Eksperimentelle modeller av slitasjegikt

Brusk er et høyt spesialisert vev som bare inneholder en type celler (kondrocytter), karakterisert ved fravær av blod og lymfatiske kar. Brusk ernæring utføres hovedsakelig ved absorpsjon fra synovialvæsken. Kondrocytets metabolisme reguleres av en rekke løselige faktorer produsert lokalt av kondrocytter og omgivende vev. Funksjonen av kondrocytter avhenger også av sammensetningen av det ekstracellulære medium (oksygenspenning, ionekonsentrasjon, pH, etc.), VCM-sammensetning, celle og matriksinteraksjon, fysiske signaler. Hovedoppgaven til eksperimentell modellering er opprettelsen av kulturer i det ekstracellulære miljøet uten å endre fenotypen av modne celler. Den andre oppgaven er å skape kulturer for å studere for tidlig, forsinket, kort eller langsiktig respons av kondrocytter til kjemiske og / eller fysiske signaler. Studier in vitro gir også en mulighet til å studere oppførselen til chondrocyttransplantasjon i slitasjegikt. Den tredje oppgaven er utviklingen av co-kurative systemer, som gjør det mulig å studere samspillet mellom forskjellige vev i leddet. Den fjerde oppgaven er å fremstille brusk i implantater for den etterfølgende transplantasjonen. Og til slutt er den femte oppgaven å studere vekstfaktorer, cytokiner eller terapeutiske midler som er i stand til å stimulere reparasjon og / eller hemme opptaket av brusk.

I de siste tiårene har forskjellige modeller av artikulære bruskcellekulturer blitt dannet, inkludert monolagskulturer, suspenderte kulturer, kondronkulturer, eksplantater, kulturer, utødelige cellekulturer. Hver kultur har sine fordeler og ulemper, og hver er egnet for å studere et spesielt aspekt av kondrocyt metabolisme. Dermed er bruskutplantinger en utmerket modell for å studere omsetningen av matrikselementer, som krever ekte celleoverflate-reseptorer og normal cellematrise og matrise-celle-interaksjoner. Samtidig anbefales det at studier av forekomster i matrisen eller mekanismer for regulering av kondrocyt metabolisme utføres på en kultur av isolerte celler. En monolag med lav tetthetskultur er nødvendig for å studere prosessen med celledifferensiering. Kulturer suspendert i en naturlig eller syntetisk matrise er en modell for å analysere adaptiv respons av kondrocytter til mekanisk stress.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrocyte kulturer

Ved valg av bruskvev for in vitro-studier må flere viktige punkter vurderes. Matrikssammensetning og metabolsk aktivitet av kondrocytter varierer i forskjellige ledd, og sistnevnte avhenger også av dybden av kondrocyt i vevet. Disse data ble oppnådd i flere eksperimenter hvor isolerte subpopulasjoner av kondrocytter fra brusk sonene av forskjellige dybder ble undersøkt. En rekke morfologiske og biokjemiske forskjeller ble funnet mellom kultiverte kondrocyter plassert i overflaten og dype lag av leddbrusk. Overflate celler syntetiserer en sjelden utarmet proteoglykanfibrillær matrise, mens dypere celler produserer en matrise som er rik på fibriller og proteoglykaner. Videre produserer overflatecellene relativt flere små ikke-aggregerte proteoglykaner og hyaluronsyre og relativt mindre aggrecan og keratansulfat enn de dypere lokaliserte kondrocytter. Et annet viktig kjennetegn ved metabolisme av kondrocytter isolert fra brusk sonene av forskjellige dybder er responsen på den eksogene stimulansen. Ifølge M. Aydelotte og medforfattere var oksekondrocytene fra bruskens overflatesone mer følsomme for IL-1 enn cellene i den dype sonen.

Oppførselen til cellene avhenger også av plasseringen av vevet. Kondrocytter brusk og øre kanter, tatt fra det samme dyr som reagerer forskjellig på vekstfaktorer, slik som fibroblastvekstfaktor (FGF), og TGF-beta. FGF økt tymidin inkorporering, prolin og leucin til kulturen av kondrocytter ribben men ikke øret. TGF-P økt innlemmelse av thymidin i brusk kondrocytter ribbe og øre, men hadde ingen virkning på tymidininkorporering i kondrocytter og prolin øre. Bruskceller som er oppnådd fra soner som har størst belastning, er forskjellig fra de fra steder med lav belastning på brusk. For eksempel, modne kondrocytter av brusken i kneleddet fra det sentrale område av sau artikulære tibial ben-overflaten som ikke er dekket av menisken, som bærer den største belastning in vivo, mindre syntetisert aggrecan, decorin men større enn cellene i de områder som dekkes av menisken. Forfatterne understreker også betydningen av å bruke brusk fra identiske felles soner når man undersøker den syntetiske funksjonen til leddene.

Metabolismen av kondrocytter og deres respons på regulatoriske faktorer avhenger også avhengig av donorens alder, utviklingen av skjelettet og tilstanden til leddene som cellene tas fra. I humane kondrocytter, observeres en signifikant reduksjon med alderen av den proliferative responsen. Den største reduksjonen observeres hos givere i alderen 40-50 år og over 60 år. Dessuten reduseres sværheten av den proliferative responsen på vekstfaktorer (f.eks. FGF og TGF-beta) under aldring. I tillegg til kvantitative endringer i spredning av kondrocytter, er det også kvalitative endringer. Unge donorceller (10-20 år) reagerer bedre på blodplanteavledet vekstfaktor (PDGF) enn til TGF-beta, mens motsatt observeres i voksne donorceller. For å forklare de aldersavhengige endringene i syntetisk funksjon av kondrocytter og deres respons på effekten av vekstfaktorer, anvendes flere mekanismer. Blant dem er en reduksjon i antall og affinitet av overflatecellulære reseptorer, en endring i syntesen og bioaktiviteten til vekstfaktorer og cytokiner, en modifisering av postreceptorsignaler.

Den patologiske tilstanden til leddene endrer også morfologi og metabolsk aktivitet av kondrocytter. Så, J. Kouri og medforfattere (1996) identifiserte tre subpopulasjoner av kondrocyter i brusk med slitasjegikt. Kondrocyter fra overflaten og øvre midten av brusket danner klynger og syntetiserer flere proteoglykaner og kollagen. TGF-beta og insulinlignende vekstfaktor (IGF) er i stand til å stimulere syntesen av proteoglykaner med kondrocytter og delvis nøytralisere virkningene av IL-1 og TNF-a. Bruskeksplantater ble plaget med slitasjegikt, og kondrocyttene isolert fra brusk fra pasienter med osteoartritt, er mer følsomme for stimulering av TGF-beta enn friske brusk kondrocytter. Disse forskjellene er mest sannsynlig forbundet med fenotypiske endringer i kondrocytter i de øvre lagene i leddbrusk.

Isolering av individuelle kondrocytter oppnås ved sekventiell behandling med proteolytiske enzymer av ECM. Etter frigjøring fra ECM er isolerte celler ideelt egnet for å studere syntesen av de novo matriks komponenter . Noen forfattere bruker bare clostridiumkollagenase, andre preinkuberer brusk med trypsin, pronase, DNase og / eller hyaluronidase. Antallet isolerte celler avhenger av de anvendte enzymene. Således, ved behandling av en av 1 g kollagenase vev kan oppnås 1,4T0 ⁶ kondrocytter, mens det ved bruk av pronase, hyaluronidase og kollagenase - 4,3-10 ⁶. Ved behandling med kollagenase forblir aggrecan, proteiner, IL-6, IL-8 i cellekulturen mye mer enn i tilfelle av sekvensiell behandling med forskjellige enzymer. Det er flere forklaringer for disse forskjellene mellom de to cellekulturer:

• Cellulære reseptorer skadet eller presset ned av virkningen av enzymer, inhiberer TGF-beta DNA-syntese av proteoglykaner i de nylig isolerte kondrocyttene (dag 1), mens den DNA og proteoglykansyntese av kondrocytter dyrket i monolag (7 dager) stimuleres av TGF-beta. Imidlertid, for å utprøve disse membrankomponentene, kreves en tilstrekkelig periode før forsøkets start.
• Eksogene proteaser kan bryte samspillet mellom celler og matrisen, formidlet av integrin. Integrinfamilien fremmer vedlegget av kondrocytter til VKM-molekyler (Shakibaei M. Et al., 1997). Denne brudd kan påvirke ekspresjonen av matriksgener.
• Rester av matriks komponenter kan regulere den syntetiske funksjonen av kondrocytter. Integriner er i stand til å gjenkjenne nedbrytningsprodukter fra ECM, og spiller dermed en viktig rolle i vevsreparasjon etter eksponering for proteolytiske enzymer. T. Larsson og medforfattere (1989) rapporterte at tilsetningen av intakte eller fragmenterte pro-teoglykaner til cellekultur stimulerer syntesen av proteiner og proteoglykaner. Imidlertid har høye nivåer av hyaluronsyre fører til en betydelig reduksjon i innarbeidelse av sulfat proteoglykansyntese av kondrocytter kyllingembryofibroblastere kondrocytter modne svin og rotte kondrosarkom celler. Videre hyaluronsyre - inhibitor av proteoglykan frigjøring fra cellene til og med i nærvær av IL-lb, TNF-a, FGF, noe som indikerer at det første å motvirke den biologiske aktivitet av vekstfaktorer og cytokiner. Den nøyaktige mekanismen som ligger til grund for virkningen av hyaluronsyre forblir uklar; Det er kjent at kondrocytter inneholder en reseptor for hyaluronsyre, assosiert med aktinfilamenter av cytosol. Bindingen av hyaluronsyre til dets reseptor stimulerer fosforyleringen av proteiner. Dermed demonstrerer disse data moduleringen av metabolsk funksjon av kondrocytter av fragmenterte eller native molekyler av matriksproteiner ved å aktivere membranreseptorcellene.
• Den raske stimuleringen av enzymer av syntese av matriksproteiner ved kondrocytter kan være en konsekvens av en forandring i form av kondrocytter og / eller omorganisering av cytoskeletet.
• Noen cytokiner (f.eks. IL-8) og vekstfaktorer (f.eks. IGF-1, TGF-P) er fikset i ECM. Det mest kjente eksempelet er bindingen av TGF-beta med decore, noe som fører til en reduksjon i evnen til den førstnevnte til å indusere celletilvekst i eggstokkceller i kinesiske hamstere. Dataene som innholdet av bruskdekorasjon øker med alderen, indikerer en reduksjon av biotilgjengeligheten av TGF-beta i aldring. Vekstfaktorer og cytokiner kan frigjøres fra matriksrester under dyrking og deretter modulere kondrocytfunksjon.

[8], [9], [10], [11],

Monolagskultur av kondrocytter

Den differensierte fenotypen av kondrocytter er primært preget av syntese av type II kollagen og vevsspesifikke proteoglykaner, samt et lavt nivå av mitotisk aktivitet. Det er dokumentert at langvarig dyrking av celler i et monolag, og etter flere gjentatte passeringer av celler, kondrocytter mister sin kuleform, blir langstrakt, fibroblast-lignende form. Med en slik fibroblast metaplasi syntesefunksjon er også modifiserte celler, karakterisert ved en progressiv reduksjon i syntesen av kollagen II, IX og XI typer og forbedret syntese av kollagen I, III og Utipov. Små ikke-aggregerte proteoglykaner syntetiseres ved funksjonell aggrecan. Syntetasatepsin B og L er ekstremt lav i differensierte celler, men i prosessen med tap av differensiering øker. Kollagenase-1 uttrykkes i differensierte kondrocytter, med langvarig dyrking, reduseres ekspresjonen, mens produksjonen av vevsinhibitorer av metalloproteaser (TIMP) øker.

De differensierte kondrocytter uttrykker kollagen av den differensierte fenotypen når de overføres fra en monolagskultur til en suspendert. Prosessen med differensiering er trolig knyttet til cellens form. Denne egenskapen brukes regelmessig av forskere som studerer defekte transplantasjoner med autologe kondrocytter. Et lite antall celler oppnådd fra et biopsiemateriale kan multipliseres i en monolagskultur og deretter plasseres igjen i en tredimensjonal matrise før transplantasjon. Re-ekspresjon av en spesifikk fenotype ved dedifferentierte kondrocyter overført til en agarosekultur kan stimuleres med TGF-p, et ossein-hydroksyapatittkompleks og askorbinsyre.

Som respons på virkningen av vekstfaktorer og cytokiner, blir kondrocyter modifisert under differensieringsprosessen. Den cellulære responsen på cytokiner og vekstfaktorer varierer mellom utifferentierte og differensierte kondrocytter. IL-1 stimulerer proliferasjonen av fibroblaster, mens veksten av utifferentierte kondrocytter inhiberes av IL-1. Syntese av DNA stimuleres av IGF-1 i langstrakte, men ikke flatete kondrocytter. I de differensierte kondrocytter er de stimulerende effektene av IL-1β og TNF-a på prokollagenaseprodukter mer uttalt enn i utifferentierte.

Dyrking av kondrocytter

Kultivering av kondrocytter i suspensjon i et flytende medium eller i en naturlig eller syntetisk tredimensjonal matrise stabiliserer fondotypen av kondrocyt. Cellene beholder sin sfæriske form, syntetiserer vevsspesifikke proteiner. En vektet kondrocytkultur anbefales vanligvis for studiet av dannelsen av en ny perikellulær matrise. Kondrocytkulturer i syntetiske eller naturlige absorberende polymerer brukes til å implantere celler i bruskdefekter for å stimulere regenerering av bruskvevet i leddet. Syntetisk eller naturlig miljø for implanterbare celler må tilfredsstille et antall krav:

• Implantater bør ha en porøs struktur for vedheft og cellevekst,
• verken polymeren selv eller produktene med nedbrytning av den skal forårsake betennelse eller toksiske reaksjoner under in vivo implantasjon ,
• transplantasjonsbæreren skal kunne binde seg til en tilstøtende brusk eller subchondral bein,
• En naturlig eller syntetisk matrise må være i stand til absorpsjon, dens nedbrytning må balanseres av vevregenerering,
• For å lette brusk reparasjon, bør den kjemiske strukturen og matriksarkitekturen til matrisen bidra til å opprettholde cellefenotypen kodet av kondrocytter og syntese av vevsspesifikke proteiner,
• under implantasjon in vivo, er det nødvendig å studere de mekaniske egenskapene til den syntetiske eller naturlige matrisen.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspensjon av kondrocytter i væskefasen

Cellefesting til plastskåler, karakterisert ved at dyrking av kondrocytter kan forebygges sine vegger er belagt med en løsning metyl-cellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroksyetylmetakrylat) eller en blanding av kollagen-agarose. Under disse forholdene danner kondrocyter klynger og syntetiserer hovedsakelig aggrecan og vevsspesifikke kollagener (II, IX, XI typer). Vanligvis finnes to typer celler. Cellene som ligger i sentrum, beholder en sfærisk form omgitt av et godt utviklet ECM, som bekreftes ved histokjemiske og ultrastrukturelle studier. I periferien har kondrocyter discoide konturer, omgitt av en sjelden ECM; Det er lite kjent om de funksjonelle egenskapene til slike celler.

Dyrking av kondrocyter på mikrobærere støttet i suspensjon er mulig; Dextranperler (cytodex), kollagenbelagte dextranperler (cytodex III), ikke-tomme mikrosfærer av kollagen type I (kollagen) brukes som mikrobærere. Under disse kulturbetingelsene knytter kondrocyter til overflaten av mikrobæreren, beholder sin sfæriske form og frembringer et matrikslignende materiale. Videre fremmer bruken av kollagen spredning av kondrocytter og reekspresjonen av en normal fenotype. Derfor kan dyrking av kondrocytter på mikrosfærene til kollagen brukes til å gjenopprette cellefenotypen før transplantasjon.

En annen metode for dyrking av en suspensjon av kondrocytter i et flytende medium er deres dyrkning i form av tette perler bestående av celler (0,5-1 * 10 ^b ) oppnådd ved sentrifugering. Slike kondrocytter er i stand til å fremstille en matrise som inneholder et stort antall proteoglycaner, kollagen type II, men ikke type I kollagen, som er bekreftet av histologiske, immunohistokemiske og kvantitative metoder.

Suspensjon av kondrocytter i en naturlig ECM

Kondrocytter kan dyrkes i suspensjon i en tredimensjonal matrise (myk agar, agarose, kollagengel eller svamp, hyaluronsyre, fibrinlim, alginatperler).

Kulturerte agarosekondrocytter beholder sin normale fenotype og syntetiserer kollagen type II og vevsspesifikke aggregat-nye aggregater. Når dyrket i agarose, frigjøres celle-syntetiserte proteoglykaner i mediet i 50 dager. Til sammenligning - i monolagskultur er cellefasen overfylt med glykosaminoglykaner allerede i de første 5-6 dager med dyrking; Når dyrket i mediet etter syntesen og frigjøringen av glykosaminoglykaner intensiveres, forekommer den tidsavhengige reduksjonen i glykosaminoglykaner i de første 8-10 dager. Ikke desto mindre, adferd av kondrocytter under dyrking i agarose, er forskjellig fra det i in vivo forhold. I agarose inneholder et stort antall syntetiserte Aggregan-aggregater mindre og mindre molekyler enn in vivo. TGF-P stimulerer syntesen av proteoglycaner i eksplantanten, men reduserer syntesen av aggrecan i agarose.

Alginat er et lineært polysakkarid avledet fra brunt tang. I nærvær av divalente kationer, slik som Ca ^{2 + -ioner}, blir denne polymer en gel. Hver chondrocyttransplantasjon fanget i alginat, omgitt av en matrise av negativt ladede polysakkarider, porene som er sammenlignbare med de av hyaline brusk. Matriksen som er dannet kondrocytter i alginatkuler, som består av to segmenter - et tynt sjikt av celleassosiert matrisen som svarer til den peri-cellulære og territoriale matrikser av leddbrusk og mer fjerntliggende matrise interterritorial tilsvarende i nativt vev. På den 30. Dag i kulturen, relative og absolutte volum som opptas av celler, og hver av de to avdelinger i den alginat vulsten er nesten fullstendig identiske med de av nativt brusk. For nesten 30 dager kondrocytter beholde sin kuleform og produsere aggrecan, hydrodynamiske egenskaper som er lik de av aggrecan molekyler i matrisen av leddbrusk og kollagenmolekyl II, IX og XI typer. På samme tid, i likhet med andre kulturer, suspensjoner, alginatkuler på overflaten av flate celler er til stede som genererer en liten mengde av type I kollagen molekyler, slippes direkte ut i omgivelsene og ikke innlemmet i videospilleren. I alginatperlene blir moderat proliferasjon av kondrocytter observert. Etter 8 måneder med dyrking i alginatgel modne kondrocytter ikke mister metabolsk aktivitet og fortsetter å syntetisere vevsspesifikk kollagen type II og aggrecan.

N. Tanaka og coauthors (1984) undersøkte diffusjonsegenskapene til forskjellige naturlige molekyler i alginatet og fant at molekyler større enn 70 kD ikke diffunderer gjennom alginatet. Dermed er dyrking av celler i alginatet egnet for å studere reguleringen av matriksbiosyntese og organisasjonen av ECM. Tilgjengeligheten av celler dyrket i alginatet tillater en å undersøke effekten av peptidregulerende faktorer og farmakologiske midler på transkriptionelle, posttransskriptjonelle og translasjonelle nivåer.

Kondrocytter dyrkes også i en matrise av kollagenfibre I og II typer. S. Nehrer og medforfattere (1997) sammenlignet funksjonen av hundekondrocytter i porøse kollagen-proteoglykanpolymermatriser som inneholder kollagener av forskjellige typer. De fant viktige forskjeller i morfologien til den biosyntetiske funksjonen av kondrocyter dyrket i kollagenmatriser som inneholder kollagentyper I og II. Celler i matriksen av kollagen type II spolte sin sfæriske form, mens de i type I-kollagen hadde en fibroblastlignende morfologi. Videre produserte kondrocytter i matriksen av type II kollagen flere glykosaminoglykaner. J. Van Susante et al. (1995) sammenlignet egenskapene av kondrocytter dyrket i alginat- og kollagen (type I) -gelen. Forfatterne fant en signifikant økning i antall celler i kollagengelen, men fra den 6. Dyrkningsdagen mistet cellene en karakteristisk fenotype, og ble til fibroblastlignende celler. I alginatgelen ble det observert en reduksjon i antall celler, men kondrocytene beholdt sin normale fenotype. Mengden av kollagengel proteoglykaner per celle var betydelig høyere enn i den alginat, noe som ble observert på gelen matriseelementene syntese ved å starte fra den 6. Dag av dyrking, mens fortsatte å vokse i alginat-syntese.

En solid tredimensjonal fibrinmatrise er en naturlig substans som støtter kondrocytene som veies inn i en differensiert fenotype. 3D-fibrinmatrisen kan også brukes som bærer for kondrocyttransplantasjon. Fordeler med fibrin er fraværet av cytotoksisitet, evnen til å fylle rommet, klebemiddelevnen. Ved histologiske og biokjemiske studier Autoren-diografii, elektronmikroskopi viste at kondrocyttene i fibrin-gelene beholder sin morfologi, formere seg og produsere matrise, selv etter 2 ukers dyrking. Men, G. Homminga og medforfattere (1993) rapporterte at etter 3 dager med dyrking begynner oppløsningen av fibrin, utviklingen av kondrocytter fortskrider.

Suspensjon av kondrocytter i en kunstig (syntetisk) ECM

Bruskimplantater for rekonstruktiv eller ortopedisk kirurgi kan oppnås ved å dyrke isolerte kondrocytter in vitro i en syntetisk, biokompatibel matrise.

Kultivert polyglykolsyrekondrocytter prolifererer og opprettholder normal morfologi og fenotype innen 8 uker. Kondrocyt-polyglykolsyrekomplekset består av celler, glykosaminoglykaner, kollagener, og har en ytre kollagenkapsel. Imidlertid er det i slike implantater to typer kollagenmolekyler - I og II. Implanter fra dedifferentiert av en serie av kondomcytittpassager har et større antall glykosaminoglykaner og kollagen enn i implantater fra primært utifferentierte kondrocytter.

L. Freed og medforfattere (1 993b) sammenlignet oppførselen av humane og oksekondrocytkulturer i fibrøs polyglykolsyre (HPHC) og i polymælkesyre (PPLC). Etter 6-8 ukers dyrking av oksekondrocytter i HSVG eller PPLC, opplevde forfatterne celleproliferasjon og bruskmatrisregenerering. I HSBC var kondrocytene sfæriske, lokalisert i lacunee omgitt av en bruskformig matrise. Etter 8 ukers in vitro- kultur inneholdt det regenererte vev opp til 50% tørrstoff (4% av cellemasse, 15% glykosaminoglykaner og 31% kollagen). I PPLK-celler var spindelformet, en liten mengde glykosaminoglykaner og kollagen. I HSBC var celleveksten 2 ganger mer intens enn i PTCA. I in vivo-forhold produserte kondrocytter dyrket i HPVC og PPLC i 1 til 6 måneder et vev histologisk lik brusk. Implantater inneholdt glykosaminoglykaner, type I og type II kollagener.

Fostale oksekondrocytter ble dyrket i porøs hydrofob hydrofob polyetylen med høy tetthet. Etter 7 dager inkubasjon i begge substrater, beholdt cellene en sfærisk form, hovedsakelig inneholdende type II kollagen. Etter 21 dager dyrking viste det seg at den hydrofile matriksen inneholder mer type II kollagen enn den hydrofobiske matriksen.

Bruskvev kan også oppnås ved dyrking i et monolag på Millicell-CM-filtre. Forbehandling av filtre med kollagen er nødvendig for vedlegg av konditorier. Histologisk undersøkelse av kulturen demonstrerer akkumulering av kondrocytter i ECM-holdige proteoglykaner og type II kollagen. Kollagen type I i en slik kultur oppdages ikke. Kronondroser i det resulterende bruskvævet har en sfærisk form, men på overflaten av vevet er de noe flatt. Tykkelsen av det nydannede vevet økte med tiden og avhengde den opprinnelige tetthet av monolaget av celler. Under optimale kultursituasjoner nådde tykkelsen av bruskvævet 110 μm, organisasjonen av sine celler og kollagen i overflaten og dype lag ligner den for leddbrusk. VKM inneholder omtrent 3 ganger mer kollagen og proteoglykaner. Etter 2 ukers dyrking ble akkumuleringen av matrisen sa notert, noe som gjorde det mulig å trekke ut vevet fra filteret og bruke det til transplantasjon.

Sims et al. (1996) studerte dyrking av kondrocytter i en polyetylenoksyd-gelkapslet polymermatrise som tillater et stort antall celler å bli transportert ved injeksjon. Seks uker etter injeksjon i det subkutane vev av athymiske mus ble det dannet en ny brusk, som morfologisk ble preget av hvit opalescens likt hyalinkrok. Data fra histologiske og biokjemiske studier indikerte tilstedeværelsen av aktivt prolifererende kondrocytter, som produserer ECM.

Explantation

Undersøkelse av bruskvæv brukes til å studere prosesser med ana- og katabolisme i den, homeostase, resorpsjon og reparasjon. Kondrocytter i bruskvævende eksplosiver støtter den normale fenotypen og sammensetningen av ECM, ligner de i leddbrusk in vivo. Etter 5 dager dyrking i nærvær av serum oppnås et konstant nivå av syntese og naturlig nedbrytning. Resorpsjon kan akselerere vevskultur og i hovedkulturen med tillegg av serum ved hjelp av en rekke midler, for eksempel, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivater av retinsyre eller aktive oksygenradikaler. For å studere reparasjon av brusk, er dets skade indusert av løselige mediatorer av betennelse (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) eller fysisk ruptur av matrisen.

Metoden for organotypiske kulturer er en modell for å studere in vitro effekter av isolerte eksterne faktorer på kondrocytter og den omgivende matrisen. In vivo er sjondrocytter sjelden plassert i ECM og ikke kontakt hverandre. Kulturen i den eksplante leddbrusk beholder denne strukturelle organisasjonen, så vel som de spesielle interaksjonene mellom kondrocytter og deres omgivende ekstracellulære miljø. Denne modellen brukes også til å studere effekten av mekanisk stress, farmakologiske midler, vekstfaktorer, cytokiner, hormoner på brusk metabolisme.

En annen fordel ved bruskutveksteksplantering er fraværet av kondrocytskader ved proteolytiske enzymer eller en mekanisk faktor, som er uunngåelig når celler isoleres. Receptorer og andre membranproteiner og glykoproteiner er beskyttet mot skadelige faktorer.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kultur av kondroner

Hondron - strukturelle og funksjonelle og metabolske leddbrusk enhet bestående av kondrocytt pericellulær matrise og den kompakte filament kapsel og er ansvarlig for den homeostase av matrisen. Kondronene ekstraheres mekanisk fra brusk og samles av flere suksessive lavhastighetshomogeniseringer. Isolert fra de soner av forskjellige dybder hondrony brusk kan deles inn i fire kategorier: enkelt hondron, tvilling hondrony, flere (tre eller flere) som er lineært innrettet hondrony (kolonne hondronov) hondronov lunger.

Enkelte kondroner finnes vanligvis i de midterste lagene av intakt brusk, paret - på grensen mellom mellomstore og dype lag, er lineært plassert flere kondroner typiske for dype lag av intakt brusk. Til slutt består klustre av kondroner av tilfeldig organisert gruppe av enkle og parrede kondroner som beholder aggregerte tilstand etter homogenisering. Akkumuleringer av kondroner er store fragmenter av brusk, som vanligvis inneholder flere kondroner og radialt lokaliserte kollagenfibriller, dvs. En typisk organisasjon som er karakteristisk for dype lag av matrisen. Chondroner immobiliseres i en gjennomsiktig agarose, noe som gjør det mulig å studere strukturen, molekylær sammensetning og metabolsk aktivitet. Hondron system - agarose betraktet som en mikro modell av brusk, som er forskjellig fra den tradisjonelle system av kondrocytt - agarose som bevarer den naturlige mikromiljøet, er det ikke nødvendig å utføre dens syntese og montering. Kondrons kultur er en modell for å studere samspillet mellom celler og matriks i leddbrusk under normale og patologiske forhold.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Kultur av udødelige kondrocytter

For å lage permanente cellelinjer, brukes rekombinante DNA eller onkogenholdige virus som kan gjøre cellen "utødelig". Immortale kondrocytter har evnen til uendelig proliferasjon, og opprettholder en stabil fenotype. F. Mallein-Gerin et al (1995) viste at onkogen er SV40T-indusert proliferasjon av muse-kondrocytter som således fortsetter å stabilt uttrykke den kollagen II, IX og XI typer, så vel som felles og aggrecan bindende protein. En slik cellelinje oppnår imidlertid evnen til å syntetisere type I kollagen når den dyrkes i en monolagskultur eller i en agarosegel.

W. Horton og medforfattere (1988) beskrev en rekke immortale celler med et lavt nivå av kollagen type II mRNA-ekspresjon. Disse cellene ble oppnådd ved å transformere dem med et mus-retrovirus inneholdende I-myc- og y-ra-onkogener. Denne typen celler er en unik modell for å studere vekselvirkningen av artikkelmatriksen i fravær av type II kollagen, samt reguleringen av syntese av type II kollagen.

Kondropytekulturen med muterte eller slettede gener er en praktisk modell for å studere sin fysiologiske funksjon. Denne modellen er spesielt egnet for å studere rollen til spesifikke molekyler i bruskmatriks organisasjoner eller undersøkelse av effektene av forskjellige regulerende faktorer på brusk metabolisme. Kondrocytter fjern genet syntetisert kollagen type IX kollagen fibriller som er bredere enn normalt, noe som indikerer at kollagen type IX regulerer diameteren av fibriller. Som jeg nevnt i kapittel 1, den nylig funnet genmutasjon COLAI som koder for type II kollagen i familier med primær generalisert artrose. For å studere effekten av mutant kollagen type II i ledd matrise R. Dharmrvaram et al (1997) utføres transfeksjon ( "forurensning" en fremmed nukleinsyre) defekte COL ₂ AI (arginin i posisjon 519 er erstattet med cystein) i humane kondrocytter in vitro.

System av kulturer. I felles, brusk samvirker med celler av andre typer inneholdt i synovial membran, synovial væske, ledbånd, subchondral bein. Metabolismen av kondrocytter kan påvirkes av forskjellige løselige faktorer syntetisert av disse cellene. Så leddgikt er leddbrusk ødelagt av proteolytiske enzymer og frie radikaler, som produseres av synovialceller. Derfor har modeller blitt utviklet for å studere komplekse interaksjoner mellom brusk og omgivende vev, som kalles kultyring.

S. Lacombe-Gleise et al (1995), ble dyrket kanin kondrocytter og osteoblaster i ko-kultur-system (COSTAR), hvor cellene ble separert mikroporøs membran (0,4 ym) tillater utveksling mellom de to celletypene uten direkte kontakt. Denne studien viste evnen til osteoblaster til å stimulere veksten av kondrocytter gjennom løselige mediatorer.

AM Malfait og medforfattere (1994) undersøkte forholdet mellom monocytter av perifert blod og kondrocytter. Denne modellen er praktisk for å studere prosesser mediert av cytokiner, i inflammatorisk artropati (reumatoid artritt, seronegativ spondylitt, etc.). Forfatterne av modellen separerte cellene med en proteinbindende membran med porer 0,4 um i diameter. Undersøkelsen viste at lipopolysakkarid-stimulerte monocytter utdrevet iFNO IL-1-en, som hemmer syntesen av kondrocytter aggrecan, og bidrar til nedbrytningen av allerede syntetisert aggrecan aggregater.

K. Tada et al (1994) opprettet en ko-kultur modell der endotelceller i kollagen (I-type) gel ble satt inn i det indre kammer fra det ytre kammer adskilt av kondrocytter plassert i et filter med en porestørrelse på 0,4 mikron. I en tilstand av fullstendig isolasjon fra det ytre kammer dannet menneskelige endotelceller rør i en kollagengel i nærvær av EGF eller TGF-a. Ved samtidig dyrkning av begge typer TGF-celler ble den avhengige dannelsen av rørene ved endotelceller inhibert. Kondrocytinhiberingen av denne prosessen ble delvis eliminert av anti-TGF-beta-antistoffer. Det kan antas at TGF-beta produsert av kondrocytene undertrykker vaskulariseringen av brusket selv.

S. Groot og medforfattere (1994) dyrket samtidig kondrocytter fra de hypertrofiske og proliferative sonene i beinet av en 16-dagers føtale mus med deler av hjernevæv. Etter 4 dager med kultur ble transdifferentiering av kondrocytter inn i osteoblaster og begynnelsen av osteoiddannelse observert. Etter 11 dager dyrking ble en del av brusk erstattet av beinvev, og benmatrisen ble delvis kalsifisert. Noen nevropeptider og nevrotransmittere produsert av hjernevev, påvirker metabolisme av osteoblastene eller har reseptorer på dem. Blant dem kan norepinefrin, vasoaktivt tarmpeptid, peptid assosiert med kalsitoningenet, substans P og somatostatin isoleres . Kultivert med kondrocytter, kan biter av hjernevev produsere noen av disse faktorene, noe som kan indusere prosessen med kondrocyttransdifferentiering i osteoblaster.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Innflytelsen av eksterne faktorer på kondroscytokultur

Effekten av oksygenspenning på metabolisme av kondrocytter

I de fleste tilfeller utvikles kondrocytkulturer under betingelser med atmosfærisk oksygenspenning. Ikke desto mindre er det velkjent at in vivo kondrocytter eksisterer under hypoksiske forhold og oksygenspenningen varierer med forskjellige patologiske forhold. Under modningsprosessen observeres signifikante endringer i blodtilførselen av epifysene. Siden vaskularisering varierer i forskjellige områder av vekstplaten, varierer oksygenspenningen i dem også. C. Brighton og R. Heppenstall (1971) viste at i oksen i tibia på kaniner er oksygenspenningen i den hypertrofiske sone mindre enn i den omgivende brusk. Målinger av enkelte metabolske parametere har vist at kondrocytter er i stand til å reagere raskt på lokale endringer i oksygenkonsentrasjon. Først av alt, med lavt oksygenspenning, reduseres forbruket av kondrocytter. Med en reduksjon i oksygenspenningen fra 21 til 0,04%, øker glukoseutnyttelsen, glykolysenzymaktiviteten og melkesyre syntese økes. Selv med lavt oksygenspenning, forblir den absolutte mengden ATP, ADP og AMP stabil. Disse dataene indikerer retningen av kondrocyt metabolisme for å maksimere energibesparelse. Ikke desto mindre endres den syntetiske aktiviteten, og dermed prosessene for reparasjon, under betingelser med hypoksi.

Høy oksygenspenning påvirker også metabolismen av kondrocytter, noe som forårsaker en reduksjon i syntesen av proteoglykaner og DNA, nedbrytning av matriksen i brusk. Disse effektene er som regel ledsaget av produksjon av frie oksygenradikaler.

Påvirkning av ionkoncentrasjon og osmotisk trykk i miljøet på funksjonen av kondrocytter

I naturlig brusk, varierer ionkoncentrasjonen betydelig fra det i andre vev: natriuminnholdet i det ekstracellulære medium er 250-350 mmol, og dets osmolaritet er 350-450 mosmol. Ved isolering av kondrocytter fra en videospiller og inkubering av disse i et standard medium (DMEM (Dulbeccos minimale essensielle medium - Dulbeccos minimale essensielle medium) osmolaritet - 250-280,7 mOsm), endres skarpt omkringliggende miljøet i cellen. I tillegg er konsentrasjonen av kalsium og kalium i standardmedier mye lavere enn i nativt vev, og konsentrasjonen av anioner er mye høyere.

Tilsetning av sukrose til mediet fører til en økning i dens osmolaritet og induserer en forbigående intracellulær økning i konsentrasjonen av H ⁺ og kalsiumanioner i cytosolen. Slike intracellulære forandringer kan påvirke prosessene for kondrocytdifferensiering og deres metabolske aktivitet. J. Urban et al (1993) fant at inkludering av ³⁵ åtte-sulfat og ³ H-prolin isolerte kondrocytter inkubert i DMEM standardmedium i 2-4 timer, var bare 10% av den i den opprinnelige vev. Synteseintensiteten nådde maksimalt med osmolaritet av det ekstracellulære medium på 350-400 mosmol både i de nylig isolerte kondrocytter og i eksplantatene i bruskvævet. Videre økte kondrocytvolumet med 30-40% etter å ha plassert isolerte celler i et standard DMEM medium av nevnte osmolaritet. Imidlertid, når de ble dyrket kondrocytter under ikke-fysiologisk osmolaritet i 12-16 timer, ble cellene tilpasset det nye miljø ved å redusere intensiteten av skjærkraft er proporsjonal biosyntese osmolariteten av det ekstracellulære medium.

P. Borgettis et al (1995) undersøkte effekten av osmolariteten av det ekstracellulære medium på vekst, morfologi, og biosyntesen av svin kondrocytter. Forfatterne demonstrerte lignende biokjemiske og morfologiske egenskaper av kondrocytter dyrket i medier med en osmolaritet mOsm 0,28 og 0,38. Når 0,48 mOsm osmolariteten av mediet i løpet av de første 4-6 timene av kulturen ble det observert reduksjon i celleformering og proteinsyntese, men deretter inntraff gjenopprette disse parametrene som til slutt nådde kontrollverdiene. Ved dyrking av kondrocytter i et medium med 0,58 mOsm osmolaritet cellene mister sin evne til å støtte fysiologisk intensitet proliferative prosesser og etter 6 dager antall kondrocytter er betydelig redusert. Med osmolaritet av mediet, 0,58 mosmol, observeres en dyp inhibering av proteinsyntese. I tillegg, når de dyrkes i medier med en osmolaritet mOsm 0,28-0,38 kondrocytter beholde fysiologisk fenotype ved en høyere osmolaritet (mOsm 0,48-0,58) signifikante endringer i cellemorfologi, som manifesterte tapskarakteristikk fenotype kondrocytter omdannelse inn i fibroblastlignende celler, så vel som cellefeil, evnen til å samle matriksproteoglykaner. Resultatene fra denne studien indikerer kondrocytt respons til svingninger i den begrensede osmolaliteten av det ekstracellulære miljø.

Endringen i konsentrasjonen av andre ioner kan også påvirke biosynteseprosessene i kondrocytter. Dermed økes graden av inklusjon av ³⁵ S (sulfat) med halvparten med en økning i konsentrasjonen av kaliumioner fra 5 mmol (konsentrasjon i et standard DM DM-medium) til 10 mmol (konsentrasjon i VKM in vivo). Kalsiumkonsentrasjon under 0,5 mmol bidro til produksjonen av kollagen av modne oksekondrocytter, mens en konsentrasjon på 1-2 mmol (tilsvarende konsentrasjonen i standard DM DM-medium) forårsaket en signifikant reduksjon i kollagensyntese. En moderat økning i biosyntese ble observert ved høye nivåer av kalsium (2-10 mmol). Ulike kationer deltar i bindingen av kondrocytter til VKM proteiner. Således gir magnesium og manganioner binding til fibronektin og kollagen type II, mens kalsiumioner ikke deltar i bindingen av kondrocytter til proteiner. Resultatene av de beskrevne studier indikerer således påvirkning av endringer i ekstracellulære ioner av kalium-, natrium-, kalsium- og osmolaritet av mediet på den biosyntetiske funksjonen av kondrocyter inkubert i standardmedier.

Påvirkningen av mekanisk stress på metabolisme av kondrocytter

Immobilisering av leddet forårsaker en reversibel atrofi av brusk, noe som indikerer behovet for mekaniske stimuli for det normale forløpet av metabolske prosesser i ECM. I de fleste tilfeller eksisterer cellekulturmodellene under normale atmosfæriske trykkforhold. M. Wright og medforfattere (1996) viste at det mekaniske miljøet påvirker metabolismen av kondrocytter, responsen av celler avhenger av intensiteten og frekvensen av kompresjonsbelastningen. Eksperimenter med lasting på eksplanterte av intakt leddbrusk in vitro viste en nedgang i syntesen av proteiner og proteoglycaner under virkningen av en statisk belastning, mens dynamisk belastning stimulerer disse prosessene. De nøyaktige mekanismer for å realisere effekten av mekanisk stress på brusk er komplekse og er trolig relatert til celledeformasjon, hydrostatisk trykk, osmotisk trykk, elektrisk potensial og overflatecellulære reseptorer til matriksmolekyler. For å studere effekten av hver av disse parametrene, er det nødvendig å opprette et system der en parameter kan variere uavhengig av hverandre. Eksplanterende kultur er for eksempel ikke egnet til å studere celledeformasjon, men den kan brukes til å studere den samlede effekten av trykk på kronisk aktivitet av kondrocytter. Komprimering av brusk fører til celle deformasjon, og også ledsaget av forekomst av hydrostatiske trykkgradient, elektrisk potensial, og fluidstrømning endring fysisk-kjemiske faktorer som vanninnholdet i matrisen, tetthet av elektrisk ladning, nivået av osmotisk trykk. Celldeformasjon kan studeres ved bruk av isolerte kondrocytter nedsenket i en agarose- eller kollagengel.

Flere systemer er utviklet for å studere effekten av mekanisk stimulering på kondrocytterkulturen. Noen forskere bruker systemer til dette formålet, hvor trykket påføres cellekulturen gjennom gassfasen. For eksempel beskriver JP Veldhuijzen et al (1979) ved anvendelse av et trykk over atmosfære på 13 kPa ved en lav frekvens (0,3 Hz) i løpet av 15 minutter, observeres en økning i cAMP-syntese og proteoglykaner og senking DNA-syntese. R. Smith et al (1996) viste at den intermitterende påvirkning av primærkulturer av kondrocytter bull hydrostatisk trykk (10 MPa) ved 1 Hz i 4 timer forårsaket en økning av syntesen av aggrekan og kollagen type II, mens det konstante trykk ikke hadde noen effekt på disse prosessene. Ved hjelp av et lignende system M. Wright et al (1996) rapporterte at den sykliske trykket på cellekultur er assosiert med hyperpolarisering av cellemembranen til kondrocytter og aktivering av Ca ^{2 +} -avhengige kaliumkanaler. Dermed blir virkningene av syklisk trykk mediert av ionkanaler, aktivert ved strekking, i kondrocytmembranen. Responsen av kondrocytter til hydrostatisk trykk avhenger av betingelsene for cellekultur og hyppigheten av den påførte belastning. Således, cyklisk hydrostatiske trykk (5 MPa) reduserer inkorporering av sulfat til chondrocytt monolaget ved en frekvens på 0,05, 0,25 og 0,5 Hz, mens det for frekvenser over 0,5 Hz inkludering sulfat i bruskeksplantatanalyse øker.

M. Bushmann et al. (1992) rapporterte at kondrocytter i en agarosegel-alterbiosyntese som respons på statisk og dynamisk mekanisk stress på samme måte som det dyrkede intakte orgel. Forfatterne fant at den mekaniske belastningen genererer en hyperosmotisk stimulus etterfulgt av en reduksjon i pH i kondrocytene.

Effekten av mekanisk strekking kan studeres på en kultur av celler nedsenket i en gel. Strekningskraften kan opprettes ved hjelp av et datamaskinstyrt vakuum. Når systemet er i en viss grad av vakuum, er bunnen av en petriskål med en kultur av celler som forlenges av en kjent mengde, en maksimal deformasjon på kantene av koppen bunnen og minimum ved senteret. Stretching overføres og dyrkes i en petriskål av kondrocytter. Med denne metoden Holm-vall K. Et al (1995) viste at dyrket i kollagen (II type) gel kondrosarkom celler økte ekspresjon av mRNA og ₂ -integrina. En _2- p _r -integrin er i stand til binding til kollagen type II. Det betraktes som en mekanoreceptor, siden den interagerer med actinbindende proteiner, hvorved forbindelsen mellom ECM og cytoskelettet forbindes.

Effekt av pH på kondrocyt metabolisme

PH i interstitialfluidet av ECM i det bruskvæv er surere enn i andre vev. A. Maroudas (1980) bestemte pH-ledd for leddbrusk ved 6,9. W. Diamant og medforfattere (1966) fant en pH på 5,5 i patologiske forhold. Det er kjent at kondrocytter lever ved lav PO2, noe som indikerer den viktige rollen som glykolyse (95% av total glukosemetabolismen) i metabolisme av disse cellene; glykolyse ledsages av produksjon av en stor mengde melkesyre.

I tillegg til surgjøring av miljøet ved produktene av glykolyse er matrikskomponentene selv av stor betydning. Et stort antall faste negative ladning på de ekstracellulære proteoglykaner modifiserer den ioniske sammensetning: det er en høy konsentrasjon av frie kationer (f.eks H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) og lav konsentrasjon av anioner (f.eks, O2, NPHS). I tillegg, under påvirkning av en mekanisk belastning, blir vann utvist fra ECM, noe som fører til en økning i konsentrasjonen av faste negative ladninger og tiltrekningen av flere kationer til matrisen. Dette er ledsaget av en reduksjon i pH i det ekstracellulære medium, som påvirker intracellulær pH, og derved endrer metabolismen av kondrocytter. R. Wilkin og A. Hall (1995) studerte effekten av pH i det ekstracellulære og intracellulære medium på biosyntesen av matrisen ved isolerte oksekondrocytter. De observert en dobbel modifikasjon av matrisesyntese med en reduksjon i pH. En liten reduksjon i pH-verdien (7,4 35 S0 ₄ og ³ H-prolin til kondrocytter, mens dypere surgjøring (pH <7,1) hemmer syntesen med 75% sammenlignet med kontroll. Opprettelse av samme lave pH (6,65) med ammoniumioner forårsaket en reduksjon i matrisesyntese med bare 20%. De oppnådde resultatene indikerer at modifikasjonen av pH i det ekstracellulære matrikssyntesemedium ikke kan forklares bare ved endringer i pH i det intracellulære medium. Videre kondrocytter har evnen til å regulere intracellulær pH av Na ⁺, H ⁺ veksleren, Ca ⁺ -avhengige C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS og H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Effekt av sammensetningen av mediet for dyrking av metabolisme av kondrocytter

Mediet for dyrking av kondrocytter må korrespondere med forsøksbetingelsene. I de senere år har kalveserum blitt brukt til å optimalisere kulturbetingelsene. Men når du bruker serum, bør du vurdere en rekke viktige punkter:

• ekstern vekst av celler fra vevets periferi i orgelkulturer,
• variabiliteten av sammensetningen av sera av ulike serier,
• tilstedeværelse av ukjente komponenter i dem,
• økt risiko for interferens, artefakter i studiet av påvirkning av ulike biologiske faktorer på cellens metabolske aktivitet.

Et eksempel på sistnevnte er studiet av effekten av EGF på brusk chondrocytter hos rotter. EGF stimulerte inkorporeringen av ³ H-tymidin og en økning i DNA-innhold i kulturen. Denne effekten var mer uttalt ved lave serumkonsentrasjoner (<1%), men i høye konsentrasjoner (> 7,5%) forsvant effekten.

Det er velkjent at nivåer av syntese og nedbrytning i DMEM beriket med kalveserum økes betydelig sammenlignet med in vivo betingelser. Forskjeller mellom in vivo og in vitro metabolisme kan skyldes forskjeller mellom synovialvæsken og miljøet der cellene dyrkes. D. Lee et al (1997), ble dyrket kondrocytter unge okser agarose ved hjelp av et næringsmedium inneholdende DMEM, anriket med 20% kalveserum, og et stort antall allogene normale leddvæske. Tilstedeværelsen av synovialvæske i mediet induserte en økning i antall proteoglykaner, opp til 80% av den totale mengde synovialvæske. Disse resultatene indikerer at leddvæsken i kultur indusere metabolske rate, lik som in vivo, med høye nivåer av syntese av glykosaminoglykaner og lave nivåer av celledeling.

G. Verbruggen et al (1995) viste at syntesen av ³⁵ S-arrpeKaHa humane kondrocytter dyrket i agarose i DMEM uten serum var 20-30% av nivået av syntese ble observert i DMEM, supplert med 10% kalveserum. Forfatterne fastslå i hvilken grad IGF-1, IGF-2, TGF-P eller insulin gjenoppretter produksjonen av aggrecan i serumfrie medier. Forfatterne konkluderte med at 100 ng / ml insulin, IGF-1 eller IGF-2 delvis redusert syntese av aggrecan til 39 til 53% av kontrollnivåene. Med en kombinasjon av disse faktorene er det ikke identifisert noen synergistiske eller kumulative fenomener. På samme tid, 10 ng / ml av TGF-P i nærvær av 100 ng / ml insulin stimulerte syntesen av aggrecan til 90% eller mer av referansenivået. Endelig påvirket serumtransferrin, alene eller i kombinasjon med insulin, ikke syntesen av aggrecan. Når kalveserum ble erstattet med bovinserumalbumin, ble aggregatinnholdet av aggrecan betydelig redusert. Berikning av mediet for insulinkultur, IGF eller TGF-P gjenopprettet delvis cellens evne til å produsere aggrecanaggregater. I dette tilfellet er IGF-1 og insulin i stand til å opprettholde homeostase i cellekulturer. Etter 40 dagers dyrkning i medium supplert med 10 til 20 ng / ml IGF-1, ble proteoglykansyntese opprettholdes på samme nivå eller til og med høyere sammenlignet med medium inneholdende 20% kalveserum. Katabolske prosesser som gikk langsomt i medium supplert med IGF-1 enn i mediet supplert med 0,1% albuminoppløsning, men noe hurtigere i medium supplert med 20% serum. I levende kulturer opprettholder 20 ng / ml IGF-1 en stabil tilstand av celler.

D. Lee et al (1993) sammenlignet effekten av sammensetningen av kulturmedium (DMEM, DMEM + 20% kalveserum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) på DNA-syntesen i en kultur av eksplantatet brusk, monolagskultur og i suspensjon i agarose . Når dyrket i agarose i nærvær av serum, observerte forfatterne en tendens til å gruppere kondrocytter i store klynger. Celler dyrket uten serum eller med IGF-1 ble lagret i en rundformet agarose, samlet i små grupper, men dannet ikke store aggregater. I monolaget var syntesen av DNA signifikant høyere i serumholdig media enn i mediet beriket med IGF-1; Syntesen av DNA i sistnevnte var mye høyere enn i det uberørte miljøet. Ved dyrking av kondrocytter i suspensjon i agarose i ukonsentrert medium og i et medium med IGF-1, ingen forskjell i DNA-syntese. Samtidig oppslemmingen dyrkning av kondrocytter i agarose i medium supplert med serum, ble ledsaget av økt innlemmelse av radionukleotid ³ H-tymidin sammenlignet med andre miljøer.

Vitamin C er nødvendig for aktivering av enzymer involvert i dannelsen av en stabil spiralstruktur av kollagenfibriller. Chondrocytter, mangelfull med hensyn til askorbinsyre, syntetiserer underhydroxylerte ikke-spiralformede forløpere av kollagen, som langsomt utskilles. Innføringen av askorbinsyre (50 μg / ml) forårsaker hydroksylering av kollagen typer II og IX og deres sekresjon i normale mengder. Tilsetningen av vitamin C påvirket ikke nivået på syntesen av proteoglykaner. Følgelig reguleres sekresjonen av kollagen uavhengig av sekretjonen av proteoglykaner.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]