Nevrale stamceller

Eksperimentelle bevis på muligheten for regenerering av CNS-celler ble innhentet mye tidligere enn oppdagelsen av embryonale stamceller i studier som viste tilstedeværelsen av celler i neocortex, hippocampus og lukteløkene i hjernen hos voksne rotter som fanger opp 3H-tymidin, dvs. er i stand til proteinsyntese og -deling. Tilbake på 60-tallet av forrige århundre ble det antatt at disse cellene er forløpere til nevroner og er direkte involvert i lærings- og hukommelsesprosesser. Litt senere ble tilstedeværelsen av synapser på nevroner dannet de novo avslørt, og de første arbeidene med bruk av embryonale stamceller for å indusere nevrogenese in vitro dukket opp. På slutten av 1900-tallet førte eksperimenter med målrettet differensiering av ESC-er til nevrale progenitorceller, dopaminerge og serotonerge nevroner til en revisjon av de klassiske ideene om pattedyrs nervecellers evne til å regenerere. Resultatene fra en rekke studier har overbevisende bevist både realiteten av omstrukturering av nevrale nettverk og tilstedeværelsen av nevrogenese gjennom hele perioden med postnatalt liv hos pattedyrorganismen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Kilder til nevrale stamceller

Humane nevrale stamceller isoleres under operasjoner på den subventrikulære regionen av de laterale ventriklene og den dentate gyrus i hippocampus, hvis celler danner nevrosfærer (nevrolekuler) i kultur, og etter dispersjon og predannelse av sistnevnte - alle de viktigste celletypene i sentralnervesystemet eller, i et spesielt medium, nye mikrosfærer. I suspensjonskulturer av dissosiert vev isolert fra de periventrikulære regionene i den embryonale hjernen, oppstår også nevrosfærer.

Markører for umodne hjerneceller inkluderer nestin, beta-tubulin III (nevronal avstamningsmarkør), vimentin, GFAP og NCAM, som identifiseres immunocytokjemisk ved hjelp av monoklonale antistoffer. Nestin (intermediært nevrofilamentprotein type IV) uttrykkes av multipotente nevroektodermale celler. Dette proteinet brukes til å identifisere og isolere multipotente nevroepiteliale progenitorceller fra CNS ved hjelp av monoklonale antistoffer Rat-401, som kan oppdage opptil 95 % av nevralrørsceller i rotteembryoer på den ellevte dagen av svangerskapet. Nestin uttrykkes ikke på differensierte etterkommere av nevrale stamceller, men er tilstede i tidlige nevrale progenitorceller, postmitotiske nevroner og tidlige nevroblaster. Denne markøren har blitt brukt til å identifisere nevroepiteliale progenitorceller og for å bevise eksistensen av stamceller i CNS. Vimentin (intermediært nevrofilamentprotein type III) uttrykkes av nevrale og gliale progenitorceller, samt nevroner, fibroblaster og glatte muskelceller. Derfor mangler begge immunocytokjemiske markørene den spesifisiteten som kreves for å identifisere nevrale stam- og progenitorceller separat. Beta-tubulin III etablerer den neuronale retningen for stamcelledifferensiering, mens type I astrocytter identifiseres ved GFAP-ekspresjon, og oligodendrocytter uttrykker spesifikt galaktocerebrosid (Ga!C).

FGF2 og EGF fungerer som mitogener for nevrale progenitorceller, og støtter proliferasjonen av udifferensierte progenitorceller i kultur med dannelsen av nevrosfærer. Delingshastigheten for nevrale stamceller øker betydelig under påvirkning av FGF2, samt ved bruk av en kombinasjon av FGF2 + EGF. De proliferative effektene av FGF2 medieres av FGF2-R1-reseptorer. Heparin øker affiniteten til FGF2-reseptorbinding og forbedrer dramatisk dens mitogene effekt på nevroepitelceller. I de tidlige stadiene av embryogenesen uttrykkes FGF2-reseptorer i rottetelencephalon, mens lokaliseringen deres i senere stadier er begrenset til ventrikkelsonen. Toppen av FGF2-R1-ekspresjon av postmitotiske celler observeres ved fullføring av den tidlige nevrogeneseperioden. Den første perioden med telencephalonutvikling er preget av et lavt nivå av EGF-reseptorekspresjon, hovedsakelig i cellene i den ventrale regionen. I senere stadier av embryogenesen øker EGF-R-ekspresjonen i dorsal retning. I gnagerhjernen har EGF en høy affinitet for den transformerende vekstfaktor beta-reseptoren (TGF-beta-R), som den fortrinnsvis binder seg til. Indirekte bevis for den funksjonelle rollen til EGF-R gis av data om kortikal dysgenese av forhjernen som oppstår i den sene perioden av embryogenesen og postnatal ontogenese, redusert forhjernefunksjon, kortikal celledød og hippocampus ektopi hos EGF-reseptor-gen-knockout-mus. I tillegg er tilstedeværelsen av TGF-a i næringsmediet absolutt nødvendig for dannelsen av nevrosfærer. Etter fjerning av vekstfaktorer fra det kondisjonerte mediet, slutter cellene å dele seg og gjennomgår spontan differensiering med dannelse av nevroner, astrocytter og oligodendroblaster.

Med dette i betraktning utføres reaggregering av dissosierte stamceller og dyrking av nevrosfærer i næringsmedier som inneholder EGF og basisk FGF eller FGF2, men uten tilsetning av serum. Det har blitt vist at EGF induserer proliferasjon av stamceller i den subependymale sonen i de laterale ventriklene, og basisk FGF fremmer proliferasjon av stamceller i striatum, hippocampus, neocortex og synsnerven i den modne hjernen. Kombinasjonen av EGF og basisk FGF er absolutt nødvendig for aktiv proliferasjon av stamceller isolert fra ependyma i den tredje og fjerde ventrikkelen i forhjernen, samt fra spinalkanalen i thorax- og lumbalryggmargen.

Etter dissosiasjon dyrkes suspensjonen av nevrale stamceller i plastskåler eller flerbrønnsplater uten klebende substrat for å øke størrelsen på de nye nevrokulene som dannes, noe som vanligvis tar omtrent 3 uker. Metoden med multippel dispersjon og reproduksjon av nevrokuler gjør det mulig å oppnå et tilstrekkelig antall lineære kloner av multipotente stamceller for intracerebral transplantasjon. Dette prinsippet er også grunnlaget for å lage en bank av stamceller isolert fra den menneskelige embryonale hjernen. Deres langsiktige (over flere år) kloning gjør det mulig å oppnå stabile linjer av nevrale stamceller, hvorfra katekolaminerge nevroner dannes under indusert differensiering.

Hvis nevrosfærer ikke dispergeres og dyrkes på klebende substrater i medier som mangler vekstfaktorer, begynner prolifererende stamceller å spontant differensiere for å danne nevrale og gliale forløperceller som uttrykker markører for alle typer nerveceller: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulin III (nevroner), GFAP (astrocytter) og CalC, 04 (oligodendrocytter). I motsetning til mus- og rotteceller utgjør nevroner mer enn 40 % av alle differensierte celler i humane nevrale stamcellekulturer (fra 1 til 5 % hos gnagere), men betydelig færre oligodendrocytter dannes, noe som er svært viktig med tanke på celleterapi av demyeliniserende sykdommer. Problemet løses ved å tilsette B104-kulturmedium, som stimulerer dannelsen av myelinproduserende celler.

Når man dyrker nevrale progenitorceller fra hjernen til menneskelige embryoer i et medium som inneholder EGF, basisk FGF og LIF, øker antallet nevrale forløperceller 10 millioner ganger. Celler som er ekspandert in vitro, beholder evnen til å migrere og differensiere til nevrale og gliale elementer etter transplantasjon inn i hjernen til modne rotter. Imidlertid er antallet delinger av multipotente forløperceller begrenset in vivo. Det har gjentatte ganger blitt bemerket at Hayflick-grensen for en "voksen" nevral stamcelle (ca. 50 mitoser) fortsatt er uoppnåelig selv i et eksperiment - celler i form av nevrosfærer beholder egenskapene sine i bare 7 måneder og bare etter 8 passasjer. Det antas at dette skyldes særegenhetene ved deres dispersjonsmetoder under passasje (trypsinisering eller mekanisk virkning), noe som reduserer cellenes proliferative aktivitet kraftig på grunn av forstyrrelse av intercellulære kontakter. Hvis man i stedet for dispersjon bruker metoden med å dele nevrosfærer i 4 deler, øker cellenes levedyktighet under passasje betydelig. Denne metoden tillater dyrking av menneskelige nevrale stamceller i 300 dager. Etter denne perioden mister imidlertid cellene mitotisk aktivitet og gjennomgår degenerasjon eller går inn i stadiet med spontan differensiering med dannelse av nevroner og astrocytter. På dette grunnlaget mener forfatteren at 30 mitoser er det maksimale antallet delinger for dyrkede nevrale stamceller.

Når humane nevrale stamceller dyrkes in vitro, dannes det hovedsakelig GABAerge nevroner. Uten spesielle betingelser gir nevrale progenitorceller opphav til dopaminerge nevroner (nødvendig for celleterapi av Parkinsons sykdom) bare i de første passasjene, hvoretter alle nevroner i kulturen utelukkende består av GABAerge celler. Hos gnagere forårsaker IL-1 og IL-11, samt fragmenter av nervecellemembraner, LIF og GDNF, induksjon av dopaminerge nevroner in vitro. Denne metodiske tilnærmingen har imidlertid vist seg å være mislykket hos mennesker. Likevel, når GABAerge nevroner transplanteres intracerebralt in vivo, under påvirkning av mikromiljøfaktorer, oppstår nerveceller med forskjellige mediatorfenotyper.

Søk etter kombinasjoner av nevrotrofiske faktorer viste at FGF2 og IL-1 induserer dannelsen av dopaminerge nevroblaster, som imidlertid ikke er i stand til å produsere dopaminerge nevroner. Differensiering av hippocampale stamceller til eksitatoriske glutamaterge og hemmende GABA-erge nevroner skjer under påvirkning av nevrotrofiner, og EGF og IGF1 induserer dannelsen av glutamaterge og GABA-erge nevroner fra nevrale progenitorceller fra menneskelige embryoer. Sekvensiell tilsetning av retinsyre og nevrotrofin 3 (NT3) til kulturen øker differensieringen av modne hjerne-hippocampale stamceller til nevroner av ulik mediatornatur betydelig, mens en kombinasjon av hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BNDF), NT3 og GDNF kan produsere pyramideformede nevroner i hippocampale og neokortikale kulturer.

Resultatene fra en rekke studier indikerer dermed at stamceller fra forskjellige hjernestrukturer, under påvirkning av lokale spesifikke vevsfaktorer, er i stand til å differensiere in vivo til nevrale fenotyper som er iboende i disse strukturene. For det andre gjør målrettet indusert differensiering av nevrale stamceller in vitro ved bruk av kloning av progenitorceller det mulig å oppnå nerve- og gliaceller med spesifiserte fenotypiske egenskaper for intracerebral transplantasjon i ulike former for hjernepatologi.

Det er ingen tvil om at pluripotente stamceller isolert fra embryoer eller det voksne sentralnervesystemet kan betraktes som en kilde til nye nevroner og brukes i klinikken for behandling av nevrologisk patologi. Hovedhindringen for utviklingen av praktisk cellulær nevrotransplantasjon er imidlertid det faktum at de fleste nevrale stamceller ikke differensierer til nevroner etter implantasjon i ikke-nevrogene soner i det modne sentralnervesystemet. For å omgå denne hindringen foreslås en svært original og innovativ metode som tillater in vitro-innhenting av en ren populasjon av nevroner fra humane føtale nevrale stamceller etter transplantasjon inn i sentralnervesystemet til en moden rotte. Forfatterne beviser at differensieringen av celler implantert med denne metoden ender med dannelsen av nevroner av den kolinerge fenotypen, noe som skyldes påvirkning av faktorer i det omkringliggende mikromiljøet. Den foreslåtte teknologien er interessant med tanke på å utvikle nye typer stamcellebasert terapi og erstatte nevroner som er skadet på grunn av skade eller nevrodegenerativ sykdom, siden kolinerge nevroner spiller en ledende rolle i utviklingen av motoriske, hukommelses- og læringsfunksjoner. Spesielt kan kolinerge nevroner isolert fra humane stamceller brukes til å erstatte motoriske nevroner som går tapt ved amyotrofisk lateral sklerose eller ryggmargsskader. For øyeblikket finnes det ingen informasjon om metoder for å produsere et betydelig antall kolinerge nevroner fra en populasjon av mitogen-preformede stamceller. Forfatterne foreslår en ganske enkel, men effektiv metode for å stimulere mitogen-preformede primære humane embryonale nevrale stamceller til å utvikle seg til praktisk talt rene nevroner etter implantasjon i både ikke-nevrogene og nevrogene soner i sentralnervesystemet hos en moden rotte. Det viktigste resultatet av arbeidet deres er omdannelsen av et tilstrekkelig stort antall transplanterte celler til kolinerge nevroner når de implanteres i midtmembranen og ryggmargen.

I tillegg foreslås det å bruke ulike kombinasjoner av følgende trofiske faktorer og kjemiske elementer for predannelse av nevrale stamceller fra den 8 uker gamle menneskelige embryonale hjernebarken til kolinerge nevroner in vitro: rekombinant basisk FGF, EGF, LIF, museaminoterminalt lydpeptid (Shh-N), trans-retinsyre, NGF, BDNF, NT3, NT4, naturlig laminin og museheparin. Den opprinnelige linjen av humane nevrale stamceller (K048) ble opprettholdt in vitro i to år og motsto 85 passasjer uten endringer i proliferative og differensierende egenskaper, samtidig som den opprettholdt en normal diploid karyotype. Udispergerte nevrosfærer fra passasjer 19–55 (uker 38–52) ble platet på poly-d-lysin og laminin og deretter behandlet med de ovennevnte faktorene i forskjellige konsentrasjoner, kombinasjoner og sekvenser. Kombinasjonen av basisk FGF, heparin og laminin (forkortet FHL) ga en unik effekt. Etter én dag med dyrking av embryonale nevrale stamceller i FHL-medium med eller uten Shh-N (kombinasjonen av Shh-N + FHL i forkortelsen SFHL), ble det observert en rask proliferasjon av store plane celler. Alle andre endagsprotokoller (som basisk FGF + laminin) førte derimot til en begrenset radial spredning av spindelformede celler, og disse cellene forlot ikke kjernen av nevrosfærene. Etter 6 dager med aktivering og påfølgende 10 dager med differensiering i B27-holdig medium ble store multipolare nevronlignende celler detektert i kanten av FHL-aktiverte sfærer. I andre protokollgrupper forble de fleste nevronlignende celler små og bipolare eller unipolare. Immunocytokjemisk analyse viste at små (< 20 μm) bipolare eller unipolare celler enten var GABAerge eller glutamaterge, mens de fleste store multipolare celler lokalisert i kanten av FHL-aktiverte nevrosfærer var kolinerge, og uttrykte markører som er karakteristiske for kolinerge nevroner (Islet-1 og ChAT). Noen av disse nevronene uttrykte samtidig synapsin 1. Som et resultat av fem serier med uavhengige eksperimenter fant forfatterne at den totale populasjonen av celler i enkeltlagssonene differensierte til TuJ1+ nevroner med 45,5 %, mens kolinerge (ChAT^) nevroner bare utgjorde 27,8 % av cellene i den samme populasjonen. Etter 10 dager med ytterligere differensiering in vitro ble det i tillegg til kolinerge nevroner funnet et betydelig antall små nevroner i de FHL-aktiverte nevrosfærene - glutamaterge (6,3 %), GABA-erge (11,3 %), samt astrocytter (35,2 %) og nestin-positive celler (18,9 %). Ved bruk av andre kombinasjoner av vekstfaktorer var kolinerge nevroner fraværende, og de marginale cellene i nevrosfærene dannet enten astrocytter eller små glutamaterge og GABA-erge nevroner. Overvåking av reserve- og aktive potensialer ved bruk av helcelle-patch-clamp-teknikken viste at etter syv dager med FHL-aktivering hadde de fleste store polypolare celler et hvilepotensial på -29,0 ± 2,0 mV i fravær av aksjonspotensial. Etter 2 uker økte hvilepotensialet til -63.6 ± 3,0 mV, og aksjonspotensialer ble observert i øyeblikket for induksjon av depolariserende strømmer og ble blokkert av 1 M tetrodotoksin, noe som indikerer den funksjonelle aktiviteten til kolinerge umodne nevroner.

Forfatterne slo videre fast at FHL- eller SFHL-aktivering in vitro i seg selv ikke resulterer i dannelse av modne nevroner, og forsøkte å fastslå om FHL- eller SFHL-preformede stamceller er i stand til å differensiere til kolinerge nevroner når de transplanteres inn i sentralnervesystemet hos modne rotter. For dette formålet ble aktiverte celler injisert i den nevrogene sonen (hippocampus) og i flere ikke-nevrogene soner, inkludert prefrontal cortex, midtre membran og ryggmarg hos voksne rotter. De implanterte cellene ble sporet ved hjelp av CAO-^^p-vektoren. OCP er kjent for å merke både cellulær ultrastruktur og cellulære prosesser (molekylært nivå) uten lekkasje og kan visualiseres direkte. I tillegg opprettholder OCP-merkede nevrale stamceller en profil av nevronal og glial differensiering identisk med den for ikke-transformerte stamceller i den embryonale hjernen.

En til to uker etter implantasjon av 5 x 104 ^aktiverte og merkede nevrale stamceller, ble de funnet i ryggmargen eller hjernen hos rotter, med OCD+ celler lokalisert hovedsakelig nær injeksjonsstedet. Migrasjons- og integrasjonsprosesser ble observert så tidlig som én måned etter transplantasjon. Migrasjonsgrensene varierte avhengig av injeksjonsstedet: ved injisering i prefrontal cortex var OCD+ celler lokalisert 0,4–2 mm fra injeksjonsstedet, mens ved implantasjon i midtmembranen, hippocampus eller ryggmargen migrerte cellene mye lengre avstander – opptil 1–2 cm. De transplanterte cellene var lokalisert i svært organiserte CNS-strukturer, inkludert frontal cortex, midtmembranen, hippocampus og ryggmargen. OCD-merkede nevrale elementer var synlige så tidlig som den første uken etter transplantasjon, og antallet økte betydelig én måned etter operasjonen. Stereologisk analyse viste en høyere overlevelsesrate for implanterte celler i ulike strukturer i hjernen, sammenlignet med ryggmargen.

Det er kjent at i de fleste vev i den voksne pattedyrorganismen er en populasjon av regionale stamceller bevart, hvis transformasjon til modne celler reguleres av spesifikke vevsfaktorer. Proliferasjon av stamceller, differensiering av progenitorceller og dannelsen av nevrale fenotyper spesifikke for en gitt hjernestruktur in vivo uttrykkes i mye større grad i den embryonale hjernen, noe som bestemmes av tilstedeværelsen av høye konsentrasjoner av morfogenetiske faktorer i det lokale mikromiljøet - nevrotrofinene BDNF, NGF, NT3, NT4/5 og vekstfaktorene FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Hvor finnes nevrale stamceller?

Det er fastslått at nevrale stamceller uttrykker glial surt fibrillært protein, som blant modne celler i den nevrale avstamningen bare finnes på astrocytter. Derfor kan astrocytiske celler være stamreserven i det modne sentralnervesystemet. Faktisk ble nevroner som stammer fra GFAP-positive forløpere identifisert i lukteløkene og dentate gyrus, noe som motsier tradisjonelle ideer om progenitorrollen til radial glia, som ikke uttrykker GFAP i dentate gyrus i voksen alder. Det er mulig at det finnes to populasjoner av stamceller i sentralnervesystemet.

Spørsmålet om lokaliseringen av stamceller i den subventrikulære sonen er også uklart. Ifølge noen forfattere danner ependymale celler sfæriske kloner i kultur som ikke er ekte nevrosfærer (som kloner av subependymale celler), siden de bare er i stand til å differensiere til astrocytter. På den annen side, etter fluorescens- eller viral merking av ependymale celler, detekteres markøren i cellene i det subependymale laget og luktlørene. Slike merkede celler in vitro danner nevrosfærer og differensierer til nevroner, astrocytter og oligodendrocytter. I tillegg har det blitt vist at omtrent 5 % av cellene i ependyma uttrykker stammarkører - nestin, Notch-1 og Mussashi-1. Det antas at mekanismen for asymmetrisk mitose er assosiert med den ujevne fordelingen av membranreseptoren Notch-1, som et resultat av at sistnevnte forblir på membranen til dattercellen lokalisert i den ependymale sonen, mens morcellen som migrerer til det subependymale laget er fratatt denne reseptoren. Fra dette synspunktet kan den subependymale sonen betraktes som en samler av progenitorforløpere til nevroner og glia dannet fra stamceller i det ependymale laget. Ifølge andre forfattere dannes det kun gliaceller i de kaudale delene av den subventrikulære sonen, og kilden til nevrogenesen er cellene i den rostral-laterale delen. I den tredje varianten gis de fremre og bakre delene av den subventrikulære sonen til de laterale ventriklene tilsvarende nevrogent potensial.

Den fjerde varianten av organiseringen av stamreserven i sentralnervesystemet virker å foretrekke, ifølge hvilken tre hovedtyper av nevrale progenitorceller skilles ut i den subventrikulære sonen - A, B og C. A-celler uttrykker tidlige nevrale markører (PSA-NCAM, TuJl) og er omgitt av B-celler, som identifiseres som astrocytter ved uttrykk av antigener. C-celler, som ikke har antigene egenskaper hos nevroner eller glia, har høy proliferativ aktivitet. Forfatteren har overbevisende bevist at B-celler er forløpere til A-celler og de novo nevroner i lukteløkene. Under migrasjon er A-celler omgitt av tråder av nevrale progenitorceller, noe som avviker betydelig fra migrasjonsmekanismen til postmitotiske nevroblaster langs den radiale glia i den embryonale hjernen. Migrasjonen ender i lukteløkene med mitotisk deling av både A- og B-celler, hvis derivater er inkorporert i de granulære cellelagene og i det glomerulære laget av hjernens luktesone.

Den utviklende embryonale hjernen mangler differensierte ependymale celler, og ventrikkelveggene inneholder prolifererende stamceller fra de ventrikulære germinale og subventrikulære sonene, hvor primære nevro- og glioblaster migrerer. Basert på dette mener noen forfattere at den subependymale regionen av den modne hjernen inneholder redusert embryonalt germinalt nevralvev bestående av astrocytter, nevroblaster og uidentifiserte celler. Sanne nevrale stamceller utgjør mindre enn 1 % av cellene i germinalsonen til den laterale ventrikkelveggen. Delvis av denne grunn, og også i forbindelse med dataene om at astrocytter i den subependymale sonen er forløpere til nevrale stamceller, utelukkes ikke muligheten for transdifferensiering av astrocytiske gliale elementer med tilegnelse av nevrale fenotypiske egenskaper.

Hovedhindringen for en endelig løsning på problemet med lokalisering av nevrale stamceller in vivo er mangelen på spesifikke markører for disse cellene. Likevel er rapportene om at nevrale stamceller ble isolert fra CNS-regioner som ikke inneholder subependymale soner - den tredje og fjerde ventrikkelen i forhjernen, spinalkanalen i thorax- og lumbalregionene i ryggmargen - svært interessante fra et praktisk synspunkt. Av spesiell betydning er det faktum at ryggmargsskade øker proliferasjonen av ependymale stamceller i den sentrale kanalen med dannelsen av progenitorceller som migrerer og differensierer til astrocytter i gliomesodermalarret. I tillegg ble det også funnet forløperceller til astro- og oligodendrocytter i den uskadde ryggmargen hos voksne rotter.

Litteraturdataene viser dermed overbevisende tilstedeværelsen i sentralnervesystemet hos voksne pattedyr, inkludert mennesker, av en regional stamreserve, hvis regenerativ-plastiske kapasitet dessverre bare er i stand til å sørge for fysiologiske regenereringsprosesser med dannelse av nye nevrale nettverk, men ikke oppfyller behovene for reparativ regenerering. Dette reiser oppgaven med å søke etter muligheter for å øke stamtressursene i sentralnervesystemet ved eksogene midler, noe som er uløselig uten en klar forståelse av mekanismene for dannelse av sentralnervesystemet i embryonalperioden.

I dag vet vi at nevrale rørstamceller er kilden til tre celletyper under embryonal utvikling - nevroner, astrocytter og oligodendrocytter, dvs. nevroner og nevroglia stammer fra en enkelt forløpercelle. Differensiering av ektodermen til klynger av nevrale progenitorceller begynner under påvirkning av produktene fra proneurale gener i bHLH-familien og blokkeres av uttrykket av reseptor-transmembranproteinderivater av Notch-familiegener, som begrenser bestemmelsen og tidlig differensiering av nevrale forløperceller. Ligandene til Notch-reseptorene er igjen transmembrane Delta-proteiner fra naboceller, på grunn av det ekstracellulære domenet som direkte intercellulære kontakter med induktiv interaksjon mellom stamceller utføres.

Den videre implementeringen av programmet for embryonal nevrogenese er ikke mindre komplekst, og det ser ut til at det bør være artsspesifikt. Resultatene fra nevroksenotransplantasjonsstudier indikerer imidlertid at stamceller har en uttalt evolusjonær konservatisme, som gjør at menneskelige nevrale stamceller er i stand til å migrere og utvikle seg når de transplanteres inn i rottehjernen.

Det er kjent at pattedyrs sentralnervesystem har en ekstremt lav kapasitet for reparativ regenerering, som kjennetegnes av fravær av tegn til fremvekst av nye cellulære elementer i den modne hjernen for å erstatte nevroner som døde som følge av skade. Ved nevroblasttransplantasjon vil imidlertid ikke sistnevnte bare innpode, proliferere og differensiere, men er også i stand til å integreres i hjernestrukturer og funksjonelt erstatte tapte nevroner. Ved transplantasjon av dedikerte nevrale stamceller var den terapeutiske effekten betydelig svakere. Slike celler har vist seg å ha lav migrasjonskapasitet. I tillegg reproduserer ikke nevrale stamceller arkitekturen til nevrale nettverk og er ikke funksjonelt integrert i mottakerens hjerne. I denne forbindelse studeres problemstillinger rundt reparativ-plastisk regenerering under transplantasjon av ikke-preformede multipotente nevrale stamceller aktivt.

I studien av M. Aleksandrova et al. (2001) var mottakerne i den første versjonen av forsøkene kjønnsmodne hunnrotter, og donorene var 15 dager gamle embryoer. En del av hjernebarken ble fjernet fra mottakerne, og mekanisk suspendert vev fra den presumptive embryonale cortex som inneholdt multipotente stamceller fra ventrikulære og subventrikulære regioner ble transplantert inn i hulrommet. I den andre versjonen av forsøkene ble nevrale stamceller fra et 9 uker gammelt menneskelig embryo transplantert inn i hjernen til kjønnsmodne rotter. Forfatterne isolerte vevsbiter fra den periventrikulære regionen av den embryonale hjernen, plasserte dem i et F-12 næringsmedium, og oppnådde en cellesuspensjon ved gjentatt pipettering, og dyrket dem deretter i et spesielt NPBM-medium med tilsetning av vekstfaktorer - FGF, EGF og NGF. Cellene ble dyrket i en suspensjonskultur inntil nevrosfærer ble dannet, som ble dispergert og igjen plantet i kulturen. Etter 4 passasjer med en total dyrkingsperiode på 12–16 dager ble cellene brukt til transplantasjon. Mottakerne var ti dager gamle rotteunger og kjønnsmodne to måneder gamle Wistar-rotter, hvortil 4 μl av den humane nevrale stamcellesuspensjonen ble injisert i hjernens laterale ventrikkel uten immunsuppresjon. Resultatene av arbeidet viste at dissosierte celler i den ventrikulære og subventrikulære sonen i den embryonale anlagen av rottehjernebarken fortsatte sin utvikling under allotransplantasjon inn i den modne hjernen, dvs. at faktorene i mikromiljøet i den differensierte mottakerhjernen ikke blokkerte veksten og differensieringen av embryoets nevrale stamceller. I de tidlige stadiene etter transplantasjon fortsatte multipotente celler mitotisk deling og migrerte aktivt fra transplantasjonsområdet til mottakerens hjernevev. Transplanterte embryonale celler med et stort migrasjonspotensial ble funnet i nesten alle lag av mottakerens hjernebark langs transplantasjonssporet og i den hvite substansen. Lengden på nervecellenes migrasjonstrakt var alltid betydelig kortere (opptil 680 μm) enn for gliale elementer (opptil 3 mm). Blodkar og fiberstrukturer i hjernen fungerte som strukturelle vektorer for astrocyttmigrasjon, noe som også ble observert i andre studier.

Tidligere trodde man at akkumulering av merkede astrocytter i området med skade på mottakerens hjernebark kunne være assosiert med dannelsen av en glialbarriere mellom vevet til transplantatet og mottakeren. Imidlertid viste en studie av strukturen til kompakt plasserte celletransplantater at deres cytoarkitektur er preget av kaos, uten noen lagdelt fordeling av transplanterte celler. Graden av orden i transplanterte nevroner nærmet seg den for normale hjernebarkceller bare i fravær av en glialbarriere mellom vevet til donor og mottaker. Ellers var strukturen til transplantasjonscellene atypisk, og nevronene i seg selv var utsatt for hypertrofi. Ved bruk av nevroimmunokjemisk typing av transplanterte celler ble hemmende GABA-erge nevroner funnet i transplantatene, og uttrykk av PARV-, CALB- og NPY-proteiner ble oppdaget. Følgelig beholder den modne hjernen mikromiljøfaktorer som er i stand til å støtte proliferasjon, migrasjon og spesifikk differensiering av nevrale multipotente celler.

I kulturen av humane stamceller isolert fra den periventrikulære regionen av hjernen til 9 uker gamle embryoer, fant M. Aleksandrova et al. (2001) et stort antall nestin-positive multipotente celler i den fjerde passasje, hvorav noen allerede hadde gjennomgått in vitro-differensiering og utviklet seg i henhold til neuronal type, noe som samsvarte med resultatene fra studier av andre forfattere. Etter transplantasjon inn i hjernen til voksne rotter, delte de dyrkede humane stamcellene seg mitotisk og migrerte inn i vevet i den xenogene mottakerhjernen. I celletransplantasjonene observerte forfatterne to populasjoner av celler - små og større. Sistnevnte migrerte både i parenkymet og langs fiberstrukturene i mottakerhjernen over ubetydelige avstander - innenfor 300 μm. Den største utstrekningen av migrasjonsveien (opptil 3 mm) var karakteristisk for små celler, hvorav noen differensierte til astrocytter, noe som ble etablert ved hjelp av monoklonale antistoffer mot GFAP. Begge celletypene ble funnet i veggen av den laterale ventrikkelen, noe som indikerer at de transplanterte cellene kom inn i den rostrale migrasjonskanalen. Astrocytiske derivater av nevrale stamceller fra både mennesker og rotter migrerte hovedsakelig gjennom blodkapillærene og fiberstrukturene i mottakerhjernen, noe som samsvarer med dataene fra andre forfattere.

Analyse av differensiering av humane stamceller in vivo ved bruk av monoklonale antistoffer mot GFAP, CALB og VIM avdekket dannelsen av både astrocytter og nevroner. I motsetning til cellene i rottetransplantasjoner, var mange humane stamceller vimentin-positive. Følgelig gjennomgikk noen av de humane multipotente cellene ikke differensiering. De samme forfatterne viste senere at humane nevrale stamceller transplantert uten immunsuppresjon overlever i rottehjernen i 20 dager etter transplantasjon, uten tegn til immunaggresjon fra gliale elementene i den modne hjernen.

Det er fastslått at selv nevrale stamceller fra Drosophila innpodes og differensieres i hjernen til et takson så fjernt fra insekter som rotte. Riktigheten av forfatternes eksperiment er uten tvil: transgene Drosophila-linjer inneholdt gener for humane nevrotrofiske faktorer NGF, GDNF, BDNF, satt inn i CaSper-vektoren under Drosophila-varmesjokkpromotoren, slik at kroppstemperaturen hos pattedyr automatisk fremkaller deres uttrykk. Forfatterne identifiserte Drosophila-celler ved produktet av det bakterielle galaktosidase-genet ved hjelp av histokjemisk X-Gal-farging. I tillegg viste det seg at Drosophila-nevronale stamceller spesifikt reagerer på nevrotrofiske faktorer kodet av menneskelige gener: når celler fra en transgen Drosophila-linje som inneholder gdnf-genet, ble xenotransplantert, økte syntesen av tyrosinhydroksylase i dens differensierende nevrale stamceller kraftig, og celler med ngf-genet produserte aktivt acetylkolinesterase. Xenotransplantasjonen induserte lignende genavhengige reaksjoner i allotransplantasjonen av embryonalt nevralt vev transplantert sammen med den.

Betyr dette at spesifikk differensiering av nevrale stamceller induseres av arts-uspesifikke nevrotrofiske faktorer? I følge forfatternes resultater hadde de xenograftproduserende nevrotrofiske faktorene en spesifikk effekt på allograftenes skjebne, som i dette tilfellet utviklet seg mer intensivt og var 2–3 ganger større enn allografter introdusert i hjernen uten tilsetning av xenografter. Følgelig har xenograftceller som inneholder nevrotrofingener, spesielt genet som koder for human glialcelle-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF), en arts-uspesifikk effekt på allograftutvikling som ligner på virkningen av det tilsvarende nevrotrofinet. GDNF er kjent for å øke overlevelsen av dopaminerge nevroner i rotteembryonale mellomhjerne og forbedre dopaminmetabolismen i disse cellene, og indusere differensiering av tyrosinhydroksylase-positive celler, noe som forbedrer aksonveksten og øker størrelsen på den nevrale cellekroppen. Lignende effekter observeres også i dyrkede dopaminerge nevroner i mellomhjernen hos rotter.

Aktiv migrasjon av humane nevrale stamceller observeres etter xenotransplantasjon inn i hjernen hos modne rotter. Det er kjent at prosessen med migrasjon og differensiering av nevrale stamceller kontrolleres av et sett med spesielle gener. Det initierende migrasjonssignalet til forløpercellen for å starte differensiering gis av proteinproduktet fra c-ret-protoonkogenet sammen med GDNF. Det neste signalet kommer fra mash-1-genet, som kontrollerer valget av celleutviklingsvei. I tillegg avhenger den spesifikke reaksjonen til differensierende celler også av α-reseptoren til den ciliære nevrotrofiske faktoren. Gitt den helt forskjellige genetiske konstitusjonen til xenogene humane nevrale stamceller og mottakerrottehjerneceller, er det derfor nødvendig å anerkjenne ikke bare arts-uspesifisiteten til nevrotrofiske faktorer, men også den høyeste evolusjonære konservatismen til genene som er ansvarlige for den spesifikke differensieringen av nevrale stamelementer.

Fremtiden vil vise om xenotransplantasjon av embryonalt nevromateriale vil være mulig i nevrokirurgisk praksis for behandling av nevrodegenerative patologiske prosesser forårsaket av forstyrrelse av myelinsyntesen av oligodendrocytter. I mellomtiden er de mest intensivt adresserte problemstillingene innen nevrotransplantasjon de som er knyttet til å utvinne allogene nevrale stamceller fra den embryonale eller modne hjernen i kultur med deres påfølgende målrettede differensiering til nevroblaster eller spesialiserte nevroner.

Nevral stamcelletransplantasjon

For å stimulere proliferasjon og differensiering av nevrale stamceller i en voksen organisme, kan embryonalt nervevev transplanteres. Det er mulig at stamcellene fra det embryonale nervevevet som ble brakt inn med allograftet, selv kan gjennomgå proliferasjon og differensiering. Det er kjent at etter en ryggmargsskade skjer regenerering av nerveledere gjennom forlengelse av skadede aksoner og kollateral spiring av aksoner fra uskadede prosesser i motoriske nevroner. Hovedfaktorene som forhindrer regenerering av ryggmargen er dannelsen av et bindevevsarr i skadeområdet, dystrofiske og degenerative forandringer i sentrale nevroner, NGF-mangel og tilstedeværelsen av myelin-nedbrytningsprodukter i skadeområdet. Det har blitt vist at transplantasjon av forskjellige celletyper inn i den skadede ryggmargen - fragmenter av isjiasnerven hos voksne dyr, embryonal occipital cortex, hippocampus, ryggmargen, Schwann-celler, astrocytter, mikroglia, makrofager, fibroblaster - fremmer regenerering av skadede aksoner ved spiring og lar nydannede aksoner vokse gjennom ryggmargsskadesonen. Det er eksperimentelt bevist at transplantasjon av embryonalt nervevev inn i ryggmargsskadeområdet, gjennom virkningen av nevrotrofiske faktorer, akselererer veksten av skadede aksoner, forhindrer dannelsen av glialarr og utviklingen av dystrofiske og degenerative prosesser i sentrale nevroner, mens cellene i det transplanterte embryonale nervevevet overlever i ryggmargen, integreres med tilstøtende vev og fremmer aksonvekst gjennom skadeområdet med dannelsen av dendrittiske synapser på spinalnevroner.

Dette området innen regenerativ-plastisk medisin har fått den største utviklingen i Ukraina takket være arbeidet til det vitenskapelige teamet ledet av V.I. Tsymbalyuk. Først og fremst er dette eksperimentelle studier av effektiviteten av transplantasjon av embryonal nervevev ved ryggmargsskader. Under autotransplantasjon av den perifere nerven observerte forfatterne de mest uttalte destruktive endringene i den distale sutursonen, hvor de på den 30. dagen etter operasjonen ble kombinert med reparative prosesser. Under allotransplantasjon var den implanterte nervens morfofunksjonelle tilstand på den 30. dagen preget av uttalt ødeleggelse med fettdegenerasjon og amyloidose på bakgrunn av fokal inflammatorisk lymfoidcelleinfiltrasjon med overveiende atrofi av Schwann-celler. Transplantasjon av embryonalt nervevev bidro i større grad til å gjenopprette ryggmargens konduktivitet, spesielt hos dyr som gjennomgikk kirurgi i løpet av de første 24 timene etter skade: mot bakgrunn av en reduksjon i intensiteten av inflammatoriske og destruktive prosesser, hypertrofi og hyperplasi av proteinsyntetiserende og energiproduserende ultrastrukturelle elementer i spinale nevroner, ble hypertrofi og hyperplasi av oligodendrocytter observert, amplituden til muskelaksjonspotensialet ble gjenopprettet med 50 % og impulsledningshastigheten med 90 %. Ved vurdering av effektiviteten av transplantasjon av embryonalt nervevev avhengig av transplantasjonssonen, ble det funnet at de beste resultatene ble observert når transplantatet ble introdusert direkte i ryggmargsskadesonen. Ved fullstendig transeksjon av ryggmargen var transplantasjon av embryonalt nervevev ineffektivt. Dynamiske studier har vist at det optimale tidspunktet for å utføre transplantasjon av embryonalt nervevev er de første 24 timene etter ryggmargsskade, mens det å utføre kirurgi i perioden med uttalte sekundære iskemisk-inflammatoriske forandringer som oppstår på 2.-9. dag etter skade, bør anses som upassende.

Det er kjent at alvorlig traumatisk hjerneskade fremkaller kraftig og langvarig aktivering av lipidperoksidasjon i de innledende og mellomliggende stadiene av den posttraumatiske perioden, både i det skadede hjernevevet og i kroppen som helhet, og forstyrrer også prosessene for energimetabolisme i den skadde hjernen. Under disse forholdene fremmer transplantasjon av embryonalt nervevev til området med traumatisk skade stabilisering av lipidperoksidasjonsprosesser og øker potensialet til antioksidantsystemet i hjernen og kroppen som helhet, og forbedrer dets antiradikalbeskyttelse på den 35.-60. dagen av den posttraumatiske perioden. I samme periode etter transplantasjon av embryonalt nervevev normaliseres energimetabolismen og oksidative fosforyleringsprosesser i hjernen. I tillegg har det blitt vist at den første dagen etter eksperimentell traumatisk hjerneskade reduseres impedansen i vevet i den skadde hjernehalvdelen med 30-37 %, den kontralaterale - med 20 %, noe som indikerer utvikling av generalisert hjerneødem. Hos dyr som gjennomgikk transplantasjon av embryonalt nervevev, forekom ødeminvolusjonen betydelig raskere – allerede på den syvende dagen nådde den gjennomsnittlige impedansverdien for vevet i den skadde hjernehalvdelen 97,8 % av kontrollnivået. Dessuten ble fullstendig gjenoppretting av impedansverdiene på den 30. dagen bare observert hos dyr som fikk transplantasjon av embryonalt nervevev.

Døden av noen nevroner i hjernen etter en alvorlig kraniocerebral skade er en av hovedårsakene til posttraumatiske komplikasjoner. Nevroner i de integrerende dopaminerge og noradrenerge systemene i mellomhjernen og medulla oblongata er spesielt følsomme for skade. En reduksjon i dopaminnivået i striopallidalkomplekset og hjernebarken øker risikoen for å utvikle motoriske forstyrrelser og psykiske lidelser, epileptiforme tilstander, og en reduksjon i dopaminproduksjon i hypothalamus kan være årsaken til en rekke vegetative og somatiske lidelser observert i den sene posttraumatiske perioden. Resultatene av studier utført i eksperimentell kraniocerebral skade indikerer at transplantasjon av embryonalt nervevev bidrar til å gjenopprette dopaminnivåene i den skadede hjernehalvdelen, dopamin og noradrenalin i hypothalamus, og øke noradrenalin- og dopaminnivåene i mellomhjernen og medulla oblongata. I tillegg, som et resultat av transplantasjon av embryonalt nervevev i den skadde hjernehalvdelen hos forsøksdyr, normaliseres prosentandelen av fosfolipider og innholdet av fettsyrer øker (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Disse dataene bekrefter stimuleringen av regenerativ-plastiske prosesser av transplantert embryonalt nervevev og indikerer den reparativ-trofiske effekten av transplantasjonen på mottakerens hjerne som helhet.

Den kliniske erfaringen til personalet ved AP Romodanov Institute of Neurosurgery ved Academy of Medical Sciences of Ukraine med transplantasjon av embryonalt nervevev ved cerebral parese, en ekstremt kompleks patologi med alvorlig motorisk dysfunksjon, fortjener spesiell oppmerksomhet. Kliniske former for cerebral parese avhenger av skadenivået på de integrerte strukturene som er ansvarlige for regulering av muskeltonus og dannelsen av motoriske stereotypier. For tiden finnes det tilstrekkelig bevis for å støtte det faktum at patologiske endringer i det striopallidale-thalamokortikale motorkontrollsystemet spiller en viktig rolle i motorisk funksjon og muskeltonusforstyrrelser. Den striopallidale forbindelsen i dette systemet utfører kontrollfunksjonen gjennom nigrostriatal dopaminproduksjon. Den direkte veien for implementering av thalamokortikal kontroll starter fra nevronene i putamen, medieres av gamma-aminosmørsyre (GABA) og substans P og projiseres direkte inn i motorsonen til det indre segmentet av globus pallidus og substantia nigra. Den indirekte banen, hvis effekt realiseres ved deltakelse av GABA og enkefalin, stammer fra nevroner i putamen og påvirker kjernene i basalgangliene gjennom en sekvens av forbindelser, inkludert det eksterne segmentet av globus pallidus og subthalamuskjernen. Forstyrrelser i konduktiviteten til den direkte banen forårsaker hypokinesi, mens en reduksjon i konduktiviteten til strukturene i den indirekte banen fører til hyperkinesi med tilsvarende endringer i muskeltonus. Integriteten til GABAerge ledningsbaner på forskjellige nivåer i motorkontrollsystemet og integreringen av dopaminerge forbindelser på putamennivå er essensielle for reguleringen av thalamokortikale interaksjoner. Den vanligste manifestasjonen av motorisk patologi i ulike former for cerebral parese er et brudd på muskeltonus og en nært relatert endring i refleksmuskelaktivitet.

Transplantasjon av embryonalt nervevev ved cerebral parese krever en grundig analyse av arten av skade på hjernestrukturer. Basert på bestemmelse av dopamin- og GABA-nivåer i subaraknoidale cerebrospinalvæsken, detaljerte forfatterne nivået av forstyrrelse i integrasjonen av funksjonelle hjernestrukturer, noe som gjorde det mulig å objektivisere resultatene av kirurgisk inngrep og korrigere gjentatte nevrotransplantasjoner. Embryonalt nervevev (abortmateriale fra et 9 uker gammelt embryo) ble transplantert inn i parenkymet i cortexen i de presentrale konvolusjonene i hjernehalvdelene, avhengig av alvorlighetsgraden av atrofiske forandringer. Ingen komplikasjoner eller forverring av pasientenes tilstand ble observert i den postoperative perioden. Positiv dynamikk ble observert hos 63 % av pasientene med spastiske former, hos 82 % av barna med en atonisk-estetisk form, og bare hos 24 % av pasientene med en blandet form av sykdommen. En negativ effekt av et høyt nivå av nevrosensitivisering med tilstedeværelse av autoantistoffer mot nevrospesifikke proteiner på resultatene av operasjonen ble etablert. Transplantasjon av embryonalt nervevev ble funnet å være ineffektivt hos pasienter i alderen 8-10 år og eldre, samt i tilfeller av alvorlig hyperkinetisk syndrom og epilepsi. Klinisk manifesterte effektiviteten av transplantasjon av embryonalt nervevev hos pasienter med spastiske former for cerebral parese seg ved dannelse av nye statomotoriske ferdigheter og frivillige bevegelser med korrigering av den patologiske motoriske stereotypen og en reduksjon i graden av spastisitet, patologiske stillinger og holdninger. Forfatterne mener at den positive effekten av transplantasjon av embryonalt nervevev er et resultat av den normaliserende effekten på den funksjonelle aktiviteten til de supraspinale strukturene som er involvert i reguleringen av postural tonus og frivillige bevegelser. Samtidig er de positive kliniske effektene av transplantasjon av embryonalt nervevev ledsaget av en reduksjon i innholdet av nevrotransmittere i subaraknoidale cerebrospinalvæsken, noe som indikerer gjenopprettelse av integrerte interaksjoner mellom de berørte hjernestrukturene.

Det finnes en annen alvorlig form for nevrologisk patologi - apallisk syndrom, hvis behandlingsproblem dessverre langt fra er løst. Apallisk syndrom er en polyetiologisk subakutt eller kronisk tilstand som oppstår som et resultat av alvorlige organiske lesjoner i sentralnervesystemet (hovedsakelig hjernebarken), og er preget av utvikling av panapraksi og panagnosi med relativt bevart funksjon av segmental-stammeseksjonene og formasjoner av det limbisk-retikulære komplekset i hjernen. Oppfølgingsstudier (fra 1 år til 3 år) har vist at apallisk syndrom ikke er en endelig diagnose av vedvarende skade på nervesystemet hos barn, men transformeres enten til organisk demens eller til en kronisk vegetativ tilstand. Ved avdelingen for restaurerende nevrokirurgi ved AP Romodanov-instituttet for nevrokirurgi ved Academy of Medical Sciences of Ukraine, gjennomgikk 21 pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom transplantasjon av embryonalt nervevev. Under generell anestesi ble det laget et borehull med en krone over området med de mest uttalte atrofiske endringene som ble avslørt ved computertomografi eller magnetisk resonansavbildning, og ved diffus atrofi av grå eller hvit substans ble transplantatet ført inn i hjernens presentrale og sentrale gyri. Etter åpning av dura mater ble vevsbiter fra sensorimotorisk cortex fra 8-9 uker gamle embryoer implantert intrakortikalt ved hjelp av en spesiell enhet. Antallet implanterte vevsprøver varierte fra 4 til 10, noe som ble bestemt av størrelsen på borehullet og størrelsen på lokale endringer i hjernemassen. I motsetning til andre typer patologi, forsøkte forfatterne ved apallisk syndrom å implantere så mye embryonalt vev som mulig i de mest tilgjengelige områdene av hjernen. Dura mater ble sydd sammen, og plastisk kirurgi av hodeskalledefekten ble utført. Under operasjonen viste alle pasientene signifikante forandringer i både cortex (atrofi, fravær av konvolusjoner, endring i farge og pulsering av hjernesubstansen) og hjernehinnene (fortykkelse av dura mater, betydelig fortykkelse av araknoideamembranen med tilstedeværelse av egne blodkar, fusjon av membranene med underliggende hjernesubstans). Disse forandringene var mer uttalte hos pasienter med en historie med inflammatoriske hjerneskader. Hos pasienter som hadde gjennomgått CNS-hypoksi, dominerte diffuse atrofiske forandringer i hjernesubstansen, spesielt i cortex, med en økning i subaraknoidealrommet, uten signifikante forandringer i hjernehinnene. Halvparten av pasientene hadde økt blødning i bløtvev, bein og hjernesubstans. Etter operasjonene, innen seks måneder til tre år, forbedret tilstanden seg hos 16 pasienter, og forble uendret hos fem pasienter. Positiv dynamikk ble observert i både motorisk og mental sfære. Muskeltonus ble redusert hos ti pasienter. Hos 11 pasienter økte motorisk aktivitet (redusert parese,(koordinasjonen av bevegelser forbedret), hos fem barn økte den manipulative evnen til de øvre lemmene betydelig. Hos fire pasienter minket hyppigheten og alvorlighetsgraden av epileptiske anfall, og hos ett barn var det ingen anfall i det hele tatt i løpet av hele observasjonsperioden etter operasjonen. Aggresjonen minket hos to barn, hos to pasienter med alvorlige bulbære lidelser forbedret svelgeevnen, to barn var i stand til å tygge selvstendig allerede 2 uker etter operasjonen. Det ble observert en reduksjon i alvorlighetsgraden av psykiske lidelser, ni barn ble roligere etter operasjonen, søvn og oppmerksomhet forbedret seg hos syv pasienter. Tre pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom begynte å gjenkjenne foreldrene sine, én - å følge instruksjoner, to - å uttale ord, hos tre minket graden av dysartri. Forfatterne bemerker at en merkbar forbedring i pasientenes tilstand begynner 2 måneder etter operasjonen, når et maksimum innen 5-6 måneder, deretter avtar forbedringstakten, og innen utgangen av året stabiliserer prosessen seg hos 50 % av pasientene. Den positive effekten av nevrotransplantasjon tjente som grunnlag for en gjentatt operasjon hos seks pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom, men på den andre hjernehalvdelen. Teknikken og metodene for den andre transplantasjonen var identiske med de i den første operasjonen, men den kliniske effekten av den andre operasjonen var lavere, selv om det ikke oppsto alvorlige komplikasjoner etter verken det første eller det andre kirurgiske inngrepet. Ifølge forfatterne er mekanismen for den terapeutiske effekten av nevrotransplantasjon assosiert med den nevrotrofiske effekten av det transplanterte embryonale nervevevet, som inneholder et stort antall vekst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer som stimulerer reparasjon av skadede nevroner og plastisk reorganisering av mottakerens hjernevev. En aktiverende effekt på aktiviteten til nerveceller som tidligere var morfologisk bevart, men som mistet sin funksjonelle aktivitet på grunn av sykdommen, er også mulig. Det er den raske nevrotrofiske effekten som kan forklare forbedringen av bulbærfunksjoner hos noen barn allerede på slutten av den første eller andre uken etter operasjonen. Det antas at det i tillegg til dette etableres morfofunksjonelle forbindelser mellom transplantatet og vertshjernen innen den tredje eller fjerde måneden, hvorved nevrotransplantatet erstatter funksjonene til døde hjerneceller, som er substratet for å forbedre både pasientenes motoriske og mentale funksjoner. To barn var i stand til å tygge selvstendig allerede 2 uker etter operasjonen. En reduksjon i alvorlighetsgraden av psykiske lidelser ble observert, ni barn ble roligere etter operasjonen, søvn og oppmerksomhet ble bedre hos syv pasienter. Tre pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom begynte å gjenkjenne foreldrene sine, én - å følge instruksjoner, to - å uttale ord,Hos tre avtok graden av dysartri. Forfatterne bemerker at en merkbar forbedring i pasientenes tilstand begynner 2 måneder etter operasjonen, når et maksimum innen 5–6 måneder, deretter avtar forbedringstakten og stabiliserer seg hos 50 % av pasientene innen årets slutt. Den positive effekten av nevrotransplantasjon tjente som grunnlag for en gjentatt operasjon hos seks pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom, men på den andre hjernehalvdelen. Teknikken og metoden for den andre transplantasjonen var identisk med den i den første operasjonen, men den kliniske effekten av den andre operasjonen var lavere, selv om det ikke var noen alvorlige komplikasjoner etter verken det første eller det andre kirurgiske inngrepet. Ifølge forfatterne er mekanismen for den terapeutiske effekten av nevrotransplantasjon assosiert med den nevrotrofiske effekten av det transplanterte embryonale nervevevet, som inneholder et stort antall vekst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer som stimulerer reparasjon av skadede nevroner og plastisk reorganisering av mottakerens hjernevev. En aktiverende effekt på aktiviteten til nerveceller som tidligere var morfologisk bevart, men som mistet sin funksjonelle aktivitet på grunn av sykdommen, er også mulig. Det er nettopp den raske nevrotrofiske effekten som kan forklare forbedringen av bulbærfunksjoner hos noen barn allerede på slutten av den første eller andre uken etter operasjonen. Det antas at det i tillegg til dette, innen den tredje eller fjerde måneden, etableres morfofunksjonelle forbindelser mellom transplantatet og verthjernen, hvorved nevrotransplantatet erstatter funksjonene til døde hjerneceller, som er substratet for å forbedre både motoriske og mentale funksjoner hos pasientene. To barn var i stand til å tygge selvstendig allerede 2 uker etter operasjonen. En reduksjon i alvorlighetsgraden av psykiske lidelser ble observert, ni barn ble roligere etter operasjonen, søvn og oppmerksomhet ble bedre hos syv pasienter. Tre pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom begynte å gjenkjenne foreldrene sine, én - å følge instruksjoner, to - å uttale ord, hos tre minket graden av dysartri. Forfatterne bemerker at en merkbar forbedring i pasientenes tilstand begynner 2 måneder etter operasjonen, når et maksimum innen 5–6 måneder, deretter avtar forbedringstakten, og innen årets slutt stabiliserer prosessen seg hos 50 % av pasientene. Den positive effekten av nevrotransplantasjon tjente som grunnlag for en gjentatt operasjon hos seks pasienter med konsekvenser av apallisk syndrom, men på den andre hjernehalvdelen. Teknikken og metoden for den andre transplantasjonen var identisk med den i den første operasjonen, men den kliniske effekten av den andre operasjonen var lavere, selv om det ikke var noen alvorlige komplikasjoner etter verken det første eller det andre kirurgiske inngrepet. Ifølge forfatterne,Mekanismen bak den terapeutiske effekten av nevrotransplantasjon er assosiert med den nevrotrofiske effekten av det transplanterte embryonale nervevevet, som inneholder et stort antall vekst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer som stimulerer reparasjon av skadede nevroner og plastisk reorganisering av mottakerens hjernevev. En aktiverende effekt på aktiviteten til nerveceller som tidligere var morfologisk bevart, men mistet sin funksjonelle aktivitet på grunn av sykdommen, er også mulig. Det er nettopp den raske nevrotrofiske effekten som kan forklare forbedringen av bulbærfunksjoner hos noen barn allerede på slutten av den første eller andre uken etter operasjonen. Det antas at det i tillegg til dette, innen den tredje eller fjerde måneden, etableres morfofunksjonelle forbindelser mellom transplantatet og vertshjernen, hvorved nevrotransplantasjonen erstatter funksjonene til døde hjerneceller, som er substratet for å forbedre både motoriske og mentale funksjoner hos pasientene, selv om det ikke oppsto alvorlige komplikasjoner etter verken det første eller det andre kirurgiske inngrepet. Ifølge forfatterne er mekanismen bak den terapeutiske effekten av nevrotransplantasjon assosiert med den nevrotrofiske effekten av det transplanterte embryonale nervevevet, som inneholder et stort antall vekst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer som stimulerer reparasjonen av skadede nevroner og den plastiske reorganiseringen av mottakerens hjernevev. En aktiverende effekt på aktiviteten til nerveceller som tidligere var morfologisk bevart, men som mistet sin funksjonelle aktivitet på grunn av sykdommen, er også mulig. Det er nettopp den raske nevrotrofiske effekten som kan forklare forbedringen av bulbærfunksjoner hos noen barn allerede på slutten av den første eller andre uken etter operasjonen. Det antas at det i tillegg til dette, innen den tredje eller fjerde måneden, etableres morfofunksjonelle forbindelser mellom transplantatet og verthjernen, hvorved nevrotransplantasjonen erstatter funksjonene til døde hjerneceller, som er substratet for å forbedre både pasientenes motoriske og mentale funksjoner, selv om det ikke oppsto alvorlige komplikasjoner etter verken det første eller det andre kirurgiske inngrepet. Ifølge forfatterne er mekanismen bak den terapeutiske effekten av nevrotransplantasjon assosiert med den nevrotrofiske effekten av det transplanterte embryonale nervevevet, som inneholder et stort antall vekst-, hormon- og andre biologisk aktive stoffer som stimulerer reparasjonen av skadede nevroner og den plastiske reorganiseringen av mottakerens hjernevev. En aktiverende effekt på aktiviteten til nerveceller som tidligere var morfologisk bevart, men som mistet sin funksjonelle aktivitet på grunn av sykdommen, er også mulig.Det er nettopp den raske nevrotrofiske effekten som kan forklare forbedringen av bulbærfunksjoner hos noen barn allerede på slutten av den første eller andre uken etter operasjonen. Det antas at det samtidig innen den tredje eller fjerde måneden etableres morfofunksjonelle forbindelser mellom transplantatet og verthjernen, hvorved nevrotransplantatet erstatter funksjonene til døde hjerneceller, som er substratet for å forbedre både pasientenes motoriske og mentale funksjoner.

Effekten av transplantasjon av embryonalt nervevev på reorganisering av internevronale sammenkoblinger ble studert eksperimentelt. Forfatterne studerte mønstrene for restaurering av intermodulære aksonale forbindelser i området med mekanisk skade på hjernebarken hos hvite rotter med og uten transplantasjon av embryonalt nervevev ved bruk av den fluorescerende lipofile merkingen DIL (1,1-dioktadecyl-3,3,33'-tetrametylindokarbocyaninperklorat) og konfokal laserskanning. Det ble funnet at innføring av embryonalt nervevev i skadeområdet sikrer vekst av aksoner, som etter å ha passert gjennom transplantatet kobles til det tilstøtende hjernevevet, mens uten transplantasjon av embryonalt nervevev er skadeområdet en uoverstigelig hindring for voksende aksoner. I dette arbeidet ble transplantasjon av embryonal (15.-17. dag av svangerskapet) neocortex utført. Resultatene oppnådd av forfatterne er ytterligere bevis for den aktive innflytelsen av transplantasjon av embryonalt nervevev på den posttraumatiske reorganiseringen av internevronale forhold til nærliggende strukturelle og funksjonelle moduler i hjernebarken. Transplantasjon av embryonalt nervevev gir delvis gjenoppretting av forbindelser mellom skadede områder av hjernebarken ved å skape gunstige forhold for aksonvekst i virkningssonen til transplantatets nevrotrofiske faktorer. Eksistensen av en slik effekt har blitt bevist eksperimentelt og diskuteres i litteraturen som bevis på høy plastisk kapasitet hos den skadede hjernen hos kjønnsmodne dyr. I denne forbindelse anses celletransplantasjon for tiden som en optimal terapeutisk strategi for å gjenopprette funksjonen til det skadede menneskelige sentralnervesystemet.

Dataene som forfatterne har innhentet om effektiviteten av å bruke embryonalt nervevev i hjernen som et eksogent transplantasjonsmedium for aksonvekst, bekrefter utsiktene for målrettet etablering av kommunikasjonsforbindelser mellom intakte tilstøtende områder av hjernen. Arbeidet med å studere effekten av transplantasjon av nervevev på dynamikken i funksjonelle parametere i sentralnervesystemet virker relevant. Arbeidets oppgave var å undersøke effekten av transplantasjon av det embryonale locus coeruleus (LC) på de morfofunksjonelle indeksene til LC-nevroner og mottakernes lokomotoriske aktivitet. Mottakerne var hunnrotter av typen Wistar, og donorene var 18 dager gamle embryoer av rotter av samme linje. Transplantasjon av embryonalt LC ble utført i hulrommet i hjernens tredje ventrikkel. Histologisk ble det påvist engraftment av transplantatet hos 75 % av mottakerdyrene. I tilfeller av engraftment var transplantatet tilstøtende ventrikkelveggen, fylte 1/5-2/5 av lumenet, og var levedyktig. 1 og 6 måneder etter operasjonen representerte det transplanterte nervevevet, i henhold til dets morfologiske egenskaper, strukturer som ville ha oppstått under deres normale ontogenetiske utvikling, dvs. LC-strukturer. Dataene innhentet av forfatterne indikerer at hos dyr der det embryonale LC-anlaget ble transplantert, endres den dynamiske aktiviteten og matriksaktiviteten til kromatinet i LC-cellekjernene øker. Følgelig intensiveres aktiviteten til nevroner i deres egen LC, men det innpodede transplantatet er også funksjonelt aktivt. Det er kjent at den såkalte lokomotoriske regionen i mellomhjernen praktisk talt sammenfaller med lokaliseringen av LC. Forfatterne mener at grunnlaget for endringen i motorisk aktivitet hos mottakerrotter er aktiveringen av LC-celler, både deres egne og transplantatet, med frigjøring av en stor mengde noradrenalin, inkludert i ryggmargssegmentene. Det antas derfor at økningen i motorisk aktivitet under LC-transplantasjonsforhold til dyrs intakte hjerne skyldes tilstedeværelsen av et funksjonelt aktivt transplantat integrert med mottakerens hjerne og som bidrar til aktiveringen av lokomotorisk aktivitet hos rotter.

I tillegg ble det vist at transplanterte nevroepitelceller fra de embryonale rudimentene av neocortex og ryggmargen overlever og differensierer til nevroblaster, unge og modne nevroner, innen 1-2 måneder etter transplantasjon inn i den skadede isjiasnerven hos modne rotter. Når man studerte dynamikken i utviklingen av NADPH-positive nevroner i de embryonale rudimentene av neocortex og ryggmargen hos rotter i heterotopiske allografter (15-dagers rotteembryo), ble det avdekket innpoding av 70 til 80 % av nevrotransplantatene på langsgående snitt gjennom isjiasnervene hos mottakerrotter, avhengig av observasjonsperioden. Uni- og bipolare nevroblaster med avrundede lyse kjerner og en eller to nukleoler begynte å dannes i transplantatene en uke etter operasjonen, noe som ble ledsaget av dannelsen av klynger. Forfatterne klarte ikke å oppdage celler som inneholdt NADPH-diaforase (NADPH-d) blant nevroblaster. Etter 7 dager var bare cellulære elementer i blodårene NADPH-positive - kapillære endotelceller i transplantatets tykkelse, samt endotel- og glattmuskelceller i mottakerens isjiasnervekar. Siden induksjonen av NO-syntase (NOS) i vaskulære glattmuskelceller skjer under påvirkning av IL-1, forbinder forfatterne forekomsten av NADPH-positive glattmuskelceller i blodårene i isjiasnerven med tilstedeværelsen av IL-1 syntetisert i skadede nervestammer. Det er kjent at nevrogenese under transplantasjonsforhold av embryonale hjernerudimenter skjer synkront med utviklingen av nevroner in situ. Resultatene av morfologiske studier indikerer at differensieringen av noen nevrale elementer i transplantatene syv dager etter transplantasjon tilsvarer differensieringen av celler i lignende deler av hjernen hos nyfødte rotter. Dermed, under forhold med heterotopisk transplantasjon inn i den perifere nerven, viser de transplanterte embryonale nervecellene evnen til å syntetisere NADPH-d. I dette tilfellet finnes det flere nevroner som inneholder NADPH-d i ryggmargstransplantasjoner enn i neocortex-transplantasjoner, men syntesen av nitrogenoksid begynner i de transplanterte nevronene senere enn under in situ-utviklingen. I sentralnervesystemet hos virveldyr dukker NOS-positive celler opp allerede i prenatalperioden. Det antas at NO fremmer dannelsen av synaptiske forbindelser i den utviklende hjernen, og tilstedeværelsen av NOS-positive nerveafferente fibre som gir NO-syntese i cerebellare nevroblaster stimulerer migrasjonen og differensieringen av nevroner, noe som danner normal hjernecytoarkitektur. En viktig rolle for NO i synapsogenese er etablert i tektum - bare de nevronene som hadde synaptiske forbindelser med netthinneceller viste seg å være NOS-positive.

Det er kjent at nitrogenoksid er en av regulatorene av hjerneaktivitet, der det dannes fra arginin under påvirkning av NO-syntase, som har diaforaseaktivitet. I sentralnervesystemet syntetiseres NO i endotelceller i blodårer, mikroglia, astrocytter og nevroner i ulike deler av hjernen. Etter traumatisk hjerneskade, så vel som under hypoksi og iskemi, observeres en økning i antall nevroner som inneholder NO, som er en av regulatorene av cerebral blodstrøm. Gitt NOs evne til å indusere synapsogenese, er studiet av dannelsen av NO-holdige celler under nevrotransplantasjonsforhold mot bakgrunn av traumatisk skade på mottakerens nervevev av spesiell interesse.

Ikke mindre viktig er studiet av effekten av nevrotransplantasjon på den betingede refleksstereotypen av atferd. I eksperimenter for å studere effekten av intracerebral og fjern (mellom CII og CIII) transplantasjon av embryonalt locus coeruleus-vev (17-19 dager i svangerskapet) på hukommelsesprosesser og katekolamininnhold hos rotter med ødeleggelse av den frontotemporale neocortex, ble det vist at elektrolytisk skade på hjernens frontotemporale cortex forstyrrer stereotypen av den betingede refleksemosjonelle unngåelsesreaksjonen (hukommelse), svekker fysiologisk aktivitet, reduserer innholdet av noradrenalin i sonen av koagulert neocortex, men øker nivået i hypothalamus, hvor det observeres en reduksjon i adrenalinkonsentrasjonen, selv om mengden i blodet og binyrene øker.

Som et resultat av intracerebral transplantasjon av embryonalt locus coeruleus-vev, gjenopprettes stereotypen av den betingede refleks-emosjonelle unngåelsesreaksjonen, forstyrret av elektrolytisk skade på de frontotemporale områdene i hjernebarken, hos 81,4 % av dyrene, adrenalininnholdet i den retikulære formasjonen av mellomhjernen, hypothalamus og neocortex normaliseres, og nivået i hippocampus øker til og med, noe som kombineres med en reduksjon i adrenalinkonsentrasjonen i blodet.

Fjerntransplantasjon av embryonalt locus coeruleus-vev gjenoppretter ikke bare den forstyrrede stereotypen av den betingede refleks-emosjonelle unngåelsesreaksjonen hos rotter med elektrolytisk skade på frontotemporal cortex, men øker også innholdet av noradrenalin og adrenalin, hovedsakelig i hypothalamus, blod, binyrer og hjerte. Det antas at dette skyldes vaskularisering av transplantatet, penetrering av nevrotransmittere i blodet, deres passasje gjennom blod-hjerne-barrieren og aktivering av mekanismene for reopptak av adrenalin og noradrenalin etter opptakstyper 1, 2, 3. Forfatterne mener at langsiktig stabilisering av noradrenalinnivået under innpodings- og funksjonsforhold for transplantatet kan betraktes som et fenomen med progressiv frigjøring i minimale doser av nevroner i locus coeruleus.

Positive kliniske effekter av transplantasjon av embryonalt nervevev kan også skyldes sistnevntes evne til å påvirke prosessene med vaskulær neoplasma, i reguleringen av hvilke vekstfaktorer og cytokiner deltar direkte. Vaskulogenese aktiveres av angiogene vekstfaktorer - vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), FGF, PDGF og TGF, som syntetiseres under iskemi, som fungerer som det initierende øyeblikket for angiogenese. Det er bevist at uttømming av det vaskulære vekstpotensialet skjer under kroppens aldringsprosess, som spiller en betydelig rolle i patogenesen av sykdommer som koronar hjertesykdom og utslettende aterosklerose i underekstremitetene. Vevsiskemi utvikler seg også ved mange andre sykdommer. Innføring av angiogene faktorer i iskemiske soner (terapeutisk angiogenese) stimulerer veksten av blodkar i iskemiske vev og forbedrer mikrosirkulasjonen på grunn av utviklingen av kollateral sirkulasjon, som igjen øker den funksjonelle aktiviteten til det berørte organet.

VEGF og FGF anses som de mest lovende for klinisk bruk. Resultatene fra de første randomiserte studiene var oppmuntrende, spesielt hvis de optimale doseringene og administreringsmetodene for angiogene faktorer ble valgt riktig. I denne forbindelse ble det utført en eksperimentell vurdering av den angiogene aktiviteten til et ekstrakt isolert fra menneskelig embryonalt hjernevev. Arbeidet brukte abortert materiale innhentet i den tjuende svangerskapsuken og behandlet i henhold til metoden til I. Maciog et al. (1979) som modifisert av IC ANRF. Dette legemidlet er en analog av "Endotelcelleveksttilskudd" ("Sigma") og er en naturlig blanding av humane angiogene faktorer, som inkluderer VEGF og FGF. Eksperimentene ble utført på rotter med modeller av iskemi i bakben og myokardvev. Basert på studien av alkalisk fosfataseaktivitet hos forsøksdyr gitt ekstrakt av embryonalt nervevev, ble det funnet en økning i antall kapillærer per arealenhet av myokardiet - både i langsgående og tverrgående seksjoner av hjertet. Preparatets angiogene aktivitet manifesterte seg ved direkte administrering til den iskemiske sonen, så vel som ved systemisk (intramuskulær) administrering, noe som førte til en reduksjon i det gjennomsnittlige arealet av arret etter infarktet.

I enhver variant av transplantasjon av embryonalt nervevev er det ekstremt viktig å velge riktig gestasjonsalder for det transplanterte embryonale materialet. Sammenlignende analyse av effektiviteten til cellepreparater fra det embryonale ventrale mesencefalonet til 8-, 14- og 16-17-dagers rotteembryoer tre måneder etter intrastriatal nevrotransplantasjon til modne rotter med parkinsonisme i den automatiserte testen av apomorfinindusert motorisk asymmetri avdekket en betydelig høyere effektivitet av CNS-cellepreparater fra 8-dagers embryoer og den laveste effektiviteten fra 16-17-dagers embryonalt nervevev. De innhentede dataene korrelerte med resultatene av histomorfologisk analyse, spesielt med størrelsen på transplantatene, alvorlighetsgraden av glialreaksjonen og antallet dopaminerge nevroner i dem.

Forskjeller i den terapeutiske effekten av embryonale nervevevsceller kan være assosiert med både graden av umodenhet og engasjement hos cellene selv, og deres ulike responser på vekstfaktorer som frigjøres i området med indusert skade på dopaminerge nevroner. Spesielt forekommer effekten av EGF og FGF2 på utviklingen av telencefaliske nevrale stamceller in vivo på forskjellige stadier av embryogenesen. Nevroepitelceller fra 8,5 dager gamle museembryoer, når de dyrkes in vitro i et serumfritt medium, prolifererer i nærvær av FGF2, men ikke EGF, som bare populasjoner av stamceller isolert fra hjernen til embryoer på senere utviklingsstadier reagerer på. Samtidig prolifererer nevrale stamceller som respons på hvert av disse mitogenene og øker veksten additivt ved tilsetning av EGF og FGF2 til en kultur med lav cellesåingstetthet. EGF-reaktive nevrale stamceller fra germinalsonene til 14,5 dager gamle museembryoer anses å være lineære etterkommere av FGF-reaktive nevrale stamceller som først dukker opp etter 8,5 dagers svangerskap. Den potensielle fenotypen til nevrale stam- og progenitorceller avhenger av den komplekse effekten av deres mikromiljø. Immunofenotyping av nevrale celler fra periventrikulære og hippocampale soner til 8-12 og 17-20 uker gamle menneskelige embryoer ved hjelp av flowcytofluorometri avdekket betydelig variasjon assosiert med både svangerskapsalder og individuelle konstitusjonelle trekk ved donorbiomaterialet. Når disse nevrale stamceller dyrkes i et selektivt serumfritt medium med EGF, FGF2 og NGF, dannes nevrosfærer med en hastighet som betydelig avhenger av svangerskapsalderen. Celler fra forskjellige deler av hjernen til 5-13 uker gamle menneskelige embryoer, når de kort dyrkes med FGF2 i monolagskultur på et lamininsubstrat i nærvær av spormengder av vekstfaktorer, opprettholder proliferasjon i 6 uker med en høy prosentandel av nestin-positive celler mot bakgrunnen av spontan dannelse av celler med markører for alle tre linjene av nevral differensiering. Celler isolert fra mesencephalonet til et menneskelig embryo ved en drektighetsperiode på over 13 uker, prolifererer under påvirkning av EGF og danner også nevrosfærer. En synergistisk effekt ble oppnådd ved bruk av en kombinasjon av EGF og FGF2. Den mest intense proliferasjonen av nevrale stamceller med dannelse av nevrosfærer observeres når hjernebarkvevet til 6-8 uker gamle menneskelige embryoer dyrkes i nærvær av EGF2, IGF1 og 5 % hesteserum på et substrat med fibronektin.

Det skal bemerkes at spørsmålene angående svangerskapsalder og tversen av det embryonale sentralnervesystemet, hvis vev er å foretrekke å bruke til nevrotransplantasjon, forblir åpne. Svarene på disse bør søkes i nevrogenesen til den utviklende hjernen, som fortsetter gjennom hele prenatalperioden - på et tidspunkt hvor epitelet i nevralrøret danner en flerlagsstruktur. Det antas at kilden til stamceller og nye nevroner er radial glia, som består av langstrakte celler med lange utløpere radielt rettet i forhold til veggen av hjernevesiklene og i kontakt med den indre overflaten av ventriklene og den ytre pialoverflaten av hjerneveggen. Tidligere var radial glia kun utstyrt med funksjonen som en nevronal kanal langs hvilken nevroblaster migrerer fra den ventrale regionen til de overfladiske seksjonene, og den ble også tildelt en skjelettrolle i prosessen med å danne den riktige laminære organiseringen av cortex. I dag er det slått fast at etter hvert som utviklingen går, transdifferensierer radial glia til astrocytter. En betydelig del av det hos pattedyr reduseres umiddelbart etter fødselen, men hos de dyreartene der radial glia er bevart til voksen alder, forekommer neurogenese aktivt i postnatalperioden.

I kultur dannet radiale gliaceller fra den embryonale neocortex hos gnagere nevroner og gliaceller, hvor nevroner hovedsakelig ble dannet i 14- til 16-dagers gestasjonsalder av embryoutviklingen (perioden med maksimal intensitet av nevrogenese i hjernebarken hos mus og rotter). På den 18. dagen av embryogenesen skiftet differensieringen mot dannelsen av astrocytter med en betydelig reduksjon i antall nydannede nevroner. In situ-merking av radiale gliaceller med GFP gjorde det mulig å oppdage asymmetrisk deling av merkede celler i hulrommet i hjernevesiklene til 15- til 16 dager gamle rotteembryoer med tilsynekomst av datterceller med immunologiske og elektrofysiologiske egenskaper ved nevroblaster. Det er verdt å merke seg at, ifølge resultatene av dynamiske observasjoner, bruker de fremvoksende nevroblastene modercellen til radiale gliaceller for migrering til den pialoverflaten.

Den endogene markøren for radial glia er det intermediære filamentproteinet nestin. Ved å bruke metoden med fluorescerende flytsortering av celler merket med et retrovirus assosiert med GFP og uttrykt under kontroll av nestin, ble det vist at stamceller fra gyrus dentatus og hilus i den menneskelige hippocampus (materialet ble innhentet under operasjoner for epilepsi) uttrykker nestin. Derfor tilhører de radial glia, som hos mennesker, som hos andre pattedyr, bare er bevart i gyrus dentatus.

Samtidig bestemmes effektiviteten av celletransplantasjon ikke bare av den høye levedyktigheten til donorcellene, deres differensieringspotensial og evne til å erstatte defekte celler, men først og fremst av deres rettede migrasjon. Full funksjonell integrasjon av transplanterte celler avhenger av deres migrasjonsevne - uten å forstyrre cytoarkitekturen til mottakerens hjerne. Siden radial glia gjennomgår nesten fullstendig reduksjon i postnatalperioden, var det nødvendig å finne ut hvordan donorceller kan bevege seg fra transplantasjonssonen til stedet for hjerneskade hos voksne mottakere. Det finnes to varianter av cellemigrasjon til CNS som ikke er avhengige av radial glia: fenomenet tangentiell migrasjon eller bevegelse av nevroblaster under utviklingen av hjernebarken vinkelrett på det radiale glianettverket, samt migrasjon "på rad" eller "langs en kjede". Spesielt skjer migrasjonen av nevrale stamceller fra den rostrale subventrikulære sonen til luktelappen som en sekvens av tett tilstøtende celler omgitt av gliaceller. Det antas at disse cellene bruker partnerceller som migrasjonssubstrat, og hovedregulatoren for slike intercellulære interaksjoner er PSA-NCAM (polysialylert nevralt celleadhesjonsmolekyl). Derfor krever ikke nevronal migrasjon nødvendigvis deltakelse fra radial glia eller eksisterende aksonale forbindelser. Den ekstraradiale formen for cellebevegelse i en "streng" langs den rostrale migrasjonskanalen opprettholdes gjennom hele livet, noe som indikerer en reell mulighet for målrettet levering av transplanterte nevrale stamceller til det modne nervesystemet.

Det finnes en hypotese om tilstedeværelsen av en stamcellelinje i hjernens ontogenese, ifølge hvilken stamcellen i de tidlige stadiene av hjerneutviklingen er en nevroepitelcelle, som etter hvert som den modnes, transdifferensierer til radial glia. I voksen alder utføres stamcellenes rolle av celler som har egenskapene til astrocytter. Til tross for en rekke kontroversielle punkter (motsetninger angående stamcellene i hippocampus, samt dype deler av hjernen som ikke har en lagdelt cortex og utvikler seg fra thalamus-tuberkler, hvor radial glia er fraværende), ser et klart og enkelt konsept om en konsekvent endring i fenotypen til stamceller gjennom hele ontogenesen svært attraktivt ut.

Innflytelsen av mikromiljøfaktorer på bestemmelsen og den påfølgende differensieringen av nevrale differensierte celler har blitt tydelig demonstrert ved transplantasjon av modne ryggmargsstamceller fra rotter til forskjellige regioner av det modne nervesystemet. Når stamceller ble transplantert inn i gyrus dentatus eller inn i regionen med nevronal migrasjon i lukteløkene, ble det observert aktiv migrasjon av transplanterte celler, med dannelse av en rekke nevroner. Transplantasjon av stamceller inn i ryggmargen og Ammons horn-regionen resulterte i dannelsen av astrocytter og oligodendrocytter, mens transplantasjon inn i gyrus dentatus resulterte i dannelsen av ikke bare gliaceller, men også nevroner.

Hos en moden rotte kan antallet delende celler i dentate gyrus nå flere tusen per dag – mindre enn 1 % av det totale antallet granulaceller. Nevroner utgjør 50–90 % av cellene, astocytter og andre gliaelementer – omtrent 15 %. De resterende cellene har ikke antigene trekk fra nevroner og glia, men inneholder endotelcelleantigener, noe som indikerer en nær sammenheng mellom nevrogenese og angiogenese i dentate gyrus. Tilhengere av muligheten for differensiering av endotelceller til nevrale forløperceller viser til endotelcellenes evne til å syntetisere BDNF in vitro.

Hastigheten til selvmontering av nevrale kretser er imponerende: under differensiering migrerer forløpercellene til granulaceller til dentate gyrus og danner prosesser som vokser mot SAZ-sonen i Ammons horn og danner synapser med pyramideformede glutamaterge og interkalære hemmende nevroner. Nyopprettede granulaceller integreres i eksisterende nevrale kretser innen 2 uker, og de første synapsene dukker opp så tidlig som 4-6 dager etter at nye celler dukker opp. Ved hyppig administrering av BrdU eller 3H-tymidin (en av metodene for å identifisere voksne stamceller) til modne dyr, ble et stort antall merkede nevroner og astrocytter funnet i Ammons horn, noe som indikerer muligheten for å danne nye nevroner ikke bare i dentate gyrus, men også i andre deler av hippocampus. Interessen for prosessene for deling, differensiering og celledød i dentate gyrus i hippocampus i den modne hjernen skyldes også det faktum at nevronene som dannes her er lokalisert i et av nøkkelområdene i hippocampus, ansvarlig for lærings- og hukommelsesprosesser.

Det er dermed i dag fastslått at nevrale stamceller stammer fra cellene i den subependymale sonen i den laterale ventrikkelen hos modne gnagere. De migrerer langs den rostrale migrasjonskanalen dannet av longitudinelt orienterte astrogliaceller til luktelappen, hvor de er innebygd i granulacellelaget og differensierer til nevroner med denne strukturen. Migrasjon av nevrale stamceller har blitt påvist i den rostrale migrasjonskanalen hos voksne aper, noe som indikerer muligheten for å danne nye nevroner i luktelappen hos primater. Nevrale stamceller har blitt isolert fra luktelappen hos et voksent menneske og overført til linjer, hvis klonede celler differensierer til nevroner, astrocytter og oligodendrocytter. Stamceller har blitt funnet i hippocampus i den modne hjernen hos rotter, mus, aper og mennesker. Nevrale stamceller i den subgranulære sonen i dentate fascia er en kilde til stamceller som migrerer til de mediale og laterale lemmene av hippocampus, hvor de differensierer til modne granulaceller og gliaelementer. Aksoner fra de novo-dannede nevroner i dentate fascia spores tilbake til CA3-feltet, noe som indikerer deltakelse fra nydannede nevroner i implementeringen av hippocampusfunksjoner. I assosiasjonsområdene i neocortex hos voksne aper ble det funnet nevrale stamceller som migrerte fra den subventrikulære sonen. I lag VI av neocortex i musehjernen oppdages nye pyramideformede nevroner 2–28 uker etter indusert skade og død av native nevroner i dette laget på grunn av migrasjonen av tidligere sovende stamceller i den subventrikulære sonen. Til slutt er realiteten av postnatal nevrogenese i den menneskelige hjerne dokumentert av en dobling i antall kortikale nevroner, som fortsetter i løpet av de første 6 årene etter fødselen.

Av ikke liten betydning for praktisk celletransplantasjon er spørsmålet om regulering av prosessene for reproduksjon og differensiering av nevrale stam- og progenitorceller. De viktigste faktorene som undertrykker proliferasjonen av nevrale progenitorceller er glukokortikoider, som reduserer antallet delinger kraftig, mens fjerning av binyrene derimot øker antallet mitoser betydelig (Gould, 1996). Det er verdt å merke seg at morfogenesen til dentate gyrus hos gnagere er mest intens i løpet av de to første ukene av postnatal utvikling i perioden med fravær av reaksjon på stress på bakgrunn av en kraftig reduksjon i produksjon og utskillelse av steroidhormoner i binyrebarken. Kortikosteroider hemmer migrasjonen av granulære celler - nye nevroner er ikke innebygd i det granulære laget av dentate gyrus, men forblir i hilus. Det antas at prosessene for dannelse av synaptiske forbindelser forstyrres samtidig. Beskyttelsen av celler mot slik "steroidaggresjon" utføres ved minimal ekspresjon av mineralokortikoid- og glukokortikoidreseptorer på prolifererende granulceller, ikke bare under utviklingen av dentate gyrus, men også hos modne dyr. Av alle nevroner i hjernen er det imidlertid nevronene i hippocampus som er preget av det høyeste innholdet av glukokortikoidreseptorer, noe som forårsaker stresseffekten på hippocampus. Psykoemosjonelt stress og stressende situasjoner hemmer nevrogenesen, og kronisk stress reduserer kraftig dyrenes evne til å tilegne seg nye ferdigheter og lære. En mer uttalt negativ effekt av kronisk stress på nevrogenesen er ganske forståelig hvis vi tar hensyn til den overveiende sovende tilstanden til nevrale stamceller. Ved immobilisering av drektige rotter (for gnagere - en ekstremt sterk stressfaktor), ble det funnet at prenatal stress også forårsaker en reduksjon i antall celler i dentate gyrus og hemmer nevrogenesen betydelig. Det er kjent at glukokortikoider deltar i patogenesen av depressive tilstander, hvis morfologiske ekvivalent er hemming av nevrogenese, patologisk reorganisering av nevroner og internevronale forbindelser, og død av nerveceller. På den annen side aktiverer antidepressive cellegiftmidler dannelsen av nevroner de novo, noe som bekrefter sammenhengen mellom prosessene for dannelse av nye nevroner i hippocampus og utviklingen av depresjon. Østrogener har en betydelig effekt på nevrogenesen, hvis effekter er motsatt av virkningen av glukokortikosteroider og består i å støtte proliferasjonen og levedyktigheten til nevrale stamceller. Det bør bemerkes at østrogener øker dyrenes læringsevne betydelig. Noen forfattere forbinder sykliske endringer i antall granulaceller og deres overskytende antall hos hunner med påvirkningen av østrogener.

Det er kjent at nevrogenesen kontrolleres av EGF, FGF og BDNF, men mekanismene for effekten av eksterne signaler på stamceller fra mitogener og vekstfaktorer er ikke tilstrekkelig studert. Det er fastslått at PDGF in vitro opprettholder den neuronale retningen for differensiering av progenitorceller, og ciliær nevrotrofisk faktor (CNTF), i likhet med trijodtyronin, stimulerer dannelsen av hovedsakelig gliale elementer - astrocytter og oligodendrocytter. Hypofyseadenylatcyklaseaktiverende protein (PACAP) og vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) aktiverer proliferasjonen av nevrale progenitorceller, men hemmer samtidig differensieringsprosessene av datterceller. Opioider, spesielt ved langvarig eksponering, hemmer nevrogenesen betydelig. Imidlertid er opioidreseptorer ikke identifisert i stamceller og nevrale progenitorceller i dentate gyrus (de er tilstede i differensierende nevroner i embryonalperioden), noe som ikke lar oss vurdere de direkte effektene av opioider.

Behovene innen praktisk regenerativ-plastisk medisin har tvunget forskere til å vie spesiell oppmerksomhet til studiet av pluri- og multipotens hos stamceller. Implementeringen av disse egenskapene på nivået av regionale stamceller hos en voksen organisme kan i fremtiden sikre produksjonen av nødvendig transplantasjonsmateriale. Det ble vist ovenfor at epigenetisk stimulering av nevrale stamceller tillater å oppnå prolifererende celler som allerede er dannet i henhold til nevrale fenotyper, noe som begrenser antallet deres. Ved bruk av de totipotente egenskapene til en embryonal stamcelle, skjer proliferasjon inntil et tilstrekkelig antall celler er oppnådd tidligere enn nevral differensiering, og de multipliserte cellene omdannes lett til en nevral fenotype. For å oppnå nevrale stamceller isoleres ESC-er fra blastocystens indre cellemasse og dyrkes i obligatorisk nærvær av LIF, som bevarer deres totipotens og evnen til ubegrenset deling. Etter dette induseres nevral differensiering av ESC-er ved bruk av retinsyre. Transplantasjon av de resulterende nevrale stamcellene inn i striatum skadet av kinolin og 6-hydroksydopamin ledsages av deres differensiering til dopaminerge og serotonerge nevroner. Etter injeksjon i ventriklene i rotteembryonale hjerne, migrerer de ESC-avledede nevrale progenitorcellene til forskjellige regioner av mottakerhjernen, inkludert cortex, striatum, septum, thalamus, hypothalamus og cerebellum. Cellene som blir igjen i ventrikkelhulen danner epitelstrukturer som ligner et nevralrør, samt individuelle øyer av ikke-nevralt vev. I hjerneparenkymmet til mottakerembryoet produserer de transplanterte cellene de tre hovedcelletypene i nervesystemet. Noen av dem har forlengede apikale dendritter, pyramideformede cellelegemer og basale aksoner som stikker ut i corpus callosum. Astrocytter av donoropprinnelse utvider utløp til nærliggende kapillærer, og oligodendrocytter er i nær kontakt med myelinmuffer og deltar i dannelsen av myelin. Dermed er nevrale stamceller oppnådd fra ESC-er in vitro i stand til rettet migrasjon og regional differensiering tilstrekkelig til mikro-miljøsignaler, noe som gir mange områder av den utviklende hjernen nevroner og glia.

Noen forfattere vurderer muligheten for de- og transdifferensiering av regionale stamceller fra en voksen organisme. Indirekte bekreftelse på cellededifferensiering i kultur med utvidelse av deres potensialer gis av data om innpoding av nevrale stamceller fra mus i rød benmarg med påfølgende utvikling av cellelinjer fra dem, noe som gir funksjonelt aktive celler i perifert blod. I tillegg førte transplantasjon av genetisk merkede (LacZ) nevrosfæreceller hentet fra den modne eller embryonale hjernen inn i hjernen til bestrålte mus med undertrykt hematopoiese til dannelsen av ikke bare nevrale derivater fra stamceller, men forårsaket også generering av blodceller, noe som indikerer pluripotensen til nevrale stamceller, realisert utenfor hjernen. Dermed er en nevral stamcelle i stand til å differensiere til blodceller under påvirkning av signaler fra benmargsmikromiljøet med en foreløpig transformasjon til en hematopoietisk stamcelle. På den annen side, når hematopoietiske stamceller fra benmarg transplanteres inn i hjernen, ble deres differensiering under påvirkning av hjernevevsmikromiljøet til gliaceller og nevrale celler etablert. Følgelig er differensieringspotensialet til nevrale og hematopoietiske stamceller ikke begrenset av vevsspesifisitet. Med andre ord er faktorer i det lokale mikromiljøet, som er forskjellige fra de som er karakteristiske for hjerne- og benmargsvev, i stand til å endre retningen på differensieringen av disse cellene. Det ble vist at nevrale stamceller introdusert i det venøse systemet hos bestrålte mus skaper populasjoner av myeloide, lymfoide og umodne hematopoietiske celler i milten og benmargen. In vitro ble effekten av benmargsmorfogenetiske proteiner (BMP) på overlevelse og differensiering av nevrale stamceller fastslått, noe som bestemte, som i de tidlige stadiene av embryogenesen, deres utvikling i nevrale eller gliale retninger. I nevrale stamcellekulturer fra 16 dager gamle rotteembryoer induserer BMP dannelsen av nevroner og astroglia, mens i stamcellekulturer avledet fra perinatal hjerne, dannes det bare astrocytter. I tillegg undertrykker BMP genereringen av oligodendrocytter, som bare opptrer in vitro med tilsetning av BMP-antagonisten noggin.

Transdifferensieringsprosesser er artsuspesifikke: humane hematopoietiske stamceller fra benmarg transplantert inn i striatum hos modne rotter migrerer til den hvite substansen i den ytre kapselen, ipsi- og kontralateral neocortex, hvor de danner astrocyttlignende celleelementer (Azizi et al., 1998). Når benmargsstamceller allotransplanteres inn i den laterale ventrikkelen hos nyfødte mus, kan migrasjonen av hematopoietiske stamceller spores til strukturene i forhjernen og lillehjernen. I striatum og det molekylære laget av hippocampus transformeres de migrerte cellene til astrocytter, og i luktelappen, det indre granulcellelaget i lillehjernen og retikulærdannelsen av hjernestammen danner de nevronlignende celler med en positiv reaksjon på nevrofilamenter. Etter intravenøs administrering av hematopoietiske celler til voksne mus ble GFP-merkede mikro- og astrocytter påvist i neocortex, thalamus, hjernestamme og lillehjernen.

I tillegg kan mesenkymale stamceller fra benmarg, som gir opphav til alle typer bindevevsceller, også gjennomgå nevral transdifferensiering under visse forhold (husk at den embryonale kilden til mesenkym er nevrale kamceller). Det har blitt vist at stromale celler fra benmarg fra mennesker og mus dyrket in vitro i nærvær av EGF eller BDNF uttrykker markøren for nevrale stamceller nestin, og tilsetning av forskjellige kombinasjoner av vekstfaktorer fører til dannelsen av celler med markører for glia (GFAP) og nevroner (kjerneprotein, NeuN). Merkede syngene mesenkymale stamceller transplantert inn i den laterale ventrikkelen i hjernen til nyfødte mus migrerer og lokaliserer seg i forhjernen og lillehjernen uten å forstyrre cytoarkitekturen til mottakerhjernen. Mesenkymale stamceller fra benmarg differensierer til modne astrocytter i striatum og det molekylære laget av hippocampus, og befolker luktelappen, granulære lag i lillehjernen og retikulærdannelse, hvor de transformeres til nevroner. Humane mesenkymale stamceller fra benmarg er i stand til å differensiere til makroglia in vitro og integreres i rottehjernestrukturer etter transplantasjon. Direkte transplantasjon av mesenkymale stamceller fra benmarg inn i hippocampus hos voksne rotter ledsages også av deres migrasjon inn i hjerneparenkymet og nevroglial differensiering.

Det antas at transplantasjon av stamceller fra beinmargen kan utvide mulighetene for celleterapi av sykdommer i sentralnervesystemet som er karakterisert ved overdreven patologisk nevrondød. Det bør imidlertid bemerkes at ikke alle forskere erkjenner det faktum at nevrale og hematopoietiske stamceller transformeres gjensidig, spesielt in vivo, noe som igjen skyldes mangelen på en pålitelig markør for å vurdere deres transdifferensiering og videre utvikling.

Stamcelletransplantasjon åpner nye horisonter for cellulær genterapi av arvelig nevrologisk patologi. Genetisk modifisering av nevrale stamceller innebærer innsetting av genetiske regulatoriske konstruksjoner, hvis produkter samhandler med cellesyklusproteiner i automatisk reguleringsmodus. Transduksjon av slike gener inn i embryonale stamceller brukes til å formere nevrale stamceller. De fleste genetisk modifiserte cellekloner oppfører seg som stabile cellelinjer, og viser ingen tegn til transformasjon in vivo eller in vitro, men har en uttalt evne til kontakthemming av proliferasjon. Ved transplantasjon integreres de multipliserte transfekterte cellene i mottakervevet uten å forstyrre cytoarkitekturen og uten å gjennomgå tumortransformasjon. Donor-nevrale stamceller deformerer ikke integrasjonssonen og konkurrerer likt om plass med vertsstamceller. Imidlertid avtar delingsintensiteten til transfektantceller kraftig på den 2.-3. dagen, noe som tilsvarer kontakthemming av deres proliferasjon in vitro. Embryoer-mottakere av nevrale stamtransfektanter har ingen abnormaliteter i utviklingen av sentralnervesystemet, alle områder av hjernen som er i kontakt med transplantatet utvikler seg normalt. Etter transplantasjon migrerer kloner av nevrale stamceller raskt fra injeksjonssonen og går ofte utover de tilsvarende embryonale sonene langs rostralkanalen, og integreres tilstrekkelig med andre områder av hjernen. Integreringen av genetisk modifiserte kloner og transfekterte cellelinjer av nevrale stamceller i hjernen til vertsorganismen er karakteristisk ikke bare for embryonalperioden: disse cellene implanteres i en rekke områder av sentralnervesystemet til fosteret, nyfødte, voksne og til og med aldrende mottakerorganismer og demonstrerer evnen til tilstrekkelig integrering og differensiering. Spesielt etter transplantasjon inn i hjernens ventrikulære hulrom migrerer transfekterte celler uten å skade blod-hjerne-barrieren og blir integrerte funksjonelle cellulære komponenter i hjernevevet. Donorneuroner danner passende synapser og uttrykker spesifikke ionekanaler. Med integriteten til blod-hjerne-barrieren bevart, utvider astroglia, et derivat av transfektante nevrale stamceller, prosesser til hjernekar, og donoravledede oligodendrocytter uttrykker myelinbasisk protein og myeliniserer nevrale prosesser.

I tillegg transfekteres nevrale stamceller for bruk som cellulære vektorer. Slike vektorgenetiske konstruksjoner gir stabil ekspresjon in vivo av fremmede gener involvert i utviklingen av nervesystemet, eller brukes til å korrigere eksisterende genetiske defekter, siden produktene fra disse genene er i stand til å kompensere for ulike biokjemiske abnormaliteter i sentralnervesystemet. Høy migrasjonsaktivitet av transfekterte stamceller og tilstrekkelig implantasjon i germinalsonene i ulike områder av den utviklende hjernen lar oss håpe på fullstendig gjenoppretting av arvelig mangel på cellulære enzymer. Ved modellering av ataksi-telangiektasi-syndrom (mutante muselinjer pg og pcd) forsvinner Purkinje-celler fra lillehjernen hos forsøksdyr i løpet av de første ukene av postnatal utvikling. Det har blitt vist at introduksjonen av nevrale stamceller i hjernen til slike dyr ledsages av deres differensiering til Purkinje-celler og granulære nevroner. Hos pcd-mutanter korrigeres bevegelseskoordinasjonsforstyrrelser delvis og tremorintensiteten reduseres. Lignende resultater ble oppnådd ved å transplantere klonede humane nevrale stamceller til primater der Purkinje-celledegenerasjon ble indusert ved hjelp av onconase. Etter transplantasjon ble det funnet nevrale stamceller fra donorer i de granulære, molekylære og Purkinje-cellelagene i lillehjernens parenkym. Derfor kan genetisk modifisering av nevrale progenitorceller gi en stabil, dedikert modifikasjon av fenotypen som er motstandsdyktig mot ytre påvirkninger. Dette er spesielt viktig i patologiske prosesser assosiert med utviklingen av faktorer hos mottakeren som forhindrer overlevelse og differensiering av donorceller (f.eks. under immunaggresjon).

Mukopolysakkaridose type VII hos mennesker er karakterisert av nevrodegenerasjon og progressiv intellektuell funksjonshemming, som er modellert hos mus ved en delesjonsmutasjon i beta-glukuronidase-genet. Etter transplantasjon av transfekterte nevrale stamceller som utskiller beta-glukuronidase inn i hjerneventriklene hos nyfødte mottakermus med defekter, finnes donorcellene først i terminalsonen og spres deretter gjennom hjerneparenkymet, noe som stabilt korrigerer integriteten til lysosomer i hjernen hos mutante mus. I en modell av Tay-Sachs sykdom gir retrovirus-transduserte nevrale stamceller, når de administreres in utero til musefostre og transplanteres til nyfødte mus, effektiv ekspresjon av beta-subenheten av beta-heksosaminidase hos mottakere med en mutasjon som fører til patologisk akkumulering av beta2-gangliosid.

En annen retning innen regenerativ medisin er stimulering av det proliferative og differensierende potensialet til pasientens egne nevrale stamceller. Spesielt utskiller nevrale stamceller NT-3 under ryggmargshemiseksjon og hjernekvelning hos rotter, uttrykker NGF og BDNF i septum og basalganglier, tyrosinhydroksylaser i striatum, samt reelin i lillehjernen og myelinbasisk protein i hjernen.

Imidlertid får spørsmål om stimulering av nevrogenese tydeligvis ikke nok oppmerksomhet. Noen få studier tyder på at den funksjonelle belastningen på nervesentrene som er ansvarlige for å skille lukter, gjenspeiles i dannelsen av nye nevroner. Hos transgene mus med et underskudd av nevrale adhesjonsmolekyler ble en reduksjon i intensiteten av nevrogenesen og en reduksjon i antall nevroner som migrerer til luktlørene kombinert med en svekkelse av evnen til å skille lukter, selv om terskelen for luktpersepsjon og kortsiktig lukthukommelse ikke ble svekket. Den funksjonelle tilstanden til cellene i gyrus dentatus spiller en viktig rolle i reguleringen av nevrogenesen: en svekkelse av effekten av glutamat på granulatceller etter ødeleggelsen av entorhinal cortex fremmer proliferasjon og differensiering av nevroner, og stimulering av fibrene i perforasjonsbanen (den viktigste afferente inputen til hippocampus) forårsaker hemming av nevrogenesen. NMDA-reseptorantagonister aktiverer prosessene for dannelse av nye nevroner, mens agonister derimot reduserer intensiteten av nevrogenesen, som i realiteten ligner virkningen av glukokortikosteroider. Motstridende forskningsresultater finnes i litteraturen: informasjon om den eksperimentelt beviste hemmende effekten av den eksitatoriske nevrotransmitteren glutamat på nevrogenesen er inkonsistent med data om stimulering av proliferasjon av stamceller og tilstedeværelsen av nye nevroner med økt anfallsaktivitet i hippocampus hos dyr med eksperimentelle kain- og pilokarpinmodeller av epilepsi. Samtidig, i den tradisjonelle modellen av epilepsi forårsaket av multippel subterskelstimulering av et bestemt område av hjernen (kindling) og karakterisert ved mindre uttalt nevrondød, øker intensiteten av nevrogenesen bare i den sene fasen av kindling, når skade og død av nevroner observeres i hippocampus. Det har blitt vist at ved epilepsi stimulerer anfallsaktivitet nevrogenesen med unormal lokalisering av nye granulære nevroner, hvorav mange ikke bare forekommer i dentate gyrus, men også i hilus. Slike nevroner er av stor betydning i utviklingen av mosefiberspiring, siden deres axoner danner normalt fraværende reverserte kollateraler som danner en rekke synapser med nærliggende granulære celler.

Bruken av regionale nevrale stamceller åpner nye muligheter for anvendelse av celletransplantasjon i behandlingen av metabolske og genetiske nevrodegenerative sykdommer, demyeliniserende sykdommer og posttraumatiske lidelser i sentralnervesystemet. Før utførelse av erstatningscelletransplantasjon i henhold til en av metodene, utføres utvelgelse og ekspansjon av den nødvendige typen nevrale progenitorceller ex vivo med det formål å introdusere dem direkte i det skadede området av hjernen. Den terapeutiske effekten i dette tilfellet skyldes erstatning av skadede celler eller lokal frigjøring av vekstfaktorer og cytokiner. Denne metoden for regenerativ-plastisk terapi krever transplantasjon av et tilstrekkelig stort antall celler med forhåndsbestemte funksjonelle egenskaper.

Ytterligere studier av de molekylære egenskapene og det regenerativ-plastiske potensialet til modne hjernestamceller, samt evnen til regionale stamceller av ulik vevsopprinnelse til å transdifferensiere, bør også anses som passende. I dag er screening av antigener fra hematopoietiske stamceller fra benmargen allerede utført, med bestemmelse av en markørkombinasjon av celler som er i stand til å transdifferensiere til nevrale stamprogenitorceller (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Celler som danner nevrosfærer in vitro og danner nevroner når de transplanteres inn i hjernen til nyfødte immunsviktige mus, er av interesse for cellulær xenotransplantologi. Av interesse for cellulær xenotransplantologi er resultatene av studier på muligheten for krysstransplantasjon av stamceller hos individer av evolusjonært fjerne taxa. Resultatene av implantasjon av nevrale stamceller i hjernesvulstområdet forblir uten riktig tolkning: transplanterte celler migrerer aktivt gjennom tumorvolumet uten å gå utover dets grenser, og når celler introduseres i den intakte delen av hjernen, observeres deres aktive migrasjon mot tumoren. Spørsmålet om den biologiske betydningen av slik migrasjon er fortsatt åpent.

Det skal bemerkes at vellykket transplantasjon av nevrale stamceller, så vel som andre nevrale progenitorceller hentet fra ESC-er, kun er mulig når man bruker høyrensede nevrale progenitorceller, siden udifferensierte embryonale stamceller uunngåelig transformeres til teratomer og teratokarsinomer når de transplanteres til en voksen immunkompetent mottaker. Selv en minimal mengde dårlig differensierte celler i donorcellesuspensjonen øker tumorigenisiteten til transplantatet kraftig og øker risikoen for tumorutvikling eller dannelse av ikke-nevralt vev i en uakseptabel grad. Det er mulig å oppnå homogene populasjoner av nevrale progenitorceller når man bruker celler som oppstår på visse stadier av normal embryogenese som en alternativ kilde til donorvev. En annen tilnærming innebærer nøye eliminering av uønskede cellepopulasjoner ved avstamningsspesifikk seleksjon. Bruk av ESC-er for nevrotransplantasjon etter utilstrekkelig eksponering in vitro for vekstfaktorer er også farlig. I dette tilfellet kan det ikke utelukkes at det nevrale differensieringsprogrammet mislykkes med dannelse av strukturer som er iboende i nevralrøret.

I dag er det ganske åpenbart at nevrale stamceller viser tropisme for patologisk endrede områder i sentralnervesystemet og har en uttalt regenerativ-plastisk effekt. Mikromiljøet på stedet for celledød i nervevevet modellerer retningen for differensiering av transplanterte celler, og dermed erstatter mangelen på spesifikke nevrale elementer innenfor sonen med CNS-skade. I noen nevrodegenerative prosesser oppstår nevrogene signaler for rekapitulering av nevrogenese, og nevrale stamceller i den modne hjernen er i stand til å reagere på denne lærerike informasjonen. Tallrike eksperimentelle data tjener som en klar illustrasjon av det terapeutiske potensialet til nevrale stamceller. Intracisternal administrering av en klon av nevrale stamceller til dyr med ligering av den midtre hjernearterien (en modell for iskemisk hjerneslag) bidrar til å redusere arealet og volumet av det destruktivt endrede området i hjernen, spesielt i tilfelle transplantasjon av nevrale stamceller sammen med FGF2. Immunocytokjemisk observeres migrasjon av donorceller til den iskemiske sonen med deres påfølgende integrering med intakte mottakerhjerneceller. Transplantasjon av umodne celler fra den nevroepiteliale linjen MHP36 hos mus inn i hjernen hos rotter med eksperimentelt hjerneslag forbedrer sensorimotorisk funksjon, og introduksjonen av disse cellene i hjerneventriklene forbedrer kognitiv funksjon. Transplantasjon av nevralt preformede hematopoietiske celler fra menneskelig benmarg til rotter eliminerer dysfunksjon i hjernebarken forårsaket av iskemisk skade. I dette tilfellet migrerer xenogene nevrale progenitorceller fra injeksjonsstedet til sonen med destruktive endringer i hjernevevet. Intrakraniell transplantasjon av homologe benmargsceller ved traumatisk skade på hjernebarken hos rotter fører til delvis gjenoppretting av motorisk funksjon. Donorceller innpodes, prolifererer, gjennomgår nevral differensiering til nevroner og astrocytter og migrerer mot lesjonen. Når de injiseres i striatum hos voksne rotter med eksperimentelt hjerneslag, erstatter klonede menneskelige nevrale stamceller skadede CNS-celler og gjenoppretter delvis nedsatt hjernefunksjon.

Humane nevrale stamceller isoleres hovedsakelig fra det embryonale telencephalonet, som utvikler seg mye senere enn mer kaudalt plasserte deler av nervestammen. Muligheten for å isolere nevrale stamceller fra ryggmargen til et 43–137 dager gammelt menneskelig foster har blitt vist, siden disse cellene i nærvær av EGF og FGF2 danner nevrosfærer og viser multipotens ved tidlige passasjer, og differensierer til nevroner og astrocytter. Langvarig dyrking av nevrale progenitorceller (over 1 år) fratar dem imidlertid multipotensen – slike celler er kun i stand til å differensiere til astrocytter, dvs. de blir unipotente. Regionale nevrale stamceller kan oppnås som et resultat av delvis bulbektomi og, etter reproduksjon i kultur i nærvær av LIF, transplanteres til samme pasient med nevrodegenerative forandringer i andre deler av sentralnervesystemet. I klinikken ble erstatningscelleterapi ved bruk av nevrale stamceller først utført for å behandle pasienter med hjerneslag ledsaget av skade på basalgangliene i hjernen. Som et resultat av transplantasjon av donorceller ble det observert en forbedring i den kliniske tilstanden til de fleste pasientene.

Noen forfattere mener at nevrale stamcellers evne til å innpode, migrere og integrere seg i ulike områder av nervevevet ved CNS-skade åpner for ubegrensede muligheter for celleterapi av ikke bare lokale, men også omfattende (slag eller kvelning), multifokale (multippel sklerose) og til og med globale (de fleste arvelige metabolske lidelser eller nevrodegenerative demens) patologiske prosesser. Når klonede nevrale stamceller fra mus og mennesker transplanteres til mottakerdyr (henholdsvis mus og primater) med degenerasjon av dopaminerge nevroner i det mesostriatale systemet indusert ved innføring av metylfenyltetrapyridin (modell av Parkinsons sykdom) 8 måneder før transplantasjon, integreres donor-nevronale stamceller i mottakerens CNS. En måned senere er de transplanterte cellene lokalisert bilateralt langs mellomhjernen. Noen av de resulterende nevronene av donoropprinnelse uttrykker tyrosinhydrolase i fravær av tegn på en immunreaksjon på transplantatet. Hos rotter som fikk administrert 6-hydroksydopamin (en annen eksperimentell modell av Parkinsons sykdom), ble tilpasningen av transplanterte celler til mikromiljøet i vertshjernen bestemt av forholdene for dyrking av nevrale stamceller før transplantasjonen. Nevrale stamceller, som raskt prolifererte in vitro under påvirkning av EGF, kompenserte for mangelen på dopaminerge nevroner i det skadede striatumet mer effektivt enn celler fra 28-dagers kulturer. Forfatterne mener at dette skyldes tapet av evnen til å oppfatte de tilsvarende differensieringssignalene under celledelingsprosessen av nevrale progenitorceller in vitro.

I noen studier ble det gjort forsøk på å øke effektiviteten av virkningen på reinnervasjonsprosessene i det skadede striatumet ved å transplantere embryonale striatumceller inn i dette området som en kilde til nevrotrofiske faktorer med samtidig transplantasjon av dopaminerge nevroner i ventral mesencephalon. Det viste seg at effektiviteten av nevrotransplantasjon i stor grad avhenger av metoden for å introdusere embryonalt nervevev. Som et resultat av studier av transplantasjon av embryonale nervevevspreparater inn i hjernens ventrikulære system (for å unngå skade på striatumparenkymet), ble det innhentet informasjon om deres positive effekt på motoriske defekter ved Parkinsonisme.

Imidlertid har eksperimentelle observasjoner i andre studier vist at transplantasjon av embryonale nervevevspreparater fra det ventrale mesencefalon som inneholder dopaminerge nevroner inn i hjerneventrikelen, samt transplantasjon av GABA-erge embryonale nevrale elementer inn i striatum hos rotter med hemiparkinsonisme, ikke fremmer gjenoppretting av svekkede funksjoner i det dopaminerge systemet. Tvert imot bekreftet immunocytokjemisk analyse dataene om den lave overlevelsesraten for dopaminerge nevroner fra det ventrale mesencefalon transplantert inn i striatum hos rotter. Den terapeutiske effekten av intraventrikulær transplantasjon av embryonalt nervevev fra det ventrale mesencefalon ble kun realisert under forutsetning av samtidig implantasjon av et preparat av embryonale striatale celler inn i det denerverte striatum. Forfatterne mener at mekanismen for denne effekten er assosiert med den positive trofiske effekten av GABA-erge elementer fra det embryonale striatum på den spesifikke dopaminerge aktiviteten til intraventrikulære ventrale mesencefalontransplantater. En uttalt glialreaksjon i transplantatene ble ledsaget av en liten regresjon av apomorfintestparametrene. Sistnevnte korrelerte igjen med GFAP-innholdet i blodserumet, noe som direkte indikerte et brudd på permeabiliteten til blod-hjerne-barrieren. Basert på disse dataene konkluderte forfatterne med at GFAP-nivået i blodserumet kan brukes som et tilstrekkelig kriterium for å vurdere transplantatets funksjonelle tilstand, og økt permeabilitet av blod-hjerne-barrieren for nevrospesifikke antigener som GFAP er en patogenetisk kobling i utviklingen av transplantasjonssvikt på grunn av autoimmun skade på mottakerens nervevev.

Fra andre forskeres synspunkt er innpodingen og integreringen av nevrale stamceller etter transplantasjon stabil og livslang, siden donorceller finnes hos mottakere i minst to år etter transplantasjon og uten en betydelig reduksjon i antallet. Forsøk på å forklare dette med det faktum at nevrale stamceller i en udifferensiert tilstand ikke uttrykker MHC klasse I og II-molekyler på et nivå som er tilstrekkelig til å indusere en immunavstøtningsreaksjon, kan bare anses som sanne i forhold til lavt differensierte nevrale forløpere. Imidlertid er ikke alle nevrale stamceller i mottakerens hjerne bevart i en umoden sovende tilstand. De fleste av dem gjennomgår differensiering, der MHC-molekyler uttrykkes i sin helhet.

Spesielt er den utilstrekkelige effektiviteten ved bruk av intrastriatal transplantasjon av embryonale ventrale mesencefalonpreparater som inneholder dopaminerge nevroner for behandling av eksperimentell parkinsonisme assosiert med den lave overlevelsesraten for transplanterte dopaminerge nevroner (kun 5–20 %), som er forårsaket av reaktiv gliose som ledsager lokalt traume av hjerneparenkym under transplantasjon. Det er kjent at lokalt traume av hjerneparenkym og samtidig gliose fører til forstyrrelse av blod-hjerne-barrierens integritet med frigjøring av antigener fra nervevev, spesielt OCAR og nevronspesifikt antigen, i det perifere blodet. Tilstedeværelsen av disse antigenene i blodet kan forårsake produksjon av spesifikke cytotoksiske antistoffer mot dem og utvikling av autoimmun aggresjon.

V. Tsymbalyuk og medforfattere (2001) rapporterer at det tradisjonelle synspunktet fortsatt holder, ifølge hvilket sentralnervesystemet er en immunologisk privilegert sone isolert fra immunsystemet av blod-hjerne-barrieren. I sin litteraturgjennomgang siterer forfatterne en rekke arbeider som indikerer at dette synspunktet ikke fullt ut samsvarer med essensen av immunprosesser i pattedyrhjernen. Det er fastslått at merkede stoffer som introduseres i hjerneparenkymet kan nå dype cervikale lymfeknuter, og etter intracerebral injeksjon av antigener dannes spesifikke antistoffer i kroppen. Celler i cervikale lymfeknuter reagerer på slike antigener ved proliferasjon, som begynner på den femte dagen etter injeksjonen. Dannelsen av spesifikke antistoffer har også blitt avslørt under hudtransplantasjon inn i hjerneparenkymet. Forfatterne av gjennomgangen gir flere hypotetiske veier for antigentransport fra hjernen til lymfesystemet. En av dem er overgangen av antigener fra de perivaskulære rommene til det subaraknoideale rommet. Det antas at de perivaskulære rommene lokalisert langs de store hjernekarene tilsvarer lymfesystemet i hjernen. Den andre veien går langs de hvite fibrene - gjennom etmoidbenet og inn i lymfekarene i neseslimhinnen. I tillegg er det et omfattende nettverk av lymfekar i dura mater. Blod-hjerne-barrierens ugjennomtrengelighet for lymfocytter er også ganske relativ. Det er bevist at aktiverte lymfocytter er i stand til å produsere enzymer som påvirker permeabiliteten til strukturene i hjernens "immunfilter". På nivået av postkapillære venuler trenger aktiverte T-hjelpere inn i den intakte blod-hjerne-barrieren. Tesen om fraværet av celler i hjernen som representerer antigener tåler ikke kritikk. For tiden er muligheten for å representere antigener i CNS av minst tre typer celler overbevisende bevist. For det første er dette dendrittiske celler fra benmarg som er lokalisert i hjernen langs store blodkar og i den hvite substansen. For det andre er antigener i stand til å presentere endotelceller i hjernens blodårer, og i forbindelse med MHC-antigener, noe som støtter klonal vekst av T-celler som er spesifikke for disse antigenene. For det tredje fungerer mikro- og astrogliaceller som antigenpresenterende stoffer. Astrocytter deltar i dannelsen av immunresponsen i sentralnervesystemet, og tilegner seg egenskapene til en immuneffektorcelle og uttrykker en rekke antigener, cytokiner og immunmodulatorer. Når de inkuberes med y-interferon (y-INF), uttrykker astrogliaceller in vitro MHC klasse I og II-antigener, og stimulerte astrocytter er i stand til antigenpresentasjon og opprettholde klonal proliferasjon av lymfocytter.

Hjernevevstrauma, postoperativ betennelse, ødem og fibrinavleiringer som følger med embryonal nervevevstransplantasjon skaper betingelser for økt permeabilitet av blod-hjerne-barrieren med svekket autotoleranse, sensibilisering og aktivering av CD3+CD4+ lymfocytter. Presentasjon av auto- og alloantigener utføres av astrocytter og mikrogliaceller som reagerer på y-INF ved å uttrykke MHC-molekyler, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulerende molekyler B7-1 (CD80) og B7-2 (CD86), samt sekresjon av IL-la, IL-ip og y-INF.

Følgelig kan det faktum at embryonalt nervevev overlever lenger etter intracerebral transplantasjon enn etter perifer administrering neppe assosieres med fraværet av initiering av transplantasjonsimmunitet. Dessuten spiller monocytter, aktiverte lymfocytter (cytotoksiske CD3+CD8+ og T-hjelperceller) og cytokinene de produserer, samt antistoffer mot antigener fra perifert transplantat av embryonalt nervevev, en viktig rolle i avstøtningsprosessen. Et lavt nivå av MHC-molekyler i embryonalt nervevev er av stor betydning for å skape forhold for lengre resistens hos nevrotransplantater mot T-celle-immunprosesser. Dette er grunnen til at immunbetennelse etter transplantasjon av embryonalt nervevev til hjernen utvikler seg saktere i forsøket enn etter hudtransplantasjon. Likevel observeres fullstendig ødeleggelse av individuelle transplantater av nervevev etter 6 måneder. I dette tilfellet er T-lymfocytter som er begrenset av MHC klasse II-antigener hovedsakelig lokalisert i transplantasjonssonen (Nicholas et al., 1988). Det er eksperimentelt fastslått at under xenologisk nevrotransplantasjon forlenger reduksjon av T-hjelpere (L3T4+), men ikke cytotoksiske T-lymfocytter (Lyt-2), overlevelsen av rottenervevev i hjernen til mottakermus. Avstøting av nevrotransplantatet ledsages av infiltrasjon av vertsmakrofager og T-lymfocytter. Følgelig fungerer vertsmakrofager og aktiverte mikrogliaceller in situ som antigenpresenterende immunstimulerende celler, og økt uttrykk av donor MHC klasse I-antigener forsterker dreperaktiviteten til mottakerens cytotoksiske T-lymfocytter.

Det er ikke noe poeng i å analysere de mange spekulative forsøkene på å forklare det faktum at nevrotransplantasjon avvises ved at mottakerens immunsystem reagerer på donorens endotelceller eller gliaceller, siden selv rene linjer av nevrale stamceller er utsatt for immunangrep. Det er verdt å merke seg at uttrykket av Fas-ligander av hjerneceller som binder apoptosereseptorer (Fas-molekyler) på T-lymfocytter som infiltrerer hjernen og induserer deres apoptose, spiller en viktig rolle i mekanismene for lengre transplantasjonsoverlevelse i sentralnervesystemet, som er en typisk beskyttelsesmekanisme for transbarriere autoimmunogene vev.

Som V. Tsymbalyuk og medforfattere (2001) med rette bemerker, er transplantasjon av embryonalt nervevev karakterisert ved utvikling av betennelse med deltakelse av celler som er sensibilisert for hjerneantigener og aktiverte celler, antistoffer, og også som et resultat av lokal produksjon av cytokiner. En viktig rolle i dette spilles av den eksisterende sensibiliseringen av kroppen for hjerneantigener, som oppstår under utviklingen av CNS-sykdommer og kan rettes mot transplantasjonsantigener. Dette er grunnen til at den virkelig langsiktige overlevelsen av histoinkompatible nevrotransplantasjoner kun oppnås ved å undertrykke immunforsvaret med ciklosporin A eller ved å introdusere monoklonale antistoffer mot mottakerens CD4+ lymfocytter.

Dermed forblir mange problemer knyttet til nevrotransplantasjon uløste, inkludert de som er knyttet til vevets immunologiske kompatibilitet, som bare kan løses etter målrettet grunnleggende og klinisk forskning.