Stamceller og regenerativ plastisk medisin

I dag er det få praktiserende leger som ikke kjenner til utviklingen av en ny retning i behandlingen av de mest alvorlige sykdommene, som tidligere ikke kunne kureres av tradisjonell og alternativ medisin. Vi snakker om regenerativ-plastisk medisin, basert på bruk av stamcellers regenerative potensial. En enestående vitenskapelig diskusjon og pseudovitenskapelig hype har oppstått rundt utviklingsretningen, i stor grad skapt takket være informasjonshyperbolene på World Wide Web. På svært kort tid har laboratoriestudier av stamcellers terapeutiske evner gått utover eksperimentet og har begynt å bli aktivt introdusert i praktisk medisin, noe som har gitt opphav til en rekke problemer av vitenskapelig, etisk, religiøs, juridisk og lovgivende art. Statlige og offentlige institusjoner har tydeligvis vist seg å være uforberedt på hastigheten på overgangen av stamceller fra petriskåler til systemer for intravenøs administrering, noe som ikke er gunstig for verken samfunnet som helhet eller en spesifikk lidende person. Det er ikke lett å forstå den ufattelige mengden informasjon om stamcellenes evner, både i kvantitet og kvalitet, selv for spesialister (som det ikke finnes noen av, siden alle prøver å mestre den nye vitenskapelige trenden på egenhånd), for ikke å snakke om leger som ikke er direkte involvert i regenerativ plastisk medisin.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Hvorfor er slike eksperimenter nødvendige, og er de i det hele tatt nødvendige?

Ved første øyekast er etableringen av cellulære interspecies-kimærer frukten av den uhemmede fantasien til en fanatisk forsker som har glemt bioetikk. Det er imidlertid denne tilnærmingen som har utvidet vår grunnleggende kunnskap om embryogenese betydelig, siden den har gjort det mulig å beregne antall celler som er nødvendige for organogenese (dannelsen av lever, hjerne, hud og organer i immunsystemet). I tillegg (kanskje dette er det viktigste i ESC-biologi) har genetikere fått et unikt verktøy til rådighet, ved hjelp av hvilket geners funksjonelle formål kan etableres under kimerisering av embryoer. Først brukes en spesiell dobbel knockout-teknikk for å "slå av" det studerte genparet i ESC-er. Deretter introduseres slike ESC-er i en blastocyst, og endringene som skjer i kroppen til det utviklende kimære embryoet overvåkes. På denne måten ble funksjonene til genene sf-1 (utvikling av binyrene og kjønnsorganene), urt-l (nyre-anlage), muoD (skjelettmuskulaturutvikling) og gata-l-4 (anlage av erytropoiese og lymfopoiese) fastslått. I tillegg kan menneskelige gener som ennå ikke er studert, introduseres (transfekteres) i ESC-ene til forsøksdyr for å bestemme deres funksjon ved hjelp av et kimært embryo.

Men som regel finner det ikke støtte fra et bredt publikum å rettferdiggjøre et eksperiment ved å innhente ny grunnleggende kunnskap. La oss gi et eksempel på den anvendte betydningen av kimerisering ved bruk av ESC-er. Først og fremst er dette xenotransplantasjon, det vil si transplantasjon av dyreorganer til mennesker. Teoretisk sett lar opprettelsen av kimærer fra menneske-griseceller oss oppnå et dyr som er mye nærmere ESC-donorens antigene egenskaper, noe som i ulike kliniske situasjoner (diabetes mellitus, levercirrose) kan redde livet til en syk person. Riktignok må vi først lære hvordan vi kan returnere totipotensegenskapen til genomet til en moden somatisk celle, hvoretter den kan introduseres i et utviklende griseembryo.

I dag brukes ESC-enes evne til å dele seg nesten uendelig under spesielle dyrkingsforhold til å produsere totipotent cellemasse med påfølgende differensiering til spesialiserte celler, som dopaminerge nevroner, som deretter transplanteres til en pasient med Parkinsons sykdom. I dette tilfellet innledes transplantasjonen nødvendigvis av målrettet differensiering av den oppnådde cellemassen til spesialiserte celler som er nødvendige for behandling og rensing av sistnevnte fra udifferensierte cellulære elementer.

Som det senere viste seg, var trusselen om karsinogenese langt fra den eneste hindringen for celletransplantasjon. Spontant differensierer ESC-er i embryoide legemer heterogent, det vil si at de danner derivater av et bredt utvalg av cellelinjer (nevroner, keratinocytter, fibroblaster, endotelocytter). I mikroskopets synsfelt skiller kardiomyocytter seg i dette tilfellet ut blant celler av forskjellige fenotyper, som hver trekker seg sammen i sin egen rytme. For å behandle en pasient er det imidlertid nødvendig å ha rene cellepopulasjoner: nevroner - ved hjerneslag, kardiomyocytter - ved hjerteinfarkt, β-celler i bukspyttkjertelen - ved diabetes mellitus, keratinocytter - ved brannskader, etc.

Det neste trinnet i utviklingen av celletransplantasjon var knyttet til utviklingen av teknologier for å oppnå et tilstrekkelig antall (millioner av celler) av slike rene cellepopulasjoner. Søket etter faktorer som forårsaker den målrettede differensieringen av ESC-er var empirisk, siden syntesesekvensen deres under embryogenesen forble ukjent. Først ble det fastslått at dannelsen av plommesekken induseres ved å tilsette cAMP og retinsyre til ESC-kulturen. Hematopoietiske cellelinjer ble dannet i nærvær av 1L-3, SCF, fibroblastvekstfaktor (FGH), insulinlignende vekstfaktor (IGF-1), 1L-6 og granulocyttkolonistimulerende faktor (G-СSF) i kulturmediet. Nervesystemceller ble dannet fra ESC-er etter fjerning av LIF og fibroblastlaget, som fungerte som en mater. Etter behandling med retinsyre i nærvær av føtalt serum, begynte ESC-er å differensiere til nevroner, og kardiomyocytter ble oppnådd ved å tilsette dimetylsulfoksid (DMSO), som gir målrettet levering av hydrofobe signalmolekyler til cellekjernen. I dette tilfellet bidro akkumulering av aktive oksygenarter i kulturmediet, samt elektrisk stimulering, til dannelsen av modne kontraktile kardiomyocytter.

Enorme anstrengelser og ressurser ble brukt på å finne betingelser for differensiering av ESC-er til insulinproduserende celler i bukspyttkjertelen. Det ble imidlertid snart klart at en rekke spesialiserte cellelinjer (pankreatiske β-celler, immun- og endokrine celler, adipocytter) ikke oppstår fra ESC-er når de stimuleres i henhold til prinsippet om "én stimulerende faktor - én cellelinje". Dette prinsippet viste seg å være gyldig bare for et begrenset antall cellelinjer. Spesielt kan dannelsen av nevroner induseres av retinsyre, muskelcellelinjen - av transformerende vekstfaktor-β (TCP-β), erytroide linjer - 1L-6, monocytisk-myeloid linje - 1L-3. Dessuten viste effekten av disse faktorene på differensieringen av ESC-er seg å være strengt doseavhengig.

Fasen med å søke etter kombinasjoner av vekstfaktorer som ville fremme ESC-er til senere stadier av embryogenesen med dannelsen av mesoderm (kilden til kardiomyocytter, skjelettmuskulatur, nyretubuliepitel, myeloerytropoiese og glatte muskelceller), ektoderm (epidermis, nevroner, netthinne) og endoderm (epitel i tynntarmen og sekretoriske kjertler, pneumocytter) begynte. Naturen så ut til å tvinge forskere til å gå videre langs embryogenesens vei, og gjenta stadiene i en petriskål, uten å gi muligheten til å umiddelbart og enkelt oppnå det ønskede resultatet. Og slike kombinasjoner av vekstfaktorer ble funnet. Activin A i kombinasjon med TGF-β viste seg å være en kraftig stimulator for dannelsen av mesodermale celler fra ESC-er, samtidig som den blokkerer utviklingen av endoderm og ektoderm. Retinsyre og en kombinasjon av benmargsmorfogenetisk protein (BMP-4) og epidermal vekstfaktor (EGF) signaler aktiverer dannelsen av ekto- og mesodermceller, og stopper utviklingen av endoderm. Intensiv cellevekst i alle tre kimlagene observeres med samtidig effekt av to faktorer på ESC-er - hepatocyttvekstfaktor (HGF) og nervecellevekstfaktor.

For å oppnå de nødvendige cellelinjene er det derfor nødvendig å først overføre embryonale stamceller til dannelsesstadiet for celler i et kimlag, og deretter velge en ny kombinasjon av vekstfaktorer som er i stand til å indusere den målrettede differensieringen av ekto-, meso- og endoderm til spesialiserte celler som er nødvendige for transplantasjon til pasienten. Antallet kombinasjoner av vekstfaktorer i dag er i tusenvis, de fleste av dem er patenterte, noen er ikke oppgitt i det hele tatt av bioteknologiselskaper.

Det var på tide å rense de oppnådde cellene fra udifferensierte cellulære urenheter. Cellene som var differensiert i kulturen ble merket med markører fra modne cellelinjer og ført gjennom en høyhastighetslaserimmunofenotypisk sorterer. Laserstrålen fant dem i den generelle cellestrømmen og dirigerte dem langs en separat bane. Forsøksdyr var de første som mottok det oppnådde rensede cellematerialet. Det var på tide å evaluere effektiviteten av å bruke ESC-derivater på modeller av sykdommer og patologiske prosesser. En av slike modeller var eksperimentell Parkinsons sykdom, som er godt reprodusert hos dyr ved bruk av kjemiske forbindelser som ødelegger dopaminerge nevroner. Siden sykdommen hos mennesker er basert på en ervervet mangel på dopaminerge nevroner, var bruken av erstatningscelleterapi i dette tilfellet patogenetisk begrunnet. Hos dyr med eksperimentell hemiparkinsonisme slo omtrent halvparten av de dopaminerge nevronene som ble oppnådd fra ESC-er og introdusert i hjernestrukturene rot. Dette var tilstrekkelig til å redusere de kliniske manifestasjonene av sykdommen betydelig. Forsøk på å gjenopprette funksjonen til skadede CNS-strukturer ved eksperimentelle slag, skader og til og med ryggmargsrupturer har vist seg å være ganske vellykkede.

Det bør imidlertid bemerkes at nesten alle tilfeller av vellykket bruk av differensierte ESC-derivater for korrigering av eksperimentell patologi ble utført i den akutte perioden av den simulerte patologiske situasjonen. Resultatene av fjernbehandling var ikke like betryggende: etter 8–16 måneder forsvant eller minket den positive effekten av celletransplantasjon kraftig. Årsakene til dette er ganske klare. Differensiering av transplanterte celler in vitro eller in loco morbi fører uunngåelig til uttrykk av cellulære markører for genetisk fremmedhet, noe som provoserer et immunangrep fra mottakerens kropp. For å løse problemet med immunologisk inkompatibilitet ble tradisjonell immunsuppresjon brukt, parallelt med hvilke kliniske studier begynte å realisere potensialet for transdifferensiering og genetisk korreksjon av autologe hematopoietiske og mesenkymale stamceller som ikke forårsaker en immunkonflikt.

Hva er regenerativ plastisk medisin?

Evolusjonen har identifisert to hovedalternativer for slutten av en celles levetid - nekrose og apoptose, som på vevsnivå korresponderer med prosessene for proliferasjon og regenerering. Proliferasjon kan betraktes som en slags offer, når fyllingen av defekten i skadet vev skjer på grunn av erstatning med bindevevselementer: mens kroppen opprettholder strukturell integritet, mister den delvis funksjonen til det berørte organet, noe som bestemmer den påfølgende utviklingen av kompensasjonsreaksjoner med hypertrofi eller hyperplasi av de strukturelle og funksjonelle elementene som forblir intakte. Varigheten av kompensasjonsperioden avhenger av volumet av strukturelle lesjoner forårsaket av faktorer som primær og sekundær endring, hvoretter det i de aller fleste tilfeller oppstår dekompensasjon, en kraftig forverring av kvaliteten og reduksjon i varigheten av menneskelivet. Fysiologisk regenerering sikrer ombyggingsprosesser, det vil si erstatning av aldrende og døende celler ved mekanismene for naturlig celledød (apoptose) med nye som stammer fra stamcellereservene i menneskekroppen. Prosessene med reparativ regenerering involverer også de cellulære ressursene i stamrommene, som imidlertid mobiliseres under patologiske forhold forbundet med sykdom eller vevsskade, og initierer celledød gjennom nekrosemekanismer.

Den store oppmerksomheten forskere, leger, presse, fjernsyn og publikum har rettet mot problemet med å studere biologien til embryonale stamceller (ESC) skyldes først og fremst det høye potensialet til cellulær eller, som vi kaller det, regenerativ-plastisk terapi. Utviklingen av metoder for behandling av de mest alvorlige menneskelige sykdommene (degenerativ patologi i sentralnervesystemet, ryggmargs- og hjerneskader, Alzheimers og Parkinsons sykdommer, multippel sklerose, hjerteinfarkt, arteriell hypertensjon, diabetes mellitus, autoimmune sykdommer og leukemi, brannskader og neoplastiske prosesser utgjør en langt fra komplett liste) er basert på stamcellenes unike egenskaper, som tillater etablering av nytt vev for å erstatte, som man tidligere trodde, irreversibelt skadede vevsområder i en syk organisme.

Fremgangen innen teoretisk forskning på stamcellebiologi de siste 10 årene har blitt realisert av spontant nye områder innen den nye regenerative-plastiske medisinen, hvis metodikk ikke bare er ganske mottakelig for systematisering, men også krever det. Det første og raskest utviklende området for praktisk bruk av stamcellenes regenerative potensial har blitt erstatningsterapi for regenerativ-plastisk terapi. Veien er ganske lett å spore i den vitenskapelige litteraturen - fra dyreforsøk med myokardnekrose til de siste års arbeid som tar sikte på å gjenopprette postinfarktmangelen på kardiomyocytter eller fylle opp tapet av β-celler i bukspyttkjertelen og dopaminerge nevroner i sentralnervesystemet.

Celletransplantasjon

Grunnlaget for substitutiv regenerativ-plastisk medisin er celletransplantasjon. Sistnevnte bør defineres som et kompleks av medisinske tiltak der pasientens kropp har direkte kontakt med levedyktige celler av auto-, allo-, iso- eller xenogen opprinnelse i en kort eller lang periode. Middelet for celletransplantasjon er en suspensjon av stamceller eller deres derivater, standardisert etter antall transplantasjonsenheter. En transplantasjonsenhet er forholdet mellom antall kolonidannende enheter i kulturen og det totale antallet transplanterte celler. Metoder for celletransplantasjon: intravenøs, intraperitoneal, subkutan administrering av en suspensjon av stamceller eller deres derivater; administrering av en suspensjon av stamceller eller deres derivater i hjernens ventrikler, lymfekar eller cerebrospinalvæske.

Allo- og autolog celletransplantasjon benytter to fundamentalt forskjellige metodologiske tilnærminger til implementering av pluri-, multi- eller polypotent potensial til stamceller - in vivo eller in vitro. I det første tilfellet utføres introduksjonen av stamceller i pasientens kropp uten deres forutgående differensiering, i det andre - etter reproduksjon i kultur, målrettet differensiering og rensing fra udifferensierte elementer. Blant de mange metodologiske teknikkene for erstatningscelleterapi skilles det tydelig mellom tre grupper av metoder: erstatning av benmarg og blodceller, erstatning av organ- og bløtvevsceller, erstatning av stive og solide elementer i kroppen (brusk, bein, sener, hjerteklaffer og kapasitive kar). Sistnevnte retning bør defineres som rekonstruktiv og regenerativ medisin, siden differensieringspotensialet til stamceller realiseres på en matrise - en biologisk inert eller absorberbar struktur formet som det erstattede området av kroppen.

En annen måte å øke intensiteten av regenerativ-plastiske prosesser i skadet vev på er å mobilisere pasientens egne stamressurser ved å bruke eksogene vekstfaktorer, som granulocytt- og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktorer. I dette tilfellet fører brudd på stromale forbindelser til en økning i frigjøringen av hematopoietiske stamceller i den generelle blodbanen, som i området med vevsskade sørger for regenereringsprosesser på grunn av deres iboende plastisitet.

Dermed er metodene innen regenerativ medisin rettet mot å stimulere prosessene for gjenoppretting av tapt funksjon - enten gjennom mobilisering av pasientens egne stamreserver, eller ved å introdusere allogent cellulært materiale.

Et viktig praktisk resultat av oppdagelsen av embryonale stamceller er terapeutisk kloning basert på forståelse av utløserne for embryogenese. Hvis det første signalet for starten av embryogenese er pre-mRNA-komplekset som ligger i oocyttens cytoplasma, bør innføringen av kjernen til en hvilken som helst somatisk celle i det enukleerte egget utløse embryoutviklingsprogrammet. I dag vet vi allerede at rundt 15 000 gener deltar i implementeringen av embryogeneseprogrammet. Hva skjer med dem senere, etter fødselen, i periodene med vekst, modenhet og aldring? Svaret på dette spørsmålet ble gitt av sauen Dolly: de er bevart. Ved hjelp av de mest moderne forskningsmetodene har det blitt bevist at kjernene i voksne celler beholder alle kodene som er nødvendige for dannelsen av embryonale stamceller, kimlag, organogenese og restriksjonsmodning (utgang til differensiering og spesialisering) av cellelinjer av mesenkymal, ekto-, endo- og mesodermal opprinnelse. Terapeutisk kloning som retning ble dannet allerede i de tidligste stadiene av utviklingen av celletransplantasjon og sørger for tilbakeføring av totipotens til pasientens egne somatiske celler for å oppnå genetisk identisk transplantasjonsmateriale.

Oppdagelsen av stamceller begynte «fra slutten», siden begrepet som ble introdusert i biologi og medisin av A. Maksimov refererte til benmargsstamceller, som gir opphav til alle modne cellulære elementer i perifert blod. Hematopoietiske stamceller, som celler i alt vev i en voksen organisme, har imidlertid også sin egen, mindre differensierte forgjenger. Den felles kilden for absolutt alle somatiske celler er den embryonale stamcellen. Det skal bemerkes at begrepene «embryonale stamceller» og «embryonale stamceller» på ingen måte er identiske. Embryonale stamceller ble isolert av J. Thomson fra den indre cellemassen til blastocysten og overført til langlivede cellelinjer. Bare disse cellene har en faksimile av «ESC». Leroy Stevens, som oppdaget embryonale stamceller i eksperimenter på mus, kalte dem «embryonale pluripotente stamceller», med henvisning til ESC-enes evne til å differensiere til derivater av alle tre kimlagene (ekto-, meso- og endoderm). Imidlertid er alle celler i embryoet på senere utviklingsstadier også stamceller, siden de gir opphav til et stort antall celler som danner kroppen til en voksen. For å definere dem foreslår vi begrepet «embryonale pluripotente stamceller».

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Typer stamceller

Den moderne klassifiseringen av stamceller er basert på prinsippet om deres deling etter deres evne (potens) til å gi opphav til cellelinjer, som er definert som toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- og unipotens. Totipotens, det vil si evnen til å gjenskape en genetisk programmert organisme som en helhet, besittes av zygoteceller, blastomerer og embryonale stamceller (celler i blastocystens indre masse). En annen gruppe totipotente celler, som dannes i senere stadier av embryonal utvikling, er representert av primære germinalceller i den embryonale genitalsonen (genital tubercles). Pluripotens, som er evnen til å differensiere til celler i ethvert organ eller vev, er iboende i embryonale celler i de tre kimlagene - ekto-, meso- og endoderm. Det antas at multipotens, dvs. evnen til å danne hvilke som helst celler innenfor én spesialisert linje, er karakteristisk for kun to typer celler: de såkalte mesenkymale stamcellene, som dannes i nevralkammen og er forløperne til alle celler i kroppens bindevevsbase, inkludert nevrogliaceller, samt hematopoietiske hematopoietiske stamceller, som gir opphav til alle blodcellelinjer. I tillegg skilles det mellom bi- og unipotente stamceller, spesielt forløpercellene til myeloide, lymfoide, monocytiske og megakaryocytiske hematopoietiske spirer. Eksistensen av unipotente stamceller er tydelig bevist ved hjelp av eksemplet med leverceller - tapet av en betydelig del av levervevet kompenseres for av den intensive delingen av differensierte polyploide hepatocytter.

Under utviklingen dannes alle organer og vev som et resultat av proliferasjon og differensiering av blastocystens indre cellemasse, hvis celler i streng forstand er totipotente embryonale stamceller. Det første arbeidet med isolering av embryonale stamceller ble utført av Evans, som viste at blastocyster implantert i hjernen til mus gir opphav til teratokarsinomer, hvis celler, når de klones, danner linjer av pluripotente embryonale stamceller (det opprinnelige navnet på disse cellene - embryonale karsinomceller eller i forkortelsen ECС - brukes for tiden ikke). Disse dataene ble bekreftet i en rekke andre studier der embryonale stamceller ble oppnådd ved å dyrke blastocystceller fra mus og andre dyrearter, så vel som mennesker.

I de senere år har litteraturen i økende grad rapportert om stamcellers plastisitet, som ikke bare anses som sistnevntes evne til å differensiere til forskjellige typer celler på forskjellige utviklingsstadier, men også til å gjennomgå dedifferensiering (transdifferensiering, retrodifferensiering). Det vil si at det er en grunnleggende mulighet for å føre en somatisk differensiert celle tilbake til stadiet av embryonal utvikling med rekapitulering (retur) av pluripotens og implementering i gjentatt differensiering med dannelse av celler av en annen type. Spesielt rapporteres det at hematopoietiske stamceller er i stand til transdifferensiering med dannelse av hepatocytter, kardiomyoblaster og endotelocytter.

Vitenskapelige debatter om deling av stamceller i henhold til deres plastisitet fortsetter, det vil si at terminologien og ordlisten for celletransplantasjon er i ferd med å dannes, noe som har direkte praktisk betydning, siden de fleste metodene innen regenerativ plastisk medisin er basert på bruk av plastiske egenskaper og stamcellenes evne til å differensiere til forskjellige cellelinjer.

Antallet publikasjoner innen grunnleggende og anvendte problemer innen regenerativ-plastisk medisin øker raskt. En rekke ulike metodologiske tilnærminger som tar sikte på å utnytte stamcellenes regenerativ-plastiske potensial mest mulig optimalt, er allerede skissert. Kardiologer og endokrinologer, nevrologer og nevrokirurger, transplantasjonsleger og hematologer har identifisert sine områder av presserende interesse. Øyeleger, fisiologer, pulmonologer, nefrologer, onkologer, genetikere, barneleger, gastroenterologer, terapeuter og barneleger, kirurger og fødselsleger-gynekologer leter etter en løsning på presserende problemer i stamcellenes plastiske evner – alle representanter for moderne medisin håper å få muligheten til å kurere sykdommer som tidligere ble ansett som dødelige.

Er celletransplantasjon den neste «universet»?

Dette spørsmålet oppstår med rette hos alle tankefulle leger og vitenskapsmenn som analyserer den nåværende tilstanden til medisinsk vitenskap. Situasjonen kompliseres av det faktum at på den ene siden av feltet for vitenskapelig konfrontasjon står «sunne konservative», på den andre siden – «syke fanatikere» av celletransplantasjon. Sannheten er åpenbart, som alltid, mellom dem – i «ingenmannsland». Uten å berøre spørsmål om lov, etikk, religion og moral, la oss se på fordeler og ulemper ved de utpekte områdene innen regenerativ-plastisk medisin. Den «lette brisen» fra de første vitenskapelige rapportene om de terapeutiske mulighetene til ESC-er ble til en «ruskvind» et år etter oppdagelsen, som virvlet inn i en «informasjonstornado» i 2003. Den første publikasjonsserien omhandlet spørsmålene om dyrking av embryonale stamceller, deres reproduksjon og målrettet differensiering in vitro.

Det viste seg at for ubegrenset reproduksjon av embryonale stamceller i kultur er det nødvendig å strengt overholde en rekke betingelser. Tre faktorer må være tilstede i det kondisjonerte mediet: interleukin-6 (IL-6), stamcellefaktor (SCF) og leukaseinhibitorisk faktor (LIF). I tillegg må embryonale stamceller dyrkes på et substrat (fødelag av celler) av embryonale fibroblaster og i nærvær av føtalt kalveserum. Hvis disse betingelsene er oppfylt, vokser ESC-er i kultur som kloner og danner embryoide legemer - aggregater av suspensjonskloner av sfæriske celler. Det viktigste trekket ved ESC-klonen er at embryoide legemen i kultur slutter å vokse når 50-60, maksimalt 100 celler akkumuleres i aggregatet. I løpet av denne perioden oppstår en likevektstilstand - celledelingshastigheten inne i klonen er lik apoptosehastigheten (programmert celledød) i periferien. Etter å ha oppnådd en slik dynamisk likevekt, gjennomgår de perifere cellene i embryoidkroppen spontan differensiering (vanligvis med dannelse av endodermale fragmenter av plommesekken, angioblaster og endotelocytter) med tap av totipotens. For å oppnå en tilstrekkelig mengde totipotent cellemasse må derfor embryoidkroppen disaggregeres ukentlig med transplantasjon av individuelle embryonale stamceller til et nytt næringsmedium - en ganske arbeidskrevende prosess.

Oppdagelsen av embryonale stamceller besvarte ikke spørsmålet om hva og hvordan som utløser embryogeneseprogrammene som er kryptert i zygotens DNA. Det er fortsatt uklart hvordan genomprogrammet utfolder seg i løpet av menneskelivet. Samtidig gjorde studiet av embryonale stamceller det mulig å utvikle et konsept for mekanismene for å opprettholde toti-, pluri- og multipotensen til stamceller under deling. Det viktigste kjennetegn ved en stamcelle er dens evne til å selvreprodusere seg. Dette betyr at en stamcelle, i motsetning til en differensiert celle, deler seg asymmetrisk: en av dattercellene gir opphav til en spesialisert cellelinje, og den andre beholder toti-, pluri- eller multipotensen til genomet. Det forble uklart hvorfor og hvordan denne prosessen skjer i de tidligste stadiene av embryogenesen, når den delende indre cellemassen i blastocysten er fullstendig totipotent, og ESC-genomet er i en sovende (sovende, hemmet) tilstand. Hvis dupliseringsprosessen nødvendigvis innledes av aktivering og uttrykk av et helt kompleks av gener under deling av en vanlig celle, skjer ikke dette under deling av ESC. Svaret på spørsmålet «hvorfor» ble oppnådd etter oppdagelsen av eksisterende mRNA (pre-mRNA) i ESC-er, hvorav noen dannes i follikulære celler og lagres i cytoplasmaet til egget og zygoten. Den andre oppdagelsen besvarte spørsmålet «hvordan»: spesielle enzymer kalt «editaser» ble funnet i ESC-er. Editaser utfører tre viktige funksjoner. For det første gir de alternativ epigenetisk (uten deltakelse fra genomet) lesing og duplisering av pre-mRNA. For det andre implementerer de prosessen med pre-mRNA-aktivering (spleising - kutting av introner, det vil si inaktive deler av RNA som hemmer prosessen med proteinsyntese på mRNA), hvoretter monteringen av proteinmolekyler begynner i cellen. For det tredje fremmer editaser dannelsen av sekundære mRNA-er, som er repressorer av genuttrykksmekanismer, som opprettholder den tette pakningen av kromatin og den inaktive tilstanden til gener. Proteinprodukter syntetisert på slike sekundære mRNA-er og kalt silencerproteiner eller genomvoktere er tilstede i menneskelige eggceller.

Slik presenteres mekanismen for dannelse av udødelige cellelinjer av embryonale stamceller i dag. Enkelt sagt kommer signalet for å starte embryogeneseprogrammet, hvis innledende stadier består av dannelsen av totipotent cellemasse, fra eggets cytoplasma. Hvis blastocystens indre cellemasse, dvs. ESC, på dette stadiet isoleres fra ytterligere regulatoriske signaler, skjer prosessen med selvreproduksjon av celler i en lukket syklus uten deltakelse fra cellekjernens gener (epigenetisk). Hvis en slik celle forsynes med næringsmateriale og isoleres fra eksterne signaler som fremmer differensiering av cellemassen, vil den dele seg og reprodusere sin egen art i det uendelige.

De første resultatene av eksperimentelle forsøk på å bruke totipotente celler til transplantasjon var ganske imponerende: introduksjonen av embryonale stamceller i vev hos mus med et immunforsvar svekket av immunsuppressiva førte til utvikling av svulster i 100 % av tilfellene. Blant cellene i neoplasmaet, hvis kilde var ESC-er, fantes det differensierte derivater av det totipotente eksogene cellematerialet, spesielt nevroner, men veksten av teratokarsinomer reduserte verdien av de oppnådde resultatene til ingenting. Samtidig, i verkene til L. Stevens, dannet ESC-er introdusert i bukhulen store aggregater der embryonale muskler, hjerte, hår, hud, bein, muskler og nervevev ble fragmentert dannet. (Kirurger som åpnet dermoidcyster bør være kjent med dette bildet). Interessant nok oppfører suspenderte museembryoblastceller seg på nøyaktig samme måte: introduksjonen av dem i vev hos voksne immunkompromitterte dyr forårsaker alltid dannelse av teratokarsinomer. Men hvis en ren linje av ESC-er isoleres fra en slik svulst og introduseres i bukhulen, dannes det igjen spesialiserte somatiske derivater av alle tre kimlagene uten tegn til karsinogenese.

Dermed var det neste problemet som måtte løses å rense cellematerialet fra urenheter fra udifferensierte celler. Selv med en svært høy effektivitet av målrettet celledifferensiering, beholder imidlertid opptil 20 % av cellene i kulturen sitt totipotente potensial, som dessverre realiseres i tumorvekst in vivo. Nok et «slyngeskudd» fra naturen – på skalaen av medisinsk risiko balanserer garantien for pasientens bedring med garantien for hans død.

Forholdet mellom tumorceller og embryonale pluripotente progenitorceller (EPPC-er), som er mer avanserte i utvikling enn ESC-er, er ganske tvetydig. Resultatene fra studiene våre har vist at introduksjon av EPPC-er i ulike transplanterbare tumorer hos rotter kan føre til oppløsning av tumorvev (G), en rask økning i tumormasse (D), reduksjon av tumormasse (E-3), eller ikke påvirker størrelsen på spontan sentral fokal nekrose av neoplastisk vev (I, K). Det er åpenbart at resultatet av interaksjonen mellom EPPC-er og tumorceller bestemmes av det totale settet av cytokiner og vekstfaktorer som produseres av dem in vivo.

Det er verdt å merke seg at embryonale stamceller, som reagerer med karsinogenese på kontakt med voksent vev, assimileres perfekt med embryoets cellemasse og integreres i alle embryoets organer. Slike kimærer, som består av embryoets egne celler og donor-ESC-er, kalles allofene dyr, selv om de faktisk ikke er fenotypiske kimærer. Det hematopoietiske systemet, hud, nervevev, lever og tynntarm gjennomgår maksimal cellulær kimerisering når ESC-er introduseres i et tidlig embryo. Tilfeller av kimerisering av kjønnsorganene er beskrevet. Den eneste sonen som er ukrenkelig for ESC-er er primære kimceller.

Det vil si at embryoet beholder foreldrenes genetiske informasjon, noe som beskytter renheten og fortsettelsen av både slekten og arten.

Under betingelser med blokkering av celledeling i det tidlige embryoet ved bruk av cytoklazin, fører introduksjonen av embryonale stamceller i blastocysten til utviklingen av et embryo hvis primære kimceller, som alle andre, ble dannet fra donorembryonale stamceller. Men i dette tilfellet er selve embryoet fullstendig donor, genetisk fremmed for surrogatmorens kropp. Mekanismene for en slik naturlig blokkering av potensialet for å blande egen og fremmed arvelig informasjon er ennå ikke avklart. Det kan antas at i dette tilfellet realiseres apoptoseprogrammet, hvis determinanter ennå ikke er kjent for oss.

Det skal bemerkes at embryogenesen til dyr av forskjellige arter aldri koordineres: når donorprogrammet for organogenese implementeres i kroppen til mottakerembryoet av xenogene embryonale stamceller, dør embryoet i livmoren og resorberes. Derfor bør eksistensen av kimærer "rotte-mus", "gris-ku", "menneske-rotte" forstås som cellulær, men ikke morfologisk mosaikk. Med andre ord, når ESC-er fra en pattedyrart introduseres i blastocysten til en annen art, utvikles det alltid avkom fra morsarten, der det blant sine egne celler i nesten alle organer finnes inneslutninger, og noen ganger klynger av strukturelle og funksjonelle enheter bestående av genetisk fremmed materiale av ESC-derivater. Begrepet "humanisert gris" kan ikke oppfattes som en betegnelse på et slags monster utstyrt med intelligens eller ytre egenskaper ved et menneske. Dette er bare et dyr, hvis deler av kroppscellene stammer fra menneskelige ESC-er introdusert i blastocysten til en gris.

Utsikter for bruk av stamceller

Det har lenge vært kjent at sykdommer assosiert med genotatologi av hematopoietiske og lymfoide avstamningsceller ofte elimineres etter allogen benmargstransplantasjon. Erstatning av eget hematopoietisk vev med genetisk normale celler fra en beslektet donor fører til delvis og noen ganger fullstendig bedring av pasienten. Blant de genetiske sykdommene som behandles med allogen benmargstransplantasjon, er det verdt å merke seg kombinert immunsviktsyndrom, X-bundet agammaglobulinemi, kronisk granulomatose, Wiskott-Aldrich syndrom, Gauchers og Hurlers sykdom, adrenoleukodystrofi, metakromatisk leukodystrofi, sigdcelleanemi, talassemi, Fanconis anemi og AIDS. Hovedproblemet ved bruk av allogen benmargstransplantasjon i behandlingen av disse sykdommene er knyttet til valget av en HbA1c-kompatibel beslektet donor, hvor det kreves et gjennomsnitt på 100 000 prøver av typet donorhematopoietisk vev.

Genterapi tillater korrigering av en genetisk defekt direkte i pasientens hematopoietiske stamceller. Teoretisk sett gir genterapi de samme fordelene i behandlingen av genetiske sykdommer i det hematopoietiske systemet som allogen benmargstransplantasjon, men uten alle mulige immunologiske komplikasjoner. Dette krever imidlertid en teknikk som muliggjør effektiv overføring av et fullverdig gen til hematopoietiske stamceller og opprettholdelse av det nødvendige nivået av dets uttrykk, som i visse typer arvelig patologi kanskje ikke er veldig høyt. I dette tilfellet gir selv en liten påfylling av proteinproduktet fra det mangelfulle genet en positiv klinisk effekt. Spesielt ved hemofili B er 10–20 % av det normale nivået av faktor IX tilstrekkelig for å gjenopprette den interne mekanismen for blodkoagulasjon. Genmodifisering av autologt cellemateriale har vist seg vellykket i eksperimentell hemiparkinsonisme (ensidig ødeleggelse av dopaminerge nevroner). Transfeksjon av rotteembryonale fibroblaster med en retroviral vektor som inneholder tyrosinhydroksylase-genet sikret syntesen av dopamin i sentralnervesystemet: intracerebral administrering av transfekterte fibroblaster reduserte kraftig intensiteten av kliniske manifestasjoner av en eksperimentell modell av Parkinsons sykdom hos forsøksdyr.

Muligheten for å bruke stamceller til genterapi for menneskelige sykdommer har gitt mange nye utfordringer for klinikere og eksperimentatorer. De problematiske aspektene ved genterapi er knyttet til utviklingen av et trygt og effektivt system for gentransport inn i målcellen. For tiden er effektiviteten av genoverføring til store pattedyrceller svært lav (1 %). Metodisk løses dette problemet på ulike måter. In vitro-genoverføring innebærer transfeksjon av genetisk materiale inn i pasientens celler i kultur, med påfølgende retur til pasientens kropp. Denne tilnærmingen bør anerkjennes som optimal når man bruker gener introdusert i benmargsstamceller, siden metodene for å overføre hematopoietiske celler fra kroppen til kultur og tilbake er veletablerte. Retrovirus brukes oftest til genoverføring til hematopoietiske celler in vitro. Imidlertid er hoveddelen av hematopoietiske stamceller i en sovende tilstand, noe som kompliserer transporten av genetisk informasjon ved bruk av retrovirus og krever et søk etter nye måter for effektiv gentransport inn i sovende stamceller. For tiden brukes genoverføringsmetoder som transfeksjon, direkte mikroinjeksjon av DNA i celler, lipofeksjon, elektroporering, «genpistol», mekanisk kobling ved bruk av glasskuler, transfeksjon av hepatocytter med reseptoravhengig DNA-kobling til asialoglykoprotein og aerosolinnføring av transgenet i cellene i lungenes alveolare epitel. Effektiviteten av DNA-overføring med disse metodene er 10,0–0,01 %. Med andre ord, avhengig av metoden for å introdusere genetisk informasjon, kan man forvente suksess hos 10 pasienter av 100 eller hos 1 pasient av 10 000 pasienter. Det er åpenbart at en effektiv og samtidig sikker metode for overføring av terapeutiske gener ennå ikke er utviklet.

En fundamentalt annerledes løsning på problemet med avstøting av allogent cellemateriale i celletransplantasjon er bruken av høye doser embryonale pluripotente stamceller for å oppnå effekten av reinstallasjon av antigenhomeostasekontrollsystemet hos en voksen organisme (Kukharchuk-Radchenko-Sirman-effekten), hvis essens ligger i induksjon av immunologisk toleranse ved å skape en ny base av immunkompetente celler med samtidig omprogrammering av antigenhomeostasekontrollsystemet. Etter introduksjon av høye doser EPPC fikseres sistnevnte i vevet i thymus og benmarg. I thymus differensierer EPPC, under påvirkning av et spesifikt mikromiljø, til dendrittiske, interdigitate celler og epitel-stromale elementer. Under differensieringen av EPPC-er i mottakerens tymus, sammen med mottakerens egne molekyler i det store histokompatibilitetskomplekset (MHC), uttrykkes MHC-molekyler som er genetisk bestemte i donorceller, det vil si at det etableres en dobbel standard for MHC-molekyler, ifølge hvilken positiv og negativ seleksjon av T-lymfocytter realiseres.

Dermed skjer fornyelsen av effektorkoblingen i mottakerens immunsystem gjennom de kjente mekanismene for positiv og negativ seleksjon av T-lymfocytter, men gjennom dobbeltstandarden for MHC-molekyler - mottaker- og donor-EPPC-ene.

Omprogrammering av immunforsvaret ved hjelp av EPPC tillater ikke bare celletransplantasjon uten påfølgende langvarig bruk av immunsuppressiva, men åpner også helt nye muligheter i behandlingen av autoimmune sykdommer, og gir fotfeste for utvikling av nye ideer om den menneskelige aldringsprosessen. For å forstå mekanismene bak aldring har vi foreslått en teori om uttømming av kroppens stamceller. I henhold til hovedbestemmelsen i denne teorien er aldring en permanent reduksjon i størrelsen på kroppens stamceller, som forstås som en pool av regionale ("voksne") stamceller (mesenkymale, nevrale, hematopoietiske stamceller, progenitorceller i huden, fordøyelseskanalen, endokrine epitel, pigmentceller i ciliære folder, etc.), som etterfyller de cellulære tapene til det tilsvarende vevet i prosessen med kroppsombygging. Kroppsombygging er fornyelsen av den cellulære sammensetningen av alt vev og organer på grunn av stamceller, som fortsetter gjennom hele livet til en flercellet organisme. Antallet celler i stamcellene bestemmes genetisk, noe som bestemmer den begrensede størrelsen (proliferativt potensial) til hvert stamcellerom. Størrelsen på stamrommene bestemmer igjen aldringshastigheten til individuelle organer, vev og kroppssystemer. Etter at stamrommenes cellulære reserver er uttømt, bestemmes intensiteten og aldringshastigheten til en flercellet organisme av aldringsmekanismene til somatiske differensierte celler innenfor Hayflick-grensen.

Derfor kan utvidelsen av stammellomrom i stadiet av postnatal ontogenese ikke bare øke levetiden betydelig, men også forbedre livskvaliteten ved å gjenopprette kroppens ombyggingspotensial. Utvidelsen av stammellomrom kan oppnås ved å introdusere store doser allogene embryonale pluripotente stamceller, forutsatt at mottakerens immunsystem samtidig omprogrammeres, noe som øker levetiden til gamle mus i eksperimentet betydelig.

Teorien om uttømming av stamcellereserver kan endre eksisterende ideer ikke bare om aldringsmekanismene, men også om sykdommen, samt konsekvensene av medikamentindusert behandling. Spesielt kan sykdommen utvikle seg som et resultat av patologi i stamcelleceller (onkopatologi). Uttømming av mesenkymale stamcellereserver forstyrrer prosessene med bindevevsremodellering, noe som fører til utseendet av ytre aldringstegn (rynker, slapphet i huden, cellulitter). Uttømming av stamcellereserven til endotelceller forårsaker utvikling av arteriell hypertensjon og aterosklerose. Den initialt lille størrelsen på thymus-stammerommet bestemmer dens tidlige permanente aldersrelaterte involvering. For tidlig aldring er en konsekvens av den initiale patologiske reduksjonen i størrelsen på alle stammelrom i kroppen. Medikamentell og ikke-medikamentell stimulering av stamcellereserver forbedrer livskvaliteten ved å redusere varigheten, siden den reduserer størrelsen på stammelrommene. Den lave effektiviteten til moderne geroprotektorer skyldes deres beskyttende effekt på aldrende differensierte somatiske celler, og ikke på kroppens stammelrom.

Avslutningsvis vil vi igjen bemerke at regenerativ-plastisk medisin er en ny retning i behandlingen av menneskelige sykdommer basert på bruk av stamcellers regenerativ-plastiske potensial. I dette tilfellet forstås plastisitet som evnen eksogene eller endogene stamceller har til å bli implantert og gi opphav til nye spesialiserte cellespirer i skadede vevsområder i en syk organisme. Formålet med regenerativ-plastisk medisin er dødelige menneskelige sykdommer som for tiden er uhelbredelige, arvelig patologi, sykdommer der tradisjonelle medisinske metoder bare oppnår en symptomatisk effekt, samt anatomiske defekter i kroppen, hvis restaurering er målet med rekonstruktiv-plastisk regenerativ kirurgi. Etter vår mening er det for tidlig å betrakte de første forsøkene på å gjenskape hele og funksjonelt komplette organer fra stamceller som et eget område innen praktisk medisin. Temaet for regenerativ-plastisk medisin er stamceller, som, avhengig av kilden til mottakelsen, har ulikt regenerativt-plastisk potensial. Metodikken for regenerativ plastisk medisin er basert på transplantasjon av stamceller eller deres derivater.