargsskade fører til dannelse av et stort antall blodpropper med samtidig ødeleggelse av et betydelig antall blodplater og frigjøring av blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) i blodet, som er kjent for å forårsake proliferasjon av celler som danner fibroblastkolonier lokalisert i kroppen utenfor den proliferative poolen. I forsøk på kaniner fremmer lokal administrering av MSC-er restaureringen av bruskvev i det kirurgisk skadede kneleddet, noe som kan være assosiert med dannelsen av kondrocytter som stammer fra de injiserte MSC-ene. Imidlertid forbedres reparativ regenerering av beindefekter hos laboratorierotter betydelig ved bruk av mesenkymale stamceller innkapslet i et keramisk rammeverk. Derfor kan det antas at hvis ikke RBOC, så utøver en annen faktor som stammer fra skadede stromale celler en fjern stimulerende effekt på proliferasjonen av mesenkymale stamceller i intakte benmargssoner og stimulerer deres migrasjon til benmargsdefektområdet. Dette motsies igjen av litteraturdata fra tidligere år som indikerer at stromale celler som er ansvarlige for mikromiljøet, i motsetning til hematopoietiske celler, ikke er i stand til å migrere og stammer fra lokale kilder.

Resultatene fra studien av Yu. Gerasimov og medforfattere (2001) indikerer likevel at mekanisk traume ikke bare forårsaker en skarp omstrukturering av stromalvevet i det kurerte beinet, men også betydelige endringer i stroma i fjerne intakte bein, dvs. at det er en systemisk respons i stromalvevet på lokalt traume. Når polytraume påføres – multippel kuretasje – forsterkes dessuten denne reaksjonen og observeres ikke bare i det opererte beinet og fjerne deler av skjelettet, men også i lymfoide organer, spesielt i milten. Mekanismen bak en slik systemisk respons i stromalvevet i benmargen og milten på lokalt traume og polytraume er fortsatt ukjent. Det antas at denne prosessen er assosiert med virkningen av en humoral faktor som skilles ut av det mesenkymale stroma i medullærhulen i benmargen. Muligheten for produksjon av en organuspesifikk humoral faktor som er ansvarlig for proliferasjonen av celler som danner fibroblastkolonier, av stromale celler i benmarg og milt, fremgår av data om deres kolonistimulerende aktivitet i monolagskulturer av benmarg.

I denne forbindelse er det verdt å merke seg at ved systemisk administrering av multipotente mesenkymale progenitorceller, repopulerer deres derivater ikke bare benmarg, men også annet vev, noe som spesielt brukes til genterapi. Det har blitt vist at ved intravenøs administrering av store mengder MSC-er med et villtypegenom til mus med en mutasjon i kollagen I-genet, erstatter donorceller opptil 30 % av cellene i bein- og bruskvev hos mottakere, og transfekterte musemesenkymale stamceller som utskiller humant IL-3 støtter effektivt hematopoiesen i 9 måneder ved samtidig administrering med humane hematopoietiske stamceller til immunsviktige mus.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetisk modifisering av mesenkymale stamceller

Blant suksessene med eksperimentell genetisk modifisering av MSC-er er det verdt å merke seg transfeksjonen av faktor IX-genet inn i humane MSC-er med påfølgende overføring av transfektante celler til immunsviktige mus, noe som fører til forekomst av antihemofil faktor B i blodet i 8 uker etter transplantasjon. I dette eksperimentet ble posttranslasjonell modifisering av faktor IX med y-glutamylkarboksylase utført i de transfekterte cellene. Transduksjon av MSC-er med en retroviral vektor som koder for human faktor IX var mindre vellykket - påfølgende administrering av disse cellene til en hund med hemofili B ga et terapeutisk nivå av faktor IX, og opprettholdt normal intensitet av koagulasjonshemostase, i bare 12 dager.

Transplantasjon av mesenkymale stamceller inn i hjerneparenkym hos dyr har vist at umodne donorceller transformeres til både nevrale og gliale populasjoner. Innpoding av nevrale derivater fra sunt donormesenkymalt vev gjør det teoretisk mulig å korrigere genetiske abnormiteter i hjernemetabolismen hos pasienter med Gauchers sykdom og andre forstyrrelser i lipid-, gangliosid- eller karbohydratmetabolismen.

Det eksperimentelle søket etter betingelser for transdifferensiering av stromale stamceller fra benmarg til progenitorceller fra nervevev og levervev pågår. Forskernes oppmerksomhet er fokusert på kombinasjoner av differensieringsindusere og spesielle kondisjonerte medier. Spesielt for å isolere primærkulturen av stromale celler, sås benmargsceller vasket og resuspendert i DMEM/F12 (1/1) kulturmedium med 10 % føtalt kalveserum til en tetthet på 200 000/cm2. Etter 24 timer fjernes ikke-adherente celler, og fibroblastlignende celler festet til plasten dyrkes i én uke. For differensiering av benmargsstromale celler til nevroblaster brukes et kondisjonert medium oppnådd ved tre dagers dyrking av primærkulturen av museembryonale fibroblaster, samt DMEM/F12-medium (1/1) med 2 % føtalt kalveserum og tilsetning av 20 ng/ml NF eller 10-6 M retinsyre (nevroinducere som brukes til nevral differensiering av muse- og humane embryonale stamceller). Differensiering av benmargsstromale celler til hepatocyttforløperceller induseres i et kondisjonert medium laget som et resultat av tre dagers dyrking av primærkulturen av museembryonale leverceller i DMEM/F12-medium (1/1) med tilsetning av 10 % føtalt kalveserum.

Her bør det igjen bemerkes at de kolonidannende cellene i benmargsstroma er heteromorfe og kan deles inn i to typer. Den første typen omfatter fibroblastlignende celler som danner filopodier med store kjerner og en eller to nukleoler. Den andre typen er representert av små spindelformede celler. Når man dyrker celler av begge typer i et kondisjonert medium oppnådd på et materlag av primære museembryonale fibroblaster, dukker celler som ligner på nevroblaster opp i kulturen på den 3. til 4. dagen. På dette stadiet har de oftest en spindelformet form med en eller to lange utløpere som ender i filopodier. Mindre vanlige er pyramideformede eller stellatceller med korte dendritter. Dendrittene til noen nevroblaster har karakteristiske utvidelser (vekstknopper) og grener i sin distale del, mens andre har tydelige vekstkjegler med filopodier, gjennom hvilke dendrittene vokser. Lignende morfologiske trekk (knopper og vekstkjegler med filopodier) som er iboende i nevroblaster som differensierer til nevroner, har blitt beskrevet i detalj i studier om nevrogenese. Basert på dette konkluderer noen forfattere med at cellene de fant i kulturen er nevroblaster. Spesielt fant E. Shchegelskaya og medforfattere (2002) etter å ha dyrket en primærkultur av stromale celler i to uker i et kondisjonert medium som ble byttet hver 3. til 4. dag at noen av cellene prolifererte mens de opprettholdt en udifferensiert tilstand. Utad lignet slike celler fibroblaster og ble oppdaget i kulturen sammen med differensierende nevroblaster. Majoriteten av cellene (ca. 80 %) var på forskjellige stadier av differensiering til celler i nervevevet, primært til nevroner. De dendrittiske prosessene til disse cellene var i nær kontakt med hverandre, slik at cellene gradvis dannet deler av nervenettverket på substratet i form av lange flercellede tråder. De dendrittiske prosessene i nevroblaster ble betydelig lengre, noen av dem oversteg lengden på selve nevronkroppen med 8–10 ganger. Andelen pyramideformede og stellatceller økte gradvis. Dendrittene i stellatcellene forgrenet seg. Ifølge forfatterne tilsvarer den senere differensieringen av pyramideformede og stellatceller sammenlignet med spindelformede celler rekkefølgen av stadier i normal nevrogenese hos dyr. Som et resultat konkluderer forfatterne med at stromale stamceller fra benmarg gjennomgår indusert nevrogenese, der alle tre hovedtyper nevroner dannes fra nevroblaster in vitro. Nervecelleforløpere ble også påvist under dyrking av stromale stamceller fra benmarg i 3–4 dager i et medium med 2 % føtalt serum og 20 ng/ml LIF. Men i dette tilfellet delte stamcellene seg veldig sakte, nevroblastdifferensiering forekom bare i 30 % av tilfellene, og de dannet ikke nevrale nettverk. Ved å bruke retinsyre som en av induserne av nervecelledifferensiering, oppnådde forfatterne opptil 25–30 % av nervecellene i kulturen,med hovedsakelig gliale elementer - astrocytter og oligodendrocytter. Nevroner utgjorde bare en tredjedel av alle nerveceller, selv om de var representert av alle tre typer: spindelformede, pyramideformede og stellatceller. På den 6. dagen med dyrking av stromale celler i et medium med retinsyre ble nervecellene mer differensierte, og aksoner ble funnet i individuelle pyramideformede nevroner, som i normal nevroontogenese opptrer senere enn dannelsen av dendrittiske prosesser. Ifølge forfatterne har retinsyreinduksjonsmetoden sine fordeler, til tross for det lave utbyttet av nerveceller: oligodendrocytter og astrocytter utfører myeliniserende og ernæringsmessige funksjoner under veksten av dendritter og aksoner og er nødvendige for normal dannelse av nervevev. Derfor er det bedre å bruke en suspensjon av nevroner beriket med gliaceller for reparasjon av skadede områder in vivo.

I den andre serien med eksperimenter forsøkte forfatterne å indusere differensiering av benmargsstromale celler til leverceller. Etter tre dager med dyrking av benmargsstromale stamceller i et kondisjonert medium oppnådd ved inkubering av museembryonale hepatocytter, ble det funnet store, sfæriske celler, ofte binukleære, med cytoplasmatiske inklusjoner av varierende størrelse. Disse cellene var på forskjellige stadier av differensiering og varierte i størrelse, antall kjerner og inklusjoner i cytoplasmaet. Glykogen ble påvist i de fleste av disse cellene, og på grunnlag av dette identifiserte forfatterne dem som hepatocyttforløperceller. Siden ingen celler som ligner på nevroblaster ble funnet i kulturen, ble det konkludert med at det kondisjonerte mediet oppnådd som et resultat av dyrking av embryonale hepatocytter manglet differensieringsfaktorer for nerveceller og omvendt inneholdt faktorer som induserer differensiering av benmargsstromale celler til hepatocyttforløperceller. Avslutningsvis antyder forfatterne tilstedeværelsen av pluripotens i benmargsstromale celler, siden de differensierer in vitro til nerve- eller levervevsceller avhengig av det spesifikke kondisjonerte mediet og induserne som brukes.

Enkelte studier har riktignok vist at stromale celler i benmargen differensieres korrekt til kardiomyocytter, brusk, bein og nervevevsceller. Det finnes bevis for at det blant benmargsceller finnes populasjoner av stamceller som er i stand til å differensiere til hepatocytter. I lys av disse dataene kan resultatene av de ovennevnte eksperimentene på mus fortsatt anses som en ytterligere bekreftelse på tilstedeværelsen i benmargen av pluripotente mesenkymale stamceller som er i stand til å differensiere til celler fra forskjellige vev i en voksen organisme.

Mesenkymal stamcelletransplantasjon

I klinisk transplantasjon kan humane mesenkymale stamceller brukes til å sikre ekspansjon av hematopoietiske stamceller, så vel som deres tidlige, prededikerte etterkommere. Spesielt akselererer introduksjonen av autologe hematopoietiske stamceller og MSC-er til kreftpasienter etter høydose kjemoterapi gjenopprettelsen av antall nøytrofiler og blodplater i perifert blod. Allo- og autologe transplantasjoner av mesenkymale stamceller brukes til å behandle multippelt myelom, aplastisk anemi og spontan trombocytopeni - sykdommer assosiert med en primær defekt i stroma i hematopoietisk vev. Effektiviteten av celleterapi ved onkohematologisk patologi er i mange tilfeller høyere ved samtidig introduksjon av stromale og hematopoietiske stamceller, noe som manifesterer seg ved en reduksjon i den postoperative perioden med hematopoiese-gjenoppretting, en reduksjon i antall dødelige utfall på grunn av ikke-selektiv ødeleggelse av regionale og sirkulerende kreftceller, der pasientens egne hematopoietiske stamceller også dør. Mulighetene for å bruke MSC-er og andre multipotente mesenkymale stamceller i klinisk praksis skyldes den relative lettheten ved å utvinne dem fra benmargsaspirater, utvidelse i kultur og transfeksjon av terapeutiske gener. Samtidig kan lokal implantasjon av multipotente mesenkymale stamceller brukes til å kompensere for lokale vevsdefekter, og ved systemiske dysfunksjoner i vev av mesenkymal opprinnelse er det ikke utelukket at de introduseres i den generelle blodbanen.

Forfatterne av verk der utsiktene for bruk av MSC-er for lokal, systemisk transplantasjon og genterapi analyseres fra et stromal cellebiologisk synspunkt, er mer forsiktige i sin resonnement. Postnatal benmarg blir tradisjonelt sett på som et organ som består av to hovedsystemer av klart definerte cellelinjer - selve det hematopoietiske vevet og det støttende stromaet som er assosiert med det. Derfor ble mesenkymale stamceller fra benmarg i utgangspunktet ansett utelukkende som en kilde til stromal basis for produksjon av regulatoriske faktorer i det hematopoietiske mikromiljøet. Deretter vendte forskernes oppmerksomhet mot å studere MSC-enes rolle som en stamkilde for skjelettvev. De nyeste dataene indikerer et uventet potensial for differensiering av stromale celler fra benmarg med dannelse av nerve- eller muskelvev. Med andre ord viser mesenkymale stamceller transgermal plastisitet - evnen til å differensiere til celletyper som fenotypisk ikke er relatert til cellene i det opprinnelige vevet. Samtidig forblir noen aspekter ved biologien til benmargsstromale celler uklare og uavklarte, både generelt biologiske termer og i individuelle detaljer, inkludert identifisering, natur, opprinnelse, utvikling og funksjon in vivo av benmargsstromale celler, samt det tillatte differensieringspotensialet ex vivo og mulighetene for terapeutisk bruk in vivo. Dataene som er innhentet om potensialet til MSC-er, samt resultatene av studier av det regenerative potensialet til andre stamceller, står i sterk motsetning til dogmene som er etablert i biologien.

Når de dyrkes ved lav tetthet, danner stromale stamceller fra benmarg distinkte kolonier, hver avledet fra en enkelt progenitorcelle. Prosentandelen av stromale progenitorceller i kjerneholdige benmargceller, bestemt av kolonidannende evne, er sterkt avhengig av både kulturforhold og MSC-arter. For eksempel, hos gnagere er tilstedeværelsen av bestrålte benmargsfødeceller og serum i kulturen absolutt nødvendig for å oppnå maksimalt antall stromale progenitorceller, mens hos mennesker er den kolonidannende effektiviteten til mesenkymale stamceller uavhengig av både fødemediet og kulturmediet. Antallet kjente mitogene faktorer som stimulerer stromale progenitorceller i stromal celledeling er begrenset. Disse inkluderer PDGF, EGF, FGF, TGF-b og IGF1. Under optimale kulturforhold kan polyklonale MSC-linjer tåle mer enn 50 celledelinger in vitro, noe som gjør det mulig å oppnå milliarder av benmargsstromale celler fra 1 ml av aspiratet.

Populasjonen av benmargsstromale celler er imidlertid heterogen, noe som manifesteres av både variasjon i kolonistørrelser, ulik dannelsesrate og en variasjon i cellulær morfologi, som dekker området fra fibroblastlignende spindelformede til store flate celler. Under utviklingen av slike kulturer observeres også fenotypisk heterogenitet etter 20 dager. Noen kolonier er preget av høy ekspresjon av alkalisk fosfatase, andre uttrykker det ikke i det hele tatt, og kolonier av den tredje typen er fosfatasepositive i den sentrale regionen og fosfatase-negative i periferien. Individuelle kolonier danner knuter av beinvev (starten av matriksmineralisering markeres ved farging med alizarinrødt eller for kalsium i henhold til Van Koss). I andre kolonier forekommer fettopphopning, identifisert ved G-farging med oljerødt. Sjeldnere danner kolonier av mesenkymale stamceller brusk farget med Alcianblått).

Etter ektopisk transplantasjon til forsøksdyr danner polyklonale MGK-linjer ektopisk bein med et retikulært stroma assosiert med myelopoiesen og adipocytter, og, sjeldnere, med bruskvev. Når monoklonale linjer av benmargsstromale celler transplanteres, observeres kimærisme i noen tilfeller, der de novo-benet består av beinvevsceller, inneholder stroma og adipocytter av donoropprinnelse, mens cellene i den hematopoietiske avstamningen og det vaskulære systemet er avledet fra mottakeren.

Resultatene fra disse studiene bekrefter stamnaturen til benmargsstromale stamceller som den klonale linjen ble avledet fra. De indikerer også at ikke alle celler som er klonogene i kultur, er virkelig multipotente stamceller. Noen forskere mener, og vi deler deres oppfatning, at den mest pålitelige informasjonen om det reelle differensieringspotensialet til individuelle kloner bare kan oppnås in vivo etter transplantasjon, og ikke ved å bestemme fenotypen til deres derivater in vitro. Ekspresjon i kultur av fenotypiske markører for osteo-, kondro- eller adipogenese (bestemt av mRNA eller ved histokjemiske teknikker) og til og med produksjonen av mineralisert matriks gjenspeiler ikke graden av pluripotens til en individuell klon in vivo. Derfor er identifisering av stamceller i en gruppe stromale celler bare mulig a posteriori, under de passende forholdene i en biologisk transplantasjonsanalyse. Spesielt observeres kondrogenese svært sjelden i åpne transplantasjonssystemer, mens bruskdannelse langt fra er uvanlig i lukkede systemer som diffusjonskamre eller in vitro-mikromassekulturer av stromale celler, hvor lokalt lavt oksygentrykk oppnås, noe som fremmer dannelsen av bruskvev. Derfor påvirker selv transplantasjonsteknikken, så vel som uspesifikke in vitro-kulturforhold, omfanget av MSC-differensiering betydelig.

Eksperimentell transplantasjon under spesifiserte eksperimentelle forhold er gullstandarden for å bestemme differensieringspotensialet til benmargsstromale celler og et nøkkelelement i deres identifisering. Historisk sett er studier på benmargsstromale celletransplantasjoner assosiert med det generelle problemet med benmargstransplantasjon. Det har blitt fastslått at det hematopoietiske mikromiljøet skapes ved transplantasjon av benmargsstromale cellelinjer og gir ektopisk utvikling av hematopoietisk vev i transplantasjonssonen. Opprinnelsen til mikromiljøet fra donoren, og det hematopoietiske vevet fra verten, lar oss betrakte ektopisk bein som en ekte "invertert" benmargstransplantasjon. Lokal transplantasjon av benmargsstromale celler fremmer effektiv korrigering av beindefekter, mer uttalt enn ved spontan reparativ regenerering. Flere prekliniske studier på eksperimentelle modeller har overbevisende vist muligheten for å bruke benmargsstromale celletransplantasjoner i ortopedi, selv om det mest nøye arbeidet og analysen er nødvendig for å optimalisere disse metodene, selv i de enkleste tilfellene. Spesielt er de optimale forholdene for ekspansjon av osteogene stromale celler ex vivo ennå ikke etablert, strukturen og sammensetningen av den ideelle bæreren, samt antallet celler som er nødvendige for volumetrisk beinregenerering, forblir uutviklet.

I tillegg til bruk av ex vivo-ekspanderte benmargsstromale celler for regenerering av vev av mesenkymal opprinnelse, åpner den uortodokse plastisiteten til MSC-er for potensielle bruksområder for regenerering av nerveceller eller levering av genprodukter til sentralnervesystemet. I prinsippet forenkler dette celleterapi for skade på nervesystemet, siden det ikke er behov for å skaffe autologe humane nevrale stamceller. Potensielle bruksområder for benmargsceller for generering av kardiomyocytter og myogene progenitorceller av både ekte stromal og ekstrastromal opprinnelse har blitt rapportert.

Det utføres eksperimenter med systemisk transplantasjon av stromale celler fra benmarg for behandling av vanlige skjelettsykdommer. Det er ingen tvil om at stromale celler fra benmarg er den populasjonen som er ansvarlig for genetiske lidelser i skjelettsykdommer, noe som illustreres godt av vektoroverføringen av genetisk informasjon ved bruk av disse cellene, som fører til dannelsen av patologisk beinvev hos forsøksdyr. Imidlertid er stromale cellers evne til å implantere, innpode, proliferere og differensiere i skjelettbein etter introduksjon i den generelle blodbanen ennå ikke bevist.

Dette skyldes delvis at stroma ikke transplanteres sammen med det hematopoietiske vevet ved standard benmargstransplantasjon, så strenge kriterier for å vurdere vellykket innpoding av systemisk administrerte stromale celler er ennå ikke utviklet. Det bør huskes at tilstedeværelsen av markørgener i vevsekstrakter eller isolering av celler av donoropprinnelse i kultur ikke indikerer innpoding av cellene, men bare deres overlevelse. Selv intraarteriell injeksjon av benmargsstromale celler i en museben kan føre til praktisk talt null innpoding, til tross for at celler av donoropprinnelse finnes i stort antall i benmargens mikrovaskulatur. Dessverre beskrives slike celler vanligvis som "innpodet" bare på grunnlag av deteksjon av markørgener for donorceller i ex vivo-kultur. I tillegg må det fremlegges overbevisende bevis for langsiktig integrering av differensierte og funksjonelt aktive celler av donoropprinnelse i vevene som studeres. I mange publiserte artikler som rapporterer om innpoding av benmargsstromale celler i skjelettet, er fraværet av klare data av denne typen påfallende. Det bør imidlertid bemerkes at noen korrekte dyreforsøk faktisk har etablert en begrenset, men reell engraftment av stromale stamceller etter systemisk administrering.

Disse dataene stemmer overens med resultatene fra studier om muligheten for å levere myogene stamceller fra benmarg til muskler via det vaskulære systemet. Det bør imidlertid ikke glemmes at både skjelett- og muskelvev dannes under utvikling og vekst basert på ekstravaskulære cellebevegelser som bruker migrasjonsprosesser som ikke involverer blodsirkulasjon. Hvis det finnes en uavhengig sirkulasjonsvei for å levere stamceller til fastfasevev, er det mulig å anta eksistensen av fysiologisk sirkulerende mesenkymale stamceller? Hva er opprinnelsen til disse cellene i både den utviklende og postnatale organismen, og hvordan trenger de inn i karveggen? Løsningen på disse spørsmålene virker absolutt nødvendig og krever den mest nøye prekliniske analysen. Selv etter at svarene på disse spørsmålene er funnet, vil problematiske kinetiske aspekter knyttet til skjelettvekst og ombygging av bindevev forbli uavklarte. Samtidig ser behandling av osteogeneseforstyrrelser ved å erstatte hele populasjonen av muterte skjelettstamceller med friske stromale elementer ut til å være et reelt klinisk potensial. I dette tilfellet kan lokale bruddsoner eller deformasjoner på grunn av patologisk osteogenese, samt destruktive endringer i beinvev, korrigeres ved bruk av stromale stamceller dyrket in vitro. Derfor er det tilrådelig å fokusere fremtidig forskning på problemene med transformasjon eller genetisk korreksjon av autologe muterte osteogene stamceller ex vivo.

Genteknologi av celler, kortsiktig eller permanent, har blitt grunnlaget for cellulær og molekylærbiologi, kilden til mange vitenskapelige oppdagelser angående individuelle proteiners rolle i cellulær metabolisme in vitro og in vivo. Bruken av molekylære teknologier for korrigering av arvelig patologi og menneskelige sykdommer er svært lovende for praktisk medisin, siden egenskapene til benmargsstromale stamceller gjør det mulig å utvikle unike transplantasjonsordninger for korrigering av genetiske sykdommer i skjelettet. Samtidig kan mesenkymale forløperceller lett utvinnes fra den fremtidige mottakeren, de er mottakelige for genetisk manipulasjon og er i stand til å formere seg i store mengder på kort tid. Bruken av mesenkymale stamceller gjør det mulig å unngå begrensningene og risikoene forbundet med levering av genetisk informasjonsmateriale direkte til pasienten gjennom intravaskulære vektorkonstruksjoner. En lignende strategi gjelder for embryonale stamceller, men autologe postnatale benmargsstromale celler er et mer foretrukket materiale, siden introduksjonen av dem utelukker mulige immunologiske komplikasjoner etter transplantasjon. For å oppnå en kortsiktig effekt, for eksempel for å akselerere beinregenerering, er den mest optimale metoden genetisk modifisering av mesenkymale stamceller ved hjelp av elektroporering, kjemisk fusjon, lipofeksjon, plasmider og adenovirale konstruksjoner. Spesielt har viral transfeksjon inn i benmargsstromale celler BMP-2 vist seg effektiv i å akselerere beinregenerering ved eksperimentell polytraume. Opprettelsen av adenovirale vektorkonstruksjoner er å foretrekke på grunn av fraværet av toksisitet. Imidlertid er genetisk modifisering av benmargsstromale celler i dette tilfellet preget av ekstremt lav stabilitet. I tillegg krever normale transformerte benmargsstromale celler bruk av vektorbærere av genetisk informasjon som er 10 ganger mer smittsomme enn andre celletyper, noe som øker dødsprosenten for transfekterte celler betydelig.

Behandling av recessive sykdommer forårsaket av lav eller ingen biologisk aktivitet i visse gener krever langvarig eller permanent modifisering av mesenkymale stamceller, noe som krever bruk av adenoassosierte virus, retrovirus, lentivirus eller adenoretrovirale kimærer. Transportregionene til disse virusene er i stand til å overføre store DNA-transfekter (opptil 8 kb). Vitenskapelig litteratur har allerede rapportert om den eksogene biologiske aktiviteten til benmargsstromale celler transfektert med retrovirale konstruksjoner som koder for syntesen av regulatoriske og markørmolekyler - IL-3, CD2, faktor VIII, samt enzymer involvert i syntesen av L-DOPA. Selv i disse studiene påpeker forfatterne imidlertid en rekke begrensninger som må overvinnes før den praktiske anvendelsen av denne teknologien. Det første problemet er å optimalisere prosessen med MSC-modifisering ex vivo. Det er kjent at langvarig (3-4 uker) proliferasjon av benmargsstromale celler in vitro reduserer transfeksjonen deres. Samtidig er det nødvendig å gjennomføre flere transfeksjonssykluser for å oppnå et høyt nivå av genetisk modifisering av MSC-er. Det andre problemet er knyttet til varigheten av terapeutisk genuttrykk, som ennå ikke overstiger fire måneder. En naturlig reduksjon i effektiv genuttrykk skyldes promotorinaktivering og død av modifiserte celler. Med de generelle utsiktene for overføring av genetisk informasjon ved hjelp av mesenkymale stamceller, indikerer resultatene av foreløpige studier behovet for ytterligere optimalisering av ex vivo-transfeksjonsmetoder, valg av en tilstrekkelig promotor som regulerer biologisk aktivitet i ønsket retning, og en økning i evnen til modifiserte benmargsstromale celler til å selvopprettholde seg in vivo etter transplantasjon. Det bør bemerkes at bruk av retrovirale konstruksjoner for å modifisere benmargsstromale celler i ønsket retning ikke alltid krever obligatorisk innpoding. Transfekterte mesenkymale stamceller kan utføre en korrigerende funksjon mot bakgrunn av stabil opphold og uten obligatorisk aktiv fysisk inkorporering og funksjon i bindevevet. I dette tilfellet bør de betraktes som en biologisk minipumpe som in vivo produserer en faktor, hvis mangel bestemmer manifestasjonen av genetisk patologi.

Bruken av transformerte benmargsstromale celler for behandling av dominant genetisk patologi, som er karakterisert ved uttrykk av et gen med patologisk eller unormal biologisk aktivitet, er mye mer problematisk, siden det i dette tilfellet er nødvendig å blokkere overføring eller implementering av forvrengt genetisk informasjon. En av metodene for genteknologi er homolog rekombinasjon av embryonale stamceller for å skape transgene dyr. Imidlertid er det usannsynlig at den ekstremt lave graden av homolog rekombinasjon i kombinasjon med problemene med identifisering, separasjon og ekspansjon av slike rekombinanter vil bidra til den utbredte bruken av denne metoden i nær fremtid, selv om nye teknologiske metoder utvikles. Den andre tilnærmingen i genterapi av dominant patologi er basert på automatisk korreksjon av skadet DNA, siden genetiske mutasjoner kan korrigeres ved å introdusere eksogent DNA med ønsket sekvens (korte DNA-oligonukleotider eller kimære RNA/DNA-oligonukleotider), som binder seg til homologer i det skadede genomet. Det tredje alternativet innebærer å blokkere overføringen av patologisk informasjon, noe som oppnås ved bruk av spesifikt designede oligonukleotider som binder seg til et spesifikt gen for å danne en ternær spiralstruktur som eliminerer muligheten for transkripsjon.

Selv om korrigering av en genetisk sykdom på genomnivå fortsatt er den mest optimale og foretrukne terapeutiske metoden, er mRNA også en lovende vektor (muligens enda mer tilgjengelig) for å blokkere et dominant negativt gen. Proteinmolekyler med antisense-oligonukleotid eller komplette sekvenser som blokkerer mRNA-binding til det cellulære biosyntetiske apparatet har lenge blitt brukt til å hemme translasjon og/eller øke mRNA-nedbrytning. I tillegg induserer dobbelttrådet RNA rask mRNA-nedbrytning, hvis mekanisme fortsatt er uklar. Det er imidlertid usannsynlig at blott eliminering av mRNA transkribert fra et mutant allel med korte eller enkle mutasjoner vil fremme uttrykket av mRNA til det normale allelet. Et alternativ er bruk av hammerhode- og hårnålsribosynteser, som har evnen til å binde seg til svært spesifikke regioner av mRNA med påfølgende induksjon av deres spalting og inaktivering under translasjon. Muligheten for å bruke denne metoden i behandlingen av patologisk osteogenese studeres for tiden. Uansett hva målet egentlig er – genomiske eller cytoplasmatiske elementer – vil suksessen til nye genterapiteknologier bli bestemt av hvor effektivt reagenser inkluderes i stromale celler i benmargen ex vivo, det optimale valget av en spesifikk vektor og den stabile evnen mesenkymale stamceller har til å uttrykke de nødvendige faktorene in vivo.

Oppdagelsen av mesenkymale stamceller med deres uventede egenskaper skaper dermed et nytt konseptuelt opplegg for utvikling av cellelinjer. Imidlertid er det behov for ytterligere tverrfaglig forskning for å forstå den biologiske rollen til stromale stamceller, deres natur, deres evne til å transdifferensiere eller dedifferensiere, deres fysiologiske betydning under embryonal utvikling, postnatal vekst, modning og aldring, samt i menneskelige sykdommer.