Kunstige hjerteklaffer

Moderne biologiske kunstige hjerteklaffer som er tilgjengelige for klinisk bruk, med unntak av pulmonal autograft, er ikke-levedyktige strukturer som mangler potensial for vekst og vevsreparasjon. Dette setter betydelige begrensninger på bruken av dem, spesielt hos barn, for korrigering av klaffpatologi. Vevsteknikk har utviklet seg de siste 15 årene. Målet med denne vitenskapelige retningen er å skape strukturer som kunstige hjerteklaffer med en tromboseresistent overflate og levedyktig interstitium under kunstige forhold.

[ 1 ], [ 2 ]

Hvordan utvikles kunstige hjerteklaffer?

Det vitenskapelige konseptet vevsteknologi er basert på ideen om å populere og dyrke levende celler (fibroblaster, stamceller, etc.) i et syntetisk eller naturlig absorberbart stillas (matrise), som er en tredimensjonal klaffstruktur, samt bruk av signaler som regulerer genuttrykk, organisering og produktivitet av transplanterte celler i løpet av dannelsesperioden for den ekstracellulære matrisen.

Slike kunstige hjerteklaffer integreres med pasientens vev for endelig restaurering og videre vedlikehold av deres struktur og funksjon. I dette tilfellet dannes et nytt kollagen-elastin-rammeverk, eller mer presist, en ekstracellulær matrise, på den opprinnelige matrisen som et resultat av cellenes funksjon (fibroblaster, myofibroblaster osv.). Som et resultat bør optimale kunstige hjerteklaffer laget ved vevsteknikk være nær den opprinnelige når det gjelder anatomisk struktur og funksjon, og også ha biomekanisk tilpasningsevne, evne til reparasjon og vekst.

Vevsteknikk utvikler kunstige hjerteklaffer ved hjelp av ulike kilder til celleinnsamling. Dermed kan xenogene eller allogene celler brukes, selv om førstnevnte er forbundet med risikoen for å overføre zoonoser til mennesker. Det er mulig å redusere antigenisitet og forhindre avstøtningsreaksjoner i kroppen ved genetisk modifisering av allogene celler. Vevsteknikk krever en pålitelig cellekilde. En slik kilde er autogene celler tatt direkte fra pasienten og produserer ikke immunreaksjoner under reimplantasjon. Effektive kunstige hjerteklaffer produseres på basis av autologe celler hentet fra blodårer (arterier og vener). En metode basert på bruk av fluorescensaktivert cellesortering - FACS - er utviklet for å oppnå rene cellekulturer. En blandet cellepopulasjon hentet fra et blodåre merkes med en acetylert markør med lav tetthetslipoprotein, som absorberes selektivt på overflaten av endotelocytter. Endotelcellene kan deretter enkelt skilles fra hoveddelen av cellene hentet fra karene, som vil være en blanding av glatte muskelceller, myofibroblaster og fibroblaster. Cellekilden, enten det er arterie eller vene, vil påvirke egenskapene til den endelige konstruksjonen. Dermed er kunstige hjerteklaffer med en matrise tilsatt venøse celler bedre i kollagendannelse og mekanisk stabilitet enn konstruksjoner tilsatt arterielle celler. Valget av perifere vener ser ut til å være en mer praktisk kilde for celleinnsamling.

Myofibroblaster kan også høstes fra halspulsårene. Imidlertid har blodåreavledede celler betydelig forskjellige egenskaper fra naturlige interstitielle celler. Autologe navlestrengsceller kan brukes som en alternativ cellekilde.

Kunstige hjerteklaffer basert på stamceller

I de senere årene har fremskritt innen vevsteknologi blitt muliggjort av stamcelleforskning. Bruken av røde benmargsstamceller har sine fordeler. Spesielt gjør enkelheten ved innsamling av biomateriale og in vitro-dyrking med påfølgende differensiering til ulike typer mesenkymale celler det mulig å unngå bruk av intakte kar. Stamceller er pluripotente kilder til cellelinjer og har unike immunologiske egenskaper som bidrar til deres stabilitet under allogene forhold.

Menneskelige røde benmargsstamceller utvinnes ved sternumpunksjon eller iliac kampunksjon. De isoleres fra 10–15 ml sternumaspirat, separeres fra andre celler og dyrkes. Når det nødvendige antallet celler er nådd (vanligvis innen 21–28 dager), sås (koloniseres) de på matriser og dyrkes i et næringsmedium i en statisk posisjon (i 7 dager i en fuktet inkubator ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2). Deretter stimuleres celleveksten gjennom det kuturale mediet (biologiske stimuli) eller ved å skape fysiologiske forhold for vevsvekst under isometrisk deformasjon i et reproduksjonsapparat med en pulserende strømning – en bioreaktor (mekaniske stimuli). Fibroblaster er følsomme for mekaniske stimuli som fremmer deres vekst og funksjonelle aktivitet. Den pulserende strømningen forårsaker en økning i både radiale og sirkumferensielle deformasjoner, noe som fører til orientering (forlengelse) av de befolkede cellene i retning av slike belastninger. Dette fører igjen til dannelsen av orienterte fiberstrukturer i klaffene. En konstant strømning forårsaker kun tangentielle spenninger på veggene. Den pulserende strømningen har en gunstig effekt på cellemorfologi, proliferasjon og sammensetningen av den ekstracellulære matrisen. Næringsmediets strømningsegenskaper, de fysisk-kjemiske forholdene (pH, pO2 og pCO2) i bioreaktoren påvirker også kollagenproduksjonen betydelig. Dermed øker laminær strømning og sykliske virvelstrømmer kollagenproduksjonen, noe som fører til forbedrede mekaniske egenskaper.

En annen tilnærming til dyrking av vevsstrukturer er å skape embryonale forhold i en bioreaktor i stedet for å simulere fysiologiske forhold i menneskekroppen. Vevsbioklaffer dyrket på basis av stamceller har mobile og fleksible klaffer, funksjonelt i stand til å fungere under påvirkning av høyt trykk og strømning som overstiger det fysiologiske nivået. Histologiske og histokjemiske studier av klaffene i disse strukturene viste tilstedeværelsen av aktive prosesser for matriksbiodestruksjon og erstatning av disse med levedyktig vev. Vevet er organisert i henhold til lagdelt type med egenskaper ved ekstracellulære matriksproteiner som ligner på de i nativt vev, tilstedeværelsen av kollagen type I og III og glykosaminoglykaner. Imidlertid ble den typiske trelagsstrukturen til klaffene - ventrikulære, svampete og fibrøse lag - ikke oppnådd. ASMA-positive celler som uttrykker vimentin funnet i alle fragmenter hadde egenskaper som ligner på de hos myofibroblaster. Elektronmikroskopi avdekket cellulære elementer med trekk som er karakteristiske for levedyktige, sekretoriske aktive myofibroblaster (aktin/myosinfilamenter, kollagentråder, elastin) og endotelceller på vevsoverflaten.

Kollagentypene I, III, ASMA og vimentin ble påvist på klaffene. De mekaniske egenskapene til klaffene i vev og naturlige strukturer var sammenlignbare. Kunstige hjerteklaffer i vev viste utmerket ytelse over 20 uker og lignet naturlige anatomiske strukturer i mikrostruktur, biokjemisk profil og proteinmatrisedannelse.

Alle kunstige hjerteklaffer oppnådd ved vevsteknologi ble implantert i dyr i pulmonal posisjon, siden deres mekaniske egenskaper ikke samsvarer med belastningene i aortaposisjon. Vevsklaffene som er eksplantert fra dyr har en struktur som ligner på native klaffer, noe som indikerer deres videre utvikling og omstrukturering in vivo. Hvorvidt prosessen med vevsomstrukturering og modning vil fortsette under fysiologiske forhold etter at de kunstige hjerteklaffene er implantert, slik det ble observert i dyreforsøk, vil bli vist gjennom videre studier.

Ideelle kunstige hjerteklaffer bør ha en porøsitet på minst 90 %, da dette er avgjørende for cellevekst, næringstilførsel og fjerning av cellulære metabolske produkter. I tillegg til biokompatibilitet og biologisk nedbrytbarhet bør kunstige hjerteklaffer ha en kjemisk gunstig overflate for cellesåing og samsvare med de mekaniske egenskapene til naturlig vev. Nivået av matriksbiologisk nedbrytning bør være kontrollerbart og proporsjonalt med nivået av ny vevsdannelse for å sikre mekanisk stabilitet over tid.

For tiden utvikles syntetiske og biologiske matriser. De vanligste biologiske materialene for å lage matriser er donoranatomiske strukturer, kollagen og fibrin. Kunstige hjerteklaffer av polymer blir designet for å brytes ned biologisk etter implantasjon, når de implanterte cellene begynner å produsere og organisere sitt eget ekstracellulære matriksnettverk. Dannelsen av nytt matriksvev kan reguleres eller stimuleres av vekstfaktorer, cytokiner eller hormoner.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Kunstige hjerteklaffer fra donorer

Kunstige donorhjerteklaffer hentet fra mennesker eller dyr og tømt for cellulære antigener ved dekellularisering for å redusere immunogenisiteten deres, kan brukes som matriser. De konserverte proteinene i den ekstracellulære matrisen er grunnlaget for påfølgende adhesjon av podede celler. Følgende metoder for fjerning av cellulære elementer (acellularisering) finnes: frysing, behandling med trypsin/EDTA, detergenter - natriumdodecylsulfat, natriumdeoksykolat, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, samt flertrinns enzymatiske behandlingsmetoder. I dette tilfellet fjernes cellemembraner, nukleinsyrer, lipider, cytoplasmatiske strukturer og løselige matriksmolekyler samtidig som kollagen og elastin bevares. Imidlertid er det ennå ikke funnet en ideell metode. Bare natriumdodecylsulfat (0,03–1 %) eller natriumdeoksykolat (0,5–2 %) resulterte i fullstendig cellefjerning etter 24 timers behandling.

Histologisk undersøkelse av fjernede decellulariserte bioklaffer (allograft og xenograft) i et dyreforsøk (hund og gris) viste delvis endotelisering og innvekst av mottaker-myofibroblaster i basen, uten tegn til forkalkning. Moderat inflammatorisk infiltrasjon ble observert. Imidlertid utviklet det seg tidlig svikt under kliniske studier av den decellulariserte SynerGraft™-klaffen. En uttalt inflammatorisk reaksjon ble oppdaget i bioprotesematrisen, som i utgangspunktet var uspesifikk og ledsaget av en lymfocytisk reaksjon. Dysfunksjon og degenerasjon av bioprotesen utviklet seg i løpet av ett år. Ingen cellekolonisering av matrisen ble observert, men forkalkning av klaffene og preimplantasjonscellerester ble oppdaget.

Cellefrie matriser sådd med endotelceller og dyrket in vitro og in vivo dannet et koherent lag på overflaten av klaffene, og sådde interstitielle celler med den native strukturen viste sin evne til å differensiere. Det var imidlertid ikke mulig å oppnå det nødvendige fysiologiske nivået av cellekolonisering på matrisen under dynamiske forhold i bioreaktoren, og de implanterte kunstige hjerteklaffene ble ledsaget av en ganske rask (tre måneder) fortykkelse på grunn av akselerert celleproliferasjon og dannelse av en ekstracellulær matrise. Dermed har bruken av donorcellefrie matriser for kolonisering med celler på dette stadiet en rekke uløste problemer, inkludert immunologiske og infeksiøse; arbeidet med decellulariserte bioproteser fortsetter.

Det bør bemerkes at kollagen også er et av de potensielle biologiske materialene for produksjon av matriser som er biologisk nedbrytbare. Det kan brukes i form av skum, gel eller plater, svamper og som et fiberbasert emne. Bruken av kollagen er imidlertid forbundet med en rekke teknologiske vanskeligheter. Spesielt er det vanskelig å få tak i fra en pasient. Derfor er de fleste kollagenmatriser for tiden av animalsk opprinnelse. Langsom biologisk nedbrytning av animalsk kollagen kan medføre økt risiko for infeksjon med zoonoser og forårsake immunologiske og inflammatoriske reaksjoner.

Fibrin er et annet biologisk materiale med kontrollerte biologiske nedbrytningsegenskaper. Siden fibringeler kan lages fra pasientens blod for påfølgende produksjon av en autolog matriks, vil implantasjon av en slik struktur ikke forårsake toksisk nedbrytning og inflammatorisk reaksjon. Fibrin har imidlertid ulemper som diffusjon og utvasking til miljøet og lave mekaniske egenskaper.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Kunstige hjerteklaffer laget av syntetiske materialer

Kunstige hjerteklaffer er også laget av syntetiske materialer. Flere forsøk på å produsere klaffmatriser var basert på bruk av polyglaktin, polyglykolsyre (PGA), polymelkesyre (PLA), PGA- og PLA-kopolymer (PLGA) og polyhydroksyalkanoater (PHA). Høyporøst syntetisk materiale kan oppnås fra flettet eller ikke-flettet fiber og ved bruk av saltutvaskingsteknologi. Et lovende komposittmateriale (PGA/P4HB) for fremstilling av matriser oppnås fra ikke-flettede løkker av polyglykolsyre (PGA) belagt med poly-4-hydroksybutyrat (P4HB). Kunstige hjerteklaffer produsert av dette materialet steriliseres med etylenoksid. Imidlertid krever den betydelige initiale stivheten og tykkelsen på løkkene til disse polymerene, deres raske og ukontrollerte nedbrytning, ledsaget av frigjøring av sure cytotoksiske produkter, ytterligere forskning og et søk etter andre materialer.

Bruken av autologe myofibroblastvevskulturplater dyrket på et stillas for å danne støttematriser ved å stimulere produksjonen av disse cellene har gjort det mulig å oppnå klaffprøver med aktive levedyktige celler omgitt av en ekstracellulær matrise. Imidlertid er de mekaniske egenskapene til vevet i disse klaffene fortsatt utilstrekkelige for implantasjon.

Det nødvendige nivået av proliferasjon og vevsregenerering av klaffen som opprettes, kan kanskje ikke oppnås ved å kombinere celler og matriks alene. Cellegenekspresjon og vevsdannelse kan reguleres eller stimuleres ved å tilsette vekstfaktorer, cytokiner eller hormoner, mitogene faktorer eller adhesjonsfaktorer til matriser og stillaser. Muligheten for å introdusere disse regulatorene i matriksbiomaterialer studeres. Totalt sett er det en betydelig mangel på forskning på regulering av vevsklaffdannelse ved biokjemiske stimuli.

Den acellulære xenogene lungebioprotesen fra svin, Matrix P, består av decellularisert vev behandlet etter en spesiell patentert prosedyre fra AutoTissue GmbH, inkludert behandling med antibiotika, natriumdeoksykolat og alkohol. Denne behandlingsmetoden, godkjent av International Organization for Standardization, eliminerer alle levende celler og postcellulære strukturer (fibroblaster, endotelceller, bakterier, virus, sopp, mykoplasma), bevarer arkitekturen til den ekstracellulære matriksen, reduserer nivået av DNA og RNA i vevet til et minimum, noe som reduserer sannsynligheten for overføring av det porcine endogene retroviruset (PERV) til mennesker til null. Matrix P-bioprotesen består utelukkende av kollagen og elastin med bevart strukturell integrasjon.

I saueforsøk ble det registrert minimal reaksjon fra omkringliggende vev 11 måneder etter implantasjon av Matrix P-bioprotesen med god overlevelse, noe som var spesielt tydelig i den skinnende indre overflaten av endokardiet. Inflammatoriske reaksjoner, fortykkelse og forkorting av klaffbladene var så godt som fraværende. Lave kalsiumnivåer i vev i Matrix P-bioprotesen ble også registrert, og forskjellen var statistisk signifikant sammenlignet med de som ble behandlet med glutaraldehyd.

Matrix P kunstige hjerteklaffer tilpasser seg den enkelte pasients tilstand innen få måneder etter implantasjon. Undersøkelsen på slutten av kontrollperioden avdekket en intakt ekstracellulær matriks og konfluent endotel. Matrix R-xenograftet implantert hos 50 pasienter med medfødte defekter under Ross-prosedyren mellom 2002 og 2004 viste overlegen ytelse og lavere transvalvulære trykkgradienter sammenlignet med kryopreserverte og decellulariserte SynerGraftMT-allografter og glutaraldehydbehandlede stillasløse bioproteser. Kunstige hjerteklaffer Matrix P er beregnet for pulmonalventilutskiftning under rekonstruksjon av høyre ventrikkels utstrømningskanal i kirurgi for medfødte og ervervede defekter og under pulmonalventilutskiftning under Ross-prosedyren. De er tilgjengelige i 4 størrelser (etter indre diameter): for nyfødte (15–17 mm), for barn (18–21 mm), mellomstor (22–24 mm) og voksen (25–28 mm).

Fremgang i utviklingen av vevsmodifiserte klaffer vil avhenge av fremskritt innen klaffecellebiologi (inkludert spørsmål om genuttrykk og regulering), studier av embryogen og aldersrelatert klaffeutvikling (inkludert angiogene og nevrogene faktorer), presis kunnskap om biomekanikken til hver klaff, identifisering av tilstrekkelige celler for såing og utvikling av optimale matriser. Videreutvikling av mer avanserte vevsklaffer vil kreve en grundig forståelse av forholdet mellom de mekaniske og strukturelle egenskapene til native klaffer og stimuliene (biologiske og mekaniske) for å gjenskape disse egenskapene in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]