Corynebacterium

Difteri er en akutt infeksjonssykdom, som hovedsakelig rammer barn, og som manifesterer seg som dyp forgiftning av kroppen med difteritoksin og karakteristisk fibrinøs betennelse på stedet der patogenet er lokalisert. Navnet på sykdommen kommer fra det greske ordet difteri - hud, hinne, siden en tett, gråhvit hinne dannes på stedet der patogenet reproduserer seg.

Det forårsakende agenset for difteri - Corynebacterium diphtheriae - ble først oppdaget i 1883 av E. Klebs i filmsnitt, og ble oppnådd i renkultur i 1884 av F. Leffler. I 1888 oppdaget E. Roux og A. Yersin dens evne til å produsere et eksotoksin, som spiller en viktig rolle i etiologien og patogenesen til difteri. Produksjonen av antitoksin-serum av E. Behring i 1892 og bruken av det siden 1894 for behandling av difteri gjorde det mulig å redusere dødeligheten betydelig. Et vellykket angrep på denne sykdommen begynte etter 1923 i forbindelse med utviklingen av en metode for å oppnå difteri-anatoksin av G. Raion.

Det forårsakende agenset for difteri tilhører slekten Corynebacterium (klasse Actinobacteria). Morfologisk kjennetegnes den av at cellene er klubbeformede og fortykkede i endene (gresk coryne - klubbe), danner grener, spesielt i gamle kulturer, og inneholder granulære inneslutninger.

Slekten Corynebacterium omfatter et stort antall arter, som er delt inn i tre grupper.

• Corynebakterier er parasitter hos mennesker og dyr, og sykdomsfremkallende for dem.
• Corynebakterier som er patogene for planter.
• Ikke-patogene korynebakterier. Mange arter av korynebakterier er normale innbyggere i huden, slimhinnene i svelget, nesesvelget, øynene, luftveiene, urinrøret og kjønnsorganene.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologi av korynebakterier

C. diphtheriae er rette eller svakt buede, ikke-bevegelige staver som er 1,0–8,0 μm lange og 0,3–0,8 μm i diameter; de danner ikke sporer eller kapsler. De har ofte hevelser i den ene eller begge ender og inneholder ofte metakromatiske granuler – volutinkorn (polymetafosfater), som får en blålilla farge når de farges med metylenblått. En spesiell Neisser-fargingsmetode er foreslått for å påvise dem. I dette tilfellet farges stavene strågule, og volutinkornene er mørkebrune og er vanligvis plassert ved polene. Corynebacterium diphtheriae farges godt med anilinfargestoffer, er grampositiv, men i gamle kulturer blir den ofte misfarget og har en negativ farging i henhold til Gram. Den er preget av uttalt polymorfisme, spesielt i gamle kulturer og under påvirkning av antibiotika. G+C-innholdet i DNA er omtrent 60 mol%.

Biokjemiske egenskaper til korynebakterier

Difteribasillen er en aerob eller fakultativ anaerob bakterie, den optimale temperaturen for vekst er 35–37 °C (vekstgrenser er 15–40 °C), den optimale pH-verdien er 7,6–7,8. Den er ikke veldig krevende for næringsmedier, men vokser bedre på medier som inneholder serum eller blod. Ostemasse Roux- eller Loeffler-medier er selektive for difteribakterier , og vekst på dem viser seg etter 8–12 timer i form av konvekse kolonier på størrelse med et knappenålshode, gråhvite eller gulaktig kremfargede. Overflaten er glatt eller litt kornete, og koloniene er noe mer gjennomsiktige i periferien enn i midten. Koloniene smelter ikke sammen, noe som resulterer i at kulturen får utseendet til shagreen-lær. På buljongen manifesterer veksten seg som jevn turbiditet, eller buljongen forblir gjennomsiktig, og en tynn film dannes på overflaten, som gradvis tykner, smuldrer og legger seg i flak til bunnen.

Et kjennetegn ved difteribakterier er deres gode vekst på blod- og serummedier som inneholder slike konsentrasjoner av kaliumtelluritt at de undertrykker veksten av andre typer bakterier. Dette skyldes at C. diphtheriae reduserer kaliumtelluritt til metallisk tellur, som, avsatt i mikrobielle celler, gir koloniene en karakteristisk mørkegrå eller svart farge. Bruken av slike medier øker prosentandelen av difteribakteriesåing.

Corynebacterium diphtheriae fermenterer glukose, maltose og galaktose med dannelse av syre uten gass, men fermenterer (som regel) ikke sukrose, har cystinase, har ikke urease og danner ikke indol. I henhold til disse egenskapene skiller de seg fra de koryneforme bakteriene (difteroider) som oftest finnes på øyets slimhinne (Corynebacterium xerosus) og nesesvelg (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) og fra andre difteroider.

I naturen finnes det tre hovedvarianter (biotyper) av difteribasillen: gravis, intermedin og mitis. De skiller seg ut i morfologiske, kulturelle, biokjemiske og andre egenskaper.

Inndelingen av difteribakterier i biotyper ble gjort under hensyntagen til de formene for difteri hos pasienter som de isoleres med størst frekvens fra. Gravis-typen isoleres oftest fra pasienter med en alvorlig form for difteri og forårsaker gruppeutbrudd. Mitis-typen forårsaker mildere og sporadiske tilfeller av sykdommen, og intermedius-typen inntar en mellomposisjon mellom dem. Corynebacterium belfanti, tidligere tilskrevet mitis-biotypen, isoleres som en uavhengig, fjerde biotype. Hovedforskjellen fra gravis- og mitis-biotypene er evnen til å redusere nitrater til nitritter. Corynebacterium belfanti-stammer har uttalte adhesive egenskaper, og både toksigene og ikke-toksigene varianter finnes blant dem.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Antigenisk struktur av korynebakterier

Corynebacterium er svært heterogen og mosaikkartet. Flere dusin somatiske antigener er funnet i alle tre typene difterapatogener, og de er delt inn i serotyper. I Russland er det tatt i bruk en serologisk klassifisering der det skilles mellom 11 serotyper av difteribakterier, hvorav 7 er hovedserotyper (1-7) og 4 er tilleggsserotyper som sjelden forekommer (8-11). Seks serotyper (1, 2, 3, 4, 5, 7) tilhører gravis-typen, og fem (6,8,9,10,11) tilhører mitis-typen. En ulempe med serotypingsmetoden er at mange stammer, spesielt ikke-toksogene, har spontan agglutinasjon eller polyagglutinerbarhet.

[ 11 ]

Fagtyping av Corynebacterium diphtheriae

Ulike fagtypingsskjemaer har blitt foreslått for å differensiere difteribakterier. I henhold til MD Krylovas skjema, ved bruk av et sett på 9 fager (A, B, C, D, F, G, H, I, K), er det mulig å type de fleste toksigene og ikke-toksigene stammer av gravis-typen. Med tanke på følsomhet for de spesifiserte fagene, samt kulturelle, antigene egenskaper og evnen til å syntetisere korykiner (bakteriedrepende proteiner), identifiserte MD Krylova 3 uavhengige grupper av korynebakterier av gravis-typen (I-III). Hver av dem inneholder undergrupper av toksigene og deres ikke-toksigene analoger av difterapatogener.

Corynebacterium-resistens

Corynebacterium diphtheriae viser høy motstand mot lave temperaturer, men dør raskt ved høye temperaturer: ved 60 °C - innen 15–20 minutter, ved koking - etter 2–3 minutter. Alle desinfeksjonsmidler (lysol, fenol, kloramin, etc.) i den vanlige konsentrasjonen ødelegger den på 5–10 minutter. Difteribakterien tåler imidlertid tørking godt og kan forbli levedyktig i lang tid i tørket slim, spytt og støvpartikler. I en fin aerosol forblir difteribakterier levedyktige i 24–48 timer.

Patogenitetsfaktorer for corynebakterier

Patogeniteten til Corynebacterium diphtheriae bestemmes av tilstedeværelsen av en rekke faktorer.

Faktorer for adhesjon, kolonisering og invasjon

Strukturene som er ansvarlige for adhesjon er ikke identifisert, men uten dem ville ikke difteribasillen være i stand til å kolonisere celler. Deres rolle utføres av noen komponenter i patogenens cellevegg. Patogenens invasive egenskaper er assosiert med hyaluronidase, neuraminidase og protease.

Et giftig glykolipid som finnes i celleveggen til patogenet. Det er en 6,6'-diester av trehalose som inneholder korynemykolsyre (C32H64O3) og korynemykolsyre (C32H62O3) i ekvimolare forhold (trehalose-6,6'-dikorynemikolat). Glykolipiden har en destruktiv effekt på vevsceller på stedet for patogenets reproduksjon.

Eksotoksin, som bestemmer patogenesens patogenitet og sykdommens patogenese. Ikke-toksogene varianter av C. diphtheriae forårsaker ikke difteri.

Eksotoksinet syntetiseres som en inaktiv forløper - en enkelt polypeptidkjede med en molekylvekt på 61 kD. Det aktiveres av selve bakterieproteasen, som deler polypeptidet i to peptider bundet sammen av disulfidbindinger: A (mw 21 kD) og B (mw 39 kD). Peptid B utfører en akseptorfunksjon - det gjenkjenner reseptoren, binder seg til den og danner en intramembran kanal gjennom hvilken peptid A trenger inn i cellen og implementerer den biologiske aktiviteten til toksinet. Peptid A er et ADP-ribosyltransferase-enzym, som sikrer overføring av adenosindifosfat-ribose fra NAD til en av aminosyrerestene (histidin) i proteinforlengelsesfaktoren EF-2. Som et resultat av modifikasjonen mister EF-2 sin aktivitet, og dette fører til undertrykkelse av proteinsyntese av ribosomer i translokasjonsstadiet. Toksinet syntetiseres kun av de C. diphtheriae som bærer genene til den moderat konverterende profagen i kromosomet sitt. Operonet som koder for syntesen av toksinet er monocistronisk, det består av 1,9 tusen nukleotidpar og har en toxP-promotor og 3 regioner: toxS, toxA og toxB. ToxS-regionen koder for 25 aminosyrerester av signalpeptidet (det sikrer frigjøring av toksinet gjennom membranen inn i det periplasmatiske rommet i bakteriecellen), toxA - 193 aminosyrerester av peptid A, og toxB - 342 aminosyrerester av peptid B av toksinet. Tap av profagen av cellen eller mutasjoner i tox-operonet gjør cellen svakt toksigen. Lysogenisering av ikke-toksigen C. diphtheriae av den konverterende fagen gjør dem derimot til toksigene bakterier. Dette har blitt entydig bevist: toksigeniteten til difteribakterier avhenger av lysogeniseringen av tokskonverterende korynefager. Korynefager integreres i kromosomet til korynebakterier ved hjelp av mekanismen for stedsspesifikk rekombinasjon, og stammer av difteribakterier kan inneholde 2 rekombinasjonssteder (attB) i kromosomene sine, og korynefager integreres i hvert av dem med samme frekvens.

Genetisk analyse av en rekke ikke-toksogene stammer av difteribakterier, utført ved hjelp av merkede DNA-prober som bærer fragmenter av korynefag-toksoperonet, viste at kromosomene deres inneholder DNA-sekvenser homologe med korynefag-toksoperonet, men de koder enten for inaktive polypeptider eller er i en "stille" tilstand, dvs. inaktive. I denne forbindelse oppstår et svært viktig epidemiologisk spørsmål: kan ikke-toksogene difteribakterier transformeres til toksogene under naturlige forhold (i menneskekroppen), likt det som skjer in vitro? Muligheten for en slik transformasjon av ikke-toksogene kulturer av korynefteribakterier til toksogene ved hjelp av fagkonvertering ble demonstrert i eksperimenter på marsvin, kyllingembryoer og hvite mus. Hvorvidt dette skjer under den naturlige epidemiske prosessen (og i så fall hvor ofte) er imidlertid ennå ikke fastslått.

På grunn av det faktum at difteritoksin i pasientenes kropp har en selektiv og spesifikk effekt på visse systemer (det sympatiske binyresystemet, hjertet, blodårene og perifere nerver er hovedsakelig påvirket), er det åpenbart at det ikke bare hemmer proteinbiosyntesen i celler, men også forårsaker andre forstyrrelser i stoffskiftet deres.

Følgende metoder kan brukes til å oppdage giftigheten til difteribakterier:

• Biologiske dyreforsøk. Intradermal infeksjon av marsvin med et filtrat av en buljongkultur av difteribakterier forårsaker nekrose på injeksjonsstedet. Én minimal dødelig dose toksin (20–30 ng) dreper et marsvin som veier 250 g når det injiseres subkutant på 4.–5. dag. Den mest karakteristiske manifestasjonen av toksinets virkning er skade på binyrene, som er forstørrede og kraftig hyperemiske.
• Infeksjon av kyllingembryoer. Difteritoksin forårsaker deres død.
• Infeksjon av cellekulturer. Difteritoksin forårsaker en tydelig cytopatisk effekt.
• En fastfase enzymbundet immunosorbentanalyse ved bruk av peroksidasemerkede antitoksiner.
• Bruk av en DNA-probe for direkte deteksjon av toksoperonet i kromosomet til difteribakterier.

Den enkleste og vanligste metoden for å bestemme toksisiteten til difteribakterier er imidlertid serologisk - gelutfellingsmetoden. Dens essens er som følger. En stripe sterilt filterpapir som måler 1,5 x 8 cm fuktes med antitoksisk antidifteri-serum som inneholder 500 AE i 1 ml og påføres overflaten av næringsmediet i en petriskål. Skålen tørkes i en termostat i 15–20 minutter. Testkulturene sås med plakk på begge sider av papiret. Flere stammer sås på én skål, hvorav én, åpenbart giftig, fungerer som kontroll. Platene med kulturene inkuberes ved 37 °C, og resultatene tas i betraktning etter 24–48 timer. På grunn av motdiffusjonen av antitoksin og toksin i gelen dannes en tydelig utfellingslinje på stedet for deres interaksjon, som smelter sammen med utfellingslinjen til den toksiske kontrollstammen. Uspesifikke utfellingsbånd (de dannes hvis det i tillegg til antitoksinet finnes andre antimikrobielle antistoffer i små mengder i serumet) opptrer sent, uttrykkes svakt og smelter aldri sammen med utfellingsbåndet til kontrollstammen.

Postinfeksiøs immunitet

Sterke, vedvarende, praktisk talt livslange, gjentatte tilfeller av sykdommen observeres sjelden - hos 5-7% av de som har hatt sykdommen. Immuniteten er hovedsakelig antitoksisk av natur, antimikrobielle antistoffer er av mindre betydning.

Schick-testen ble tidligere mye brukt for å vurdere nivået av anti-difteri-immunitet. For dette formålet ble 1/40 av marsvin-toksinet i et volum på 0,2 ml injisert intradermalt hos barn. Ved fravær av antitoksin-immunitet oppstår rødhet og hevelse med en diameter på mer enn 1 cm på injeksjonsstedet etter 24–48 timer. En slik positiv Schick-reaksjon indikerer enten et fullstendig fravær av antitoksin eller at innholdet er mindre enn 0,001 AE/ml blod. En negativ Schick-reaksjon observeres når antitoksininnholdet i blodet er høyere enn 0,03 AE/ml. Hvis antitoksininnholdet er lavere enn 0,03 AE/ml, men høyere enn 0,001 AE/ml, kan Schick-reaksjonen være enten positiv eller noen ganger negativ. I tillegg har selve toksinet en uttalt allergifremkallende egenskap. For å bestemme nivået av anti-difteriimmunitet (kvantitativt innhold av antitoksin) er det derfor bedre å bruke RPGA med en erytrocyttdiagnostikk sensibilisert med difteritoksoid.

Epidemiologi av difteri

Den eneste smittekilden er en person – en syk person, en person i bedring eller en frisk bærer av bakterien. Smitte skjer gjennom luftbårne dråper, svevestøv og gjennom ulike gjenstander som brukes av syke eller friske bærere: tallerkener, bøker, sengetøy, leker osv. Ved forurensning av matvarer (melk, kremer osv.) er smitte mulig via fordøyelsesveien. Den mest massive utskillelsen av patogenet skjer i den akutte formen av sykdommen. Imidlertid er personer med latente, atypiske former av sykdommen av størst epidemiologisk betydning, siden de ofte ikke blir innlagt på sykehus og ikke oppdages umiddelbart. En pasient med difteri er smittsom i hele sykdomsperioden og deler av rekonvalesensen. Den gjennomsnittlige bærertiden for bakterier hos personer i bedring varierer fra 2 til 7 uker, men kan vare opptil 3 måneder.

Friske bærere spiller en spesiell rolle i epidemiologien til difteri. Ved sporadisk sykelighet er de de viktigste distributørene av difteri, og bidrar til å bevare patogenet i naturen. Gjennomsnittlig varighet av bærertiden for toksogene stammer er noe kortere (ca. 2 måneder) enn for ikke-toksogene (ca. 2–3 måneder).

Årsaken til dannelsen av sunn bærer av toksogene og ikke-toksogene difteribakterier er ikke fullt ut avslørt, siden selv et høyt nivå av antitoksisk immunitet ikke alltid sikrer fullstendig frigjøring av kroppen fra patogenet. Kanskje nivået av antibakteriell immunitet har en viss betydning. Av primær epidemiologisk betydning er bærer av toksogene stammer av difteribakterier.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Symptomer på difteri

Mennesker i alle aldre er utsatt for difteri. Patogenet kan trenge inn i menneskekroppen gjennom slimhinnene i ulike organer eller gjennom skadet hud. Avhengig av lokaliseringen av prosessen, skilles difteri i svelget, nesen, strupehodet, øret, øyet, kjønnsorganene og huden. Blandede former er mulige, for eksempel difteri i svelget og huden, etc. Inkubasjonsperioden er 2-10 dager. Ved den klinisk uttrykte formen for difteri utvikles en karakteristisk fibrinøs betennelse i slimhinnen på stedet der patogenet er lokalisert. Toksinet som produseres av patogenet påvirker først epitelcellene, og deretter de nærliggende blodårene, noe som øker deres permeabilitet. Det utgående ekssudatet inneholder fibrinogen, hvis koagulering fører til dannelse av et gråhvitt filmaktig belegg på overflaten av slimhinnen, som er tett sammenvokst med det underliggende vevet og, når det rives av, forårsaker blødning. Konsekvensen av skade på blodårene kan være utvikling av lokalt ødem. Difteri i svelget er spesielt farlig, da det kan forårsake difteri-krup på grunn av ødem i slimhinnen i strupehodet og stemmebåndene, hvorav 50–60 % av barn med difteri tidligere døde som følge av kvelning. Difteritoksin, som kommer inn i blodet, forårsaker generell dyp forgiftning. Det påvirker hovedsakelig det kardiovaskulære, sympatiske binyresystemet og perifere nerver. Symptomene på difteri består derfor av en kombinasjon av lokale tegn avhengig av lokaliseringen av inngangsporten, og generelle symptomer forårsaket av forgiftning med toksinet, som manifesterer seg i form av adynami, sløvhet, blek hud, lavt blodtrykk, myokarditt, lammelse av perifere nerver og andre lidelser. Difteri hos vaksinerte barn, hvis observert, forløper vanligvis i mild form og uten komplikasjoner. Dødeligheten i perioden før bruk av seroterapi og antibiotika var 50–60 %, nå er den 3–6 %.

Laboratoriediagnostikk av difteri

Den eneste metoden for mikrobiologisk diagnostikk av difteri er bakteriologisk, med obligatorisk testing av den isolerte kulturen av korynebakterier for toksisitet. Bakteriologiske studier for difteri utføres i tre tilfeller:

• for diagnostisering av difteri hos barn og voksne med akutte betennelsesprosesser i svelget, nesen og nasofarynksen;
• i henhold til epidemiologiske indikasjoner fra personer som har vært i kontakt med kilden til difteripatogenet;
• personer som nylig er innlagt på barnehjem, barnehager, internatskoler og andre spesialinstitusjoner for barn og voksne, for å identifisere mulige bærere av difteribasillen blant dem.

Materialet for studien er slim fra svelget og nesen, film fra mandlene eller andre slimhinner, som er inngangspunktet for patogenet. Såing gjøres på tellurittserum eller blodmedium og samtidig på koagulert serum Roux (koagulert hesteserum) eller Loeffler (3 deler bovint serum + 1 del sukkerbuljong) medium, hvor korynebakterievekst vises etter 8–12 timer. Den isolerte kulturen identifiseres ved en kombinasjon av morfologiske, kulturelle og biokjemiske egenskaper, ved bruk av sero- og fagtypingsmetoder når det er mulig. I alle tilfeller er en toksisitetstest ved bruk av en av metodene ovenfor obligatorisk. De morfologiske trekkene til korynebakterier studeres best ved bruk av tre metoder for farging av et smearpreparat: Gram, Neisser og metylenblått (eller toluidinblått).

Behandling av difteri

En spesifikk behandling for difteri er bruk av antitoksisk serum mot difteri som inneholder minst 2000 IE per 1 ml. Serumet administreres intramuskulært i doser fra 10 000 til 400 000 IE, avhengig av sykdommens alvorlighetsgrad. En effektiv behandlingsmetode er bruk av antibiotika (penicilliner, tetracykliner, erytromycin, etc.) og sulfonamider. For å stimulere produksjonen av egne antitoksiner kan anatoksin brukes. For å bli kvitt bakteriebæreren bør antibiotika som den gitte stammen av korynebakterier er svært følsom for, brukes.

Spesifikk profylakse mot difteri

Hovedmetoden for å bekjempe difteri er planlagt massevaksinasjon av befolkningen. For dette formålet brukes ulike vaksinealternativer, inkludert kombinerte, dvs. rettet mot samtidig oppbygging av immunitet mot flere patogener. Den mest utbredte vaksinen i Russland er DPT. Det er en suspensjon av kikhostebakterier adsorbert på aluminiumhydroksid, drept av formalin eller timerosal (20 milliarder i 1 ml), og inneholder difteritoksoid i en dose på 30 flokkulerende enheter og 10 enheter tetanustoksoidbinding i 1 ml. Barn vaksineres fra 3 måneders alder, og deretter utføres revaksinasjoner: den første etter 1,5-2 år, de neste i alderen 9 og 16 år, og deretter hvert 10. år.

Takket være massevaksinasjonen, som startet i Sovjetunionen i 1959, ble forekomsten av difteri i landet innen 1966, sammenlignet med 1958, redusert med 45 ganger, og tallet i 1969 var 0,7 per 100 000 innbyggere. Den påfølgende reduksjonen i vaksinasjonsvolumet på 1980-tallet førte til alvorlige konsekvenser. I 1993-1996 ble Russland rammet av en difteriepidemi. Voksne, hovedsakelig de som ikke var vaksinert, og barn ble syke. I 1994 ble nesten 40 tusen pasienter registrert. I forbindelse med dette ble massevaksinasjonen gjenopptatt. I løpet av denne perioden ble 132 millioner mennesker vaksinert, inkludert 92 millioner voksne. I 2000-2001 var dekningen av barn med vaksinasjoner innenfor den fastsatte perioden 96 %, og med revaksinasjon - 94 %. På grunn av dette ble forekomsten av difteri i 2001 redusert med 15 ganger sammenlignet med 1996. For å redusere forekomsten til isolerte tilfeller er det imidlertid nødvendig å vaksinere minst 97–98 % av barn i løpet av deres første leveår og sikre massevaksinering i de påfølgende årene. Det er usannsynlig at difteri vil bli fullstendig eliminert i de kommende årene på grunn av den utbredte spredningen av toksogene og ikke-toksogene difteribakterier. Det vil også ta litt tid å løse dette problemet.