Embryonale stamceller

Oppdagelsen av embryonale stamceller - det var ingen ulykke, og dukket opp på forberedt jord forskning innen utviklingsbiologi forskning. Begrepet "stamcelle" ble introdusert i medisin så langt tilbake som 1908 på kongressen til det hematologiske samfunnet i Berlin av Alexander Maksimov i forbindelse med hematopoietiske celler. Lenge før isolering og fremstilling av stabile linjer av pluripotente stamceller i den tidlige utviklingen av undersøkelsesprosessen anvendes stammen terato- (embryo-carcinomaceller som studerte ukjente mekanismer av embryogenesen, innbefattende sekvensen av ekspresjon av tidlige gener og proteinprodukter med sitt arbeid.

Men er totipotency av det menneskelige genomet uopprettelig tapt i utviklingsprosessen? Nei, og embryogenese er bevis. Hvis dette er slik, da da i prinsippet vil den andre utviklingsveien bli realisert? Sannsynligvis når en person forlater kosmos, hvor miljøforholdene vil være relativt konstant i ganske lang tid. Bentap (ben demineralisering i en vektløs tilstand) meget langsomt mottagelig remodellering og regenerering kan betraktes som et første trinn til human tilpasningsprosessen som en art av eksistens på plass. Betalingen for den andre utviklingsveien vil imidlertid være forskjellig - sterilitet vil være prisen å betale tilbake til alle celler av totipotency og absolutt plastisitet. Så mange ganger i denne verden av "evolusjonære kameleoner" vil ikke ha noen meiosis, otpochkovaniem. Men vi vil leve lenge. Telomerase udødelighet er utødeligheten av amoeba. I en multicellular organisme er stamceller substratet for kvantitativ og kvalitativ levetid.

[1], [2], [3], [4]

Kilder til embryonale stamceller

Dag kilder embryonale stamceller for laboratorietestene er Linje murine teratocarcinomer (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, RI, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) og human teratokarsinom (NTERA-2 Tera-2 , H-9 klon), så vel som Hess Trauneona. Men tilstedeværelsen detaljerte cellulære pass som angir immun fenotype, kromosom analyseresultatene av mRNA-ekspresjon profiler eksponerte reseptorer og proteiner, intracellulær signalisering ikke kompenserer for betydelige ulemper teratokartsinomnyh linjer ESC - hurtig tap av totipotency og umuligheten av anvendelse, i kliniske studier, og blandet differensiering i kultur er meget vanskelig å isolere ren spesialisert linje fra en heterogen cellepopulasjon. Derfor er vanligvis en kilde ESC linjer produsert for kliniske formål, tjener som den indre cellemasse av blastocysten, embryoer individuelle blastomeres av 8-celle utviklingsstadium, celler morula senere trinn, og primærkjønnscelle.

Det skal bemerkes at teratokarcinomceller, selv om de har egenskapen til pluripotens, har et signifikant lavere pluripotent potensial sammenlignet med ESC. Deres integrasjon med embryonale celler fører sjelden til dannelsen av kimærer, der i tillegg aldri gameter med en genotype av teratokarcinomceller dannes. Det antas at dette skyldes hyppig utseende av kromosomale abnormiteter ved dyrking av teratokarcinceller: tap av Y-kromosomet, forskjellige trisomi, deletjoner eller translokasjoner.

Forsøk på å skille den menneskelige ESC-linjen har blitt gjennomført mange ganger, men denne oppgaven kunne ikke løses, da normale humane blastocysts er vanskelige å få tilgang til objekter. I tillegg er frekvensen av kromosomale abnormiteter hos mennesker høyere enn hos dyrs embryogenese. Det overvektige flertalet av tidlige humane embryoer oppnådd etter in vitro befruktning utviser kaotisk kromosomal mosaikk, og ofte er det numeriske og strukturelle avvik. Selv senere, i blastocyststadiet, består bare 20-25% av menneskelige embryoer av celler med normal karyotype. Det var nesten umulig å bruke slike embryoer til å lage et ESC, siden zygoter vanligvis ble dyrket til stadiene av to eller fire blastomerer og deretter transplantert i livmoren. Bare relativt nylig var en pålitelig teknikk utviklet for dyrking av befruktede humane eggsler til blastocyststadiet. Innføringen av denne teknikken i praksis med in vitro befruktning økte ikke bare hyppigheten av vellykket implanteringsutfall, men gjorde også normale blastocystene en mer tilgjengelig gjenstand.

En annen pluripotent stamcelle kilde er de primære kjønnsceller, som, i motsetning til de mer avanserte progenitor-populasjon germenativnogo epitel, er ikke på overflaten av beta-integrin, men uttrykker høy aktivitet shelochnoy fosfatase. Det skal bemerkes at i forsøket har populasjonen av stamceller, som ble dannet fra primære kjønnceller, blitt studert siden 80-tallet i forrige århundre. Samtidig ble en teknikk for isolering av primære kimceller fra rudimentet av musembryongonaden utviklet. De første mislykkede resultatene av dyrking primordial kjønnsceller in vitro tyder det nytteløse i dette arbeidet, som cellene, men overlevde, men ikke sprer og døde i løpet av den første dagen. Senere ble det funnet at musens primære bakterieceller reproduserer in vitro bare i nærvær av oppløselige og membranbundne spesifikke polypeptidvekstfaktorer i kulturmediet. Tallrike studier har indikert at det er nødvendig tilstedeværelsen i kulturmediet ikke bare LIF, men membrannosvyazannyh og stål-oppløselig faktor (SIF) for overlevelse og proliferasjon av opphavelige kjønnsceller. Disse peptidene er produsert av somatiske celle embryoer som er homozygote for mutasjonen av stål, og en av dem er en ligand av proto-onkogen cKit.

Primære bakterieceller av pattedyr og mennesker har ekstragonadal opprinnelse og er kilden til den klonale utviklingen av kjønnscellelinjen. Startlinjen opprinnelige bakterieceller, så vel som alle vev av embryoet og extraembryonic mesoderm gir epiblast (primær ektoderm) tidlige embryoer som har mosaikk strukturell organisasjon. Den mikrokirurgiske fjerning av ulike deler av det tidlige embryoet etablerte en lokaliseringssone i epiblastet av en klon av forgjorte forløperne til primære bakterieceller. Ved hjelp av rhodamin dextran, som ble brukt som en cellemarkør, ble det etablert at forløpene til de primære seksuelle cellene befinner seg i den proximale epiblastregionen ved siden av den ekstra-embryonale ektodermen. Den primære seksuelle cellelinjen kommer fra 45-celleklonen, hvorav tildeling skjer i begynnelsen av gastrulasjonen. Deretter forekommer klonsegregasjonen, og under gastrulasjonen går de primære kjønnceller inn i det ekstraembryoniske mesoderm og er funnet i basen av allantois-budet, bak primærbåndet. Derfra migrerer de primære bakteriecellene mot den ventrale enden av endocervix endodermen og beveger seg aktivt langs mesenteriet, idet de befinner seg i kjønnsrullene ved slutten av overføringen. I prosessen med migrasjon, så vel som i de første 2-3 dagene av lokalisering i gonadrudimentet, prolifererer de primære seksuelle cellene aktivt og gjennomgår åtte replikative sykluser. Hvis i begynnelsen av migrasjonen er det ca. 50 primære kimceller, i reproduktive cyster av musembryoer i en 12-dagers utvikling, overstiger antall primære kjønnceller 25.000.

Den funksjonelle likhet mellom ESCs og opphavelige kjønnsceller demonstrerer full integrering av den sistnevnte i utskifting blastocyst indre cellemasse og etterfølgende fulle utvikling av embryoet, vev som bare består av etterkommere opphavelige kjønnsceller. I henhold til andre kjennetegn murine primære kimceller PGC-er var også identiske, som viser evnen til å differensiere i forskjellige retninger, for å danne embryoidlegemer in vitro, en in vivo danner teratomas når injisert subkutant i immunodefekte mus som ligner spontane teratomas testis-mus linje 129 / ter.

Det er fastslått at når det tilsettes til LIF medium, og løselig membrannosvyazannogo SIF isolert primærkjønnsceller fra 8-dagers murine embryoer overleve og formere seg i kultur i 4 dager, men da dø. Videre er den periode når kulturen av død ble observert opphavelige kjønnsceller sammenfaller med det stadium i utviklingen av museembryoer (12,5-13,5 dager), når knoppene primære gonadale hunnkjønnsceller gå inn meiose, og i de mannlige kjønnsopphavelige celler er blokkert mitotisk divisjon. Men hvis du legger til miljøet ikke bare vekstfaktorer LIF og SIF, men også av FGF2, de primære kjønnsceller fortsette proliferirovat, og subkulturer dannes cellekolonier kan reprodusere selv etter å ha blitt fjernet fra miljøet av vekstfaktorer (SIF og FGF). Slike celler kan dyrkes i lang tid på det embryonale fibroblast-substratet uten tilsetning av løselig vekstfaktor LIF. Det er disse stabile cellelinjer avledet fra primære bakterieceller som ble foreslått å bli kalt embryonale bakterieceller. Dette begrepet kan ikke betraktes som vellykket når de ble dyrket som EG-celler ikke kan oppnås embryoniske stamceller, i stand til å utføre de etterfølgende trinn med oogenesen eller spermatogenesen. Dette skyldes det faktum at EG-cellelinjer, selv om avledet fra opphavelige kjønnsceller, men i kulturen for å anskaffe egenskapene til embryonale pluripotente stamceller mister sin evne til å binde den germenativnye linje. Med andre ord, mister primære kjønnceller egenskaper av gameteforløpere ved dyrking og omdannes til ESC-lignende pluripotente celler.

Det er bemerket at når immundefekt EG-mus administreres, oppstår ikke teratomer. Det antas at tapet av humane EG-cellers evne til å initiere teratomer skyldes det faktum at disse linjene ikke ble opprettet direkte fra dyrkede primære bakterieceller, men ble oppnådd fra celler isolert fra embryoidlegemer. Derfor er det mulig at de er etterkommere av pluripotente, men allerede forpliktede celler.

Det skal bemerkes at det er grunnleggende forskjeller mellom EG-celler og primære bakterieceller. Sistnevnte gjør det ikke mulig å oppnå kimære musembryoer, noe som indikerer mangelen på evne til primære kimceller til å integrere i den interne cellemasse eller trophektoderm. Egenskapene til populasjonen av primære kjønnceller ligner mer på de engasjerte linjene av somatiske celler av senere embryoer, hvor innføring av som i blastocyst også ikke fører til dannelse av kimære embryoer.

Ombygging teknikker dyrking av de embryoidlegemer oppnådd med EG-aggregering av celler som er tillatt ved seleksjon på selektivt media for å motta en annen populasjon av pluripotente celler, som kalles "celler avledet fra embryoidlegemer (embryoid kroppens celler avledet - EBV-celler). Evnen til EBD-celler til å multiplisere i lang tid i kulturen tillot å skape stabile cellelinjer av engasjerte celler. Kloner av celler som uttrykker et bredt spekter av mRNA og proteinmarkører av spesialiserte celler ble oppnådd. Denne fremgangsmåten som et resultat viste at de primære humane kjønns pluripotente celler, og differensiere in vitro i forskjellige celletyper: neuroner, gliaceller, vaskulært endotel, hematopoietiske celler, muskel og endodermal celler.

Alternative kilder til embryonale stamceller

Alternativ kilde til humane ESC-linjer kan være hybridceller. Implantasjon i livmoren til pseudogravide kuer geterogenomnoy struktur erholdt ved sammenslåing via elektroporering fetusa humane somatiske celler med egg kyr, som tidligere hadde blitt fjernet fra pronukleus, gjør det mulig å motta den indre cellemasse av pre-implantation embryo kunstige utviklingsstadier. For dette formål, i det første trinn oppnås fra en blastocyst egg ku med et transplantert humane celler kjerne.

I den andre fasen blir embryoblasten ekstrahert fra blastocysten, og fra den - ESC i henhold til Thomson-metoden. Det er bemerkelsesverdig at de beste resultatene på isoleringen av ESC-linjer ved anvendelse av denne metoden ble oppnådd ved bruk av kjerner av follikulære celler eller primære bakterieceller som vedvarer i menneskekroppen i dvaletilstand. Dette skyldes det faktum at en ku egg transplanterte humane celler kjernen neukorochennye bør ha høy aktivitet og telomere telomeazy som unngår for tidlig aldring ESC-kloner avledet fra hybrid egg (Pinn igjen, 2001). Det er kjent at de viktigste intracellulære markør-EGF-proteiner er okt3, okt4, tcf, groucho, som tilhører de såkalte chromatin-dekselproteiner. Lyddempere gir spesielt kompakt pakning av heterochromatin, som forhindrer dannelsen av lukter av eukromatin. Kromatinpakningen mediert av disse proteinene korrelerer med totipotency av ESC-genomet. Hittil har det blitt fastslått at modne ovler av storfe og mennesker er den eneste typen spesialiserte celler som inneholder høye konsentrasjoner av lyddempende proteiner i cytoplasma. På denne bakgrunn ble det utviklet en metode for produksjon av hybrid-ESCer ved å overføre somatiske cellekjerner til ikke-nukleære ovler av kyr. Foreløpige in vitro-studier har vist at cytoplasma av eggceller av koer gjenoppretter totipotency av det humane somatiske cellekjernegenomet i 12-24 timer dyrking.

Av spesiell interesse er data om funksjonene ved preimplantasjonsutvikling av humane embryoer, hvilket indikerer en senere erstatning av totipotente celler av en populasjon av pluripotente celler enn hos mus. Studien av celletransformasjoner viste at celler i den indre cellemassen til den humane blastocyst, i tillegg til ESC, også genererer trofoblastceller, hvilket indikerer deres totale potens.

Det er kjent at i blastocyststadiet er det to forskjellig engasjert cellepopulasjoner. En av dem er det ytre laget av blastocystet, trofektoderm, avledet fra trofoblastceller og andre embryonale placenta komponenter. Den andre populasjonen av celler er gruppert i en tett masse, som kontakter den indre overflaten av trophektodermen. Cellepopulationen av den indre cellemassen er avledet fra alle vev og bakterier av embryoorganene. På scenen av sen blastocyst dannes en ekstra-embryonisk endoderm fra den interne cellemassen og en epiblast dannes (primær ektoderm). Samtidig beholder epiblastceller pluripotency, mens muligheten for å differensiere celler i den ekstra germinale endodermen er begrenset.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Oppnå menneskelige embryonale stamceller

Inntil nylig trodde man at trophoblast hentet fra hESCs umulige. Imidlertid diploide linje trophectoderm stamceller isolert fra blastocyst i et medium som inneholder, i stedet for LIF og FGF2 heparin, formerer seg og blir transformert inn i stamceller. Hvis du fjerner fra midt FGF2, de trophectoderm cellene stoppe avl, de begynner endoreduplication kromosomer og cellulære elementer trofektodermalnye gradvis forvandlet til en gigantisk trophoblast celler. Sannsynligvis, ikke LIF ikke stimulere proliferasjon av celler trophectoderm på grunn av det faktum at FGF2 utløser en mekanisme som transsignalizatsii FGF2, binding til cytoplasmiske reseptor (FGFR2), aktiverer MAP-kinase i cytoplasma - ERK1 og ERK2. Følgelig, når inkorporert inn i cellene i blastocysten av en signalveien (LIF - gpl30 - JAK-kinase - STAT3) indre cellemasse Celler blir transformert inn i pluripotent hESCs, under aktivering av den andre mekanismen for transmembran-signalisering (FGF2 - FGFR2 - MAP-kinaser ERK1 / ERK2) stamceller i blastocysten trophectoderm dannet. Valg av signalveien, i sin tur, avhenger av aktiviteten til genet Oct4. Dette genet som tilhører POU domene, lokalisert ved locus t 17 autosomer og er uttrykt i løpet av oogenesen, i knusing periode, så vel som i celler av den indre cellemasse av blastocysten, og i opphavelige kjønnsceller. Funksjonell rolle Oct4 gen er som koder for en transkripsjonsfaktor som er nødvendig for forekomst av pluripotente celler, deres differensiering og dedifferensiering.

Ekspresjonen av okt4-genet i ESC varierer avhengig av samspillet mellom denne transkripsjonsfaktoren og kofaktorene. En retningsregulering av okt4-ekspresjon i blastocystene viste at når aktiviteten minker, danner halvparten av cellene en trophektoderm, mens det med en økning i indusert ekspresjon av okt4 forekommer overveiende ESC.

I eksperimentet kan ESC ikke omdannes til en linje når man dyrker totipotente blastomerer i kjeppingsstadiet, så vel som på stadiet av gastrulasjon og senere stadier av embryonisk utvikling. Mus ESCs vanligvis tildele 3,5-4,5 dagers drektighet, som tilsvarer den sjette (enkelt lag av blastocysten) og syvende trinn (to-lags av blastocysten - et tidlig egg sylinder) normal embryogenesen. Åpenbart, bare i preimplantasjonsperioden inneholder embryonene av mus cellulære populasjoner som kan transformeres til ESC. Følgelig er isoleringen av ESC-linjer bare mulig ved visse stadier av embryogenese. Totitipotent, fra synspunktet om muligheten for å utvikle et livskraftig embryo med embryonale membraner og placenta, er zygoten og de blastomerer som oppstår under knusing. Tapet på den totale potensen av kimcellene begynner på sen morula-scenen, når ytterligere blastomere comminution avhenger av deres plassering. Tidlige Morula blaetomere beholder totipotency, fordi eksperimentelle manipulasjoner med endringer i deres plassering, for eksempel inversjon av deres plassering, forhindrer ikke utvikling av et fullt embryo.

Det ble funnet at effektiviteten av frigjøringen av ESC i linjen påvirkes av blastocystens tilstand ved eksplosjonstidspunktet. Bruken av blastocyster etter en syv dagers simulering av diapause i genitalkanalen hos mus, ovariektomisert på 3,5 dagers drektighet og behandlet med progesteron, bidrar til en mer vellykket separasjon av linjer av embryonale stamceller. Det antas at under slike forhold øker antall blastomerer som danner den indre cellemassen. Det er også mulig at cellesyklusen strekker seg og de fleste blastomerer går inn i G0-fasen.

Videre, etablering av stabile pluripotent hESC linjer er avhengig av genotypen embryoene: ganske lett skilles fra ESCs Murine blastocyster linje 129, er betydelig vanskeligere å få tak i dem ved hjelp av mus CS7BL / 6 og praktisk talt umulig å isolere ledningen fra hESCs blastocyster CBA / Ca-mus. Åpenbart har tidlige embryoer noen genetiske egenskaper som påvirker utviklingen av pluripotent ESC-linjen. Imidlertid, når de ble dyrket epiblast isolert, så vel som av den selektive valg differensierings hESCs cellelinje fra tidlige embryoer CBA / Ca-mus ble fortsatt tildelt.

En påvist standardteknikk for å skaffe ESK-linjer fra blastocystene er gitt i laboratoriehåndbøker om eksperimentet med tidlige embryoer. Eksperimentelle ESK-linjer kan også oppnås ved å dyrke en isolert epiblast (primær ektoderm) av 4,5-dagers musembryo med en ganske kompleks mikrokirurgisk teknikk og modifiserte dyrkningsbetingelser. Kompleksiteten i denne prosedyren er begrunnet, da frekvensen av dannelsen av ESC-linjer var mye høyere enn i arbeidet med blastocystens interne cellemasse.

For å isolere ESC-linjene, overføres hver klon til en mikrobrønn, et aggregat på 40-60 celler dyrkes, det blir igjen dispergert. Flere repetisjoner av denne fremgangsmåten gjør det mulig å oppnå udødelig ESK linje med maksimale formeringshastigheten normokariotipnyh cellene som var festet til plasten, som gjennom passasjene 50-100 beholde totipotency og høy telomeraseaktivitet. I prosessen med å støtte linjer ESC for den største fare er forurensnings eller serum bakterieendotoksiner - selv spor av endotoksin-konsentrasjonen i dyrkningsmediet forårsaket massedød av umodne kimceller. Med nøyaktig regulering av lineær vekst og rettidig dispersjon av ESCs i kultur er i stand til symmetriske fisjon, hvor begge dattercellene forblir pluripotente og i stand til å utføre et ubegrenset antall cellesykluser, å opprettholde en diploid karyotype, og den totale styrken.

Utvelgelse av en ren populasjon av humane ESC kan utføres etter transfeksjon i sitt genom av rekombinante DNA-molekyler som inneholder et gen som koder for syntesen av et grønt fluorescerende protein (GFP). GFP-uttrykk øker med vekst av ESC under forhold som støtter deres proliferasjon, mens ved inngrep av differensiering reduseres ekspresjonsnivået for dette genet, hvilket muliggjør valg av rene stabile pluripotente cellelinjer på et selektivt medium. Når dyrket med GFP-utvalg av ESC, øker frekvensen av kolonier i stor grad, da den kraftige antiproliferative effekten av differensierte celler elimineres under betingelsene for utvelgingsavlinger.

Oversettelse av humane embryonale stamceller i linje ved hjelp av fremgangsmåten for isolering av pre-implantasjonsembryoer (trinn 80-120-celler), som gjenstår etter in vitro-befruktning prosedyre. For dette blir de kunstig oppnådde "overflødige" embryoene mekanisk dispergert i Delbecco-Needle-miljøet. Etter at cellene er merket med selektive monoklonale antistoffer med en fluorescerende etikett, isoleres cellene i embryoblastet. Embryoblastet dispergeres i individuelle celler ved bruk av en blanding av disaspase-kollagenase. Dissosierte celler ble dyrket i et spesielt medium (80% Delbekko medium + 20% føtalt kalveserum i nærvær av 500 pg / ml IL-6, LIF og SCF) på monolag av embryonale fibroblaster anordningen 3 og første passasjer. I dette tilfellet støttes overlevelse og spredning av stamme og stamceller ved eksponering for IL-6, LIF og SCF. I dette miljøet, opphengs hESCs dyrke klonene osharennyh ufestede celler til å bli dissosiert ved forsiktig pipettering multiplum. Nye kloner vises i den suspenderte kulturen den 5.-7. Dag. Maksimal veksthastighet for ESC oppnås ved gjentatt dissosiasjon av kloner i trinnet på 10-15 celler. Deretter overføres hver klon til en mikrocell og dyrkes til et aggregat på 40-50 celler. Prosedyren gjentas mange ganger i passasjer, og øker volumet av kultur til en tetthet på 5-10 millioner celler per 6-centimeter kopp. Ved å bruke en slik Thomson passering ble det isolert 10 kloner udødelige humane ESCs som gjennom passasjene 100 bibeholder høy telomeraseaktivitet, evnen til å intens proliferasjon og fenotypiske egenskaper minimum total styrke med differensiering i et hvilket som helst av de 350 spesialiserte cellelinjer som er avledet ekto-, meso- - og endoderm. Differensiering av human ESC startet (ved endring av medium, tilsetning og fjerning av serum LIF) med cellebinding til underlaget, noe som indikerer utvikling av celleskjelettet og ekspresjon av adhesjonsreseptorer. Det er viktig at en normal karyotype med ubegrenset proliferasjon av humane ESCer ble bevart.

Den andre metoden for isolering av menneskelige ESC-linjer er basert på bruk av primære kjønnceller. Eksperimentelle studier har vist at Eu-cellelinjer kan fås fra genitalplakkene av 12,5-dagers gamle embryoer av mus. I disse tilfellene var imidlertid frekvensen av dannelsen av stamcellecellelinjene signifikant lavere enn i forsøk med tidligere embryoer. Samtidig er primære kjønnsceller fra gonader av musembryoer med 13,5-dagers gestasjonsalder generelt ikke i stand til å transformere til linjer.

De første stabile linjene av pluripotente humane EG-celler ble oppnådd fra primære gonocytter isolert fra genitalknoppene fra 5-9 uker gamle embryoer. Isolerte celler ble dyrket på et substrat av inaktivert mus embryonale fibroblaster i DMEM-medium med serum fra foster, og til dette ble det tilsatt merkaptoetanol, forskolin, så vel som rekombinante humane vekstfaktorer (FGF og LIF). Etter 7-12 dager oppstod multicellulære kolonier i kultur, i henhold til morfologiske egenskaper og molekylære markører som svarer til humane EG-celler. Etter aggregering dannet disse cellene embryoidlegemer, med videre utvikling av hvilke spesialiserte celler dukket opp, karakteristiske for derivatene av alle tre embryonale blader. Gjennom 10-20 passasjer beholdt EG-cellelinjer normal karyotype og tapte ikke pluripotency.

Det er også vist at den kombinerte effekten av LIF, membranbundne og oppløselige Stålfaktorer, så vel som TGF-b, modifiserer programmet for utvikling av primære bakterieceller. I stedet for å stoppe de mitotiske divisjonene og begynner å skille seg mot oogenese eller spermatogenese, fortsetter de primære kjønncellene å proliferere. Etter flere ekstra mitotiske sykluser blir de lik epiblastceller og, ved å miste egenskapene til forløpere av kimceller, blir de omdannet til pluripotente embryonale stamceller EG-celler.

Således ble i 1998 isolerte immortaliserte linjer av primære seksuelle celler først isolert fra det seksuelle rudimentet av humant føtale obduksjonsvev. Den embryogenese av humane primære kjønnsceller vises i plommesekken i den tredje uke av utvikling, og på 4-5th uker, disse cellene migrerer inn i området av seksuell tuberkel, hvor de danner en populasjon av primære dormantnye gonocytes. I inaktiv tilstand forblir primære bakterieceller i knoppen til fødselen. Primære bakterie-cellelinjer ble ekstrahert fra føtale genital tuberkel 5-9 uker gamle embryoer hentes ex tempore stoff som er behandlet med en blanding av kollagenase type IV-V, hyaluronidase og DNase for kvantitativ og kvalitativ å øke celleutbyttet. Primære bakterieceller i vevet i føtaletitalt tuberkel er omgitt av Sertoli stromal (mesenkymale) celler. Funksjonelle formål med Sertoli-celler er det produksjon av anti-apoptotiske faktorer (Fas-ligand), mitogener og immunundertrykkende midler som beskytter seksuelle stamceller fra immunangrep av kroppen. I tillegg spiller den stromale mikromiljøet i genital tuberkulet en viktig rolle i modningen av gameter. De isolerte primære bakteriecellene blir plantet i kulturen over føderstromal laget bestående av føtale fibroblaster av de tre første passasjer. Den mest effektive kombinasjonen av mitogener er et kompleks bestående av LIF, FGF og forskolin (et stimulerende middel for dannelsen av cAMP). Formerinasanalyse opphavelige kjønnsceller in vitro krever tilsetning av fosterserum, i nærvær av en primær reproduksjon gonocytes i kultur kloner ledsaget av dannelsen av kuleformede, ikke-adherente celler til substratet.

Det amerikanske National Institutes of Health på grunnlag av sammenfatte eksisterende informasjon om metoder for fordeling av menneskelige MGP linjer fra blastocyster ble gjort en foreløpig konklusjon at den vellykkede anvendelse av ESC er mest sannsynlig når kultur blastocysts med velformet indre cellemasse (Stamceller: vitenskapelige fremskritt og fremtidige forsknings retninger Nat. Inst, of Health USA). Fra dette synspunkt, til den beste kilden til ESCs lage linjer er menneskelige blastocyst femte dagen i utvikling, hvorav fordelingen av den indre cellemassen bør være nøye fjerne trophectoderm. Må dyrkes isolerte indre cellemasse bestående på dette stadium av 30-35 cellene på et substrat murine embryoniske fibroblaster, noe som er en avgjørende betingelse for dannelsen av koloniene i kulturen hESCs.

Analysen av fenotypiske egenskaper av embryonale stamceller

Av spesiell interesse er den interspesifikke sammenligningsanalysen av fenotypiske trekk ved ESC. Det ble funnet at humane ESC kolonier - a tette klynger av avflatede epitel-celler, mens mus embryoid kalv bestå av løst konglomerat av avrundede celler. I menneskelig ESC er indeksen for atom-plasma-forholdet lavere enn i ESK-musen. Embryonale stamceller av aper danner flere flate celle kolonier med ujevne kanter. I tidlige kloner av ESC-primater blir enkeltceller enkelt sett. Den spredende ESC av alle de undersøkte dyrearter uttrykker ikke MHC-molekyler i første og andre klasser. På samme tid, humane ESCs gi en positiv respons til antistoffer TERA 1-60 og GCTM-2, noe som indikerer tilstedeværelse på deres overflate keratin / chondroitin sulfat proteoglykaner, karakteristisk for embryonisk (teratomas) -kartsinomnyh stamceller. Uttrykk i hESCs alle slags dyr Oct4 genet tyder på at, til tross for de fenotypiske forskjeller i menneske- og mus ESCs, tilsynelatende aktiveres av samme sett av gener som er ansvarlige for å opprettholde pluripotency (Peru, 2001). I tillegg ESC linjer avledet fra embryoniske rotte, gris, kanin, primater, og kveg, har lignende morfologiske egenskaper, er et lignende sett av molekylær identifikasjon av markører og en nesten identisk molekylær mekanisme for gjennomføring av embryogenese program som gjør det mulig å ta en ny titt på xenotransplantasjon problemet .

I motsetning til normal embryogenese in vivo, blir in vitro proliferasjon av hESCs ikke ledsaget av dannelsen av germinale lag og fortsetter til blokk homeotiske Nohgenov bakgrunn, dvs. Uten organogenese. Siden segmentering gener ikke fungerer i kultur hESCs umulig å reprodusere slike perioder embryogenesen som fliken somite segmentering av kjernen, dannelsen av plommesekken, allantois provisorisk og andre organer og vev. Kultur-ESCene ble frosset ved begynnelsen av dannelsen av 350 restriksjonslinjer av spesialiserte celler. Således klon datter progenitorceller og sentralt lokaliserte PGC-er bare modell foster under utvikling der forskjellige vev partier er dannet i et trinn er forskjellig fra spesialiserte celler som stammer imidlertid fra vanlige forløpere. Selv om minimumsnivå av reseptorer på overflaten av hESCs, de beholder evnen til å utføre primitive morfogenetiske fremgangsmåter som simulerer den største delen av tidlig embryo struktur: slam hESCs i kultur og aggregater danner en struktur som ligner blastocyst eller enda senere embryoer (egg sylindere). Slike suspensjonsaggregater ble passende kalt enkle og komplekse embryoidlegemer.

Når det blandes differensiere i forskjellige celler av embryoide kroppen samtidig som uttrykkes av tidlige gener som ektoderm (oct3, FGF-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogent mesoderm (PKH-2,5), neural rør (msx3 ) og hematopoiesis (elkf). Ved anvendelse av forskjellige kombinasjoner av cytokiner og vekstfaktorer for målretting dannelsen av bakterie lagsceller in vitro i en rekke tilfeller var det mulig å oppnå embryoidlegemer, som ble fortrinnsvis uttrykte gener ektoderm eller mesoderm, noe som åpner veien for modellering av gastrulation og tidlig organogenese fase.

Klonal vekst av hESCs er bevis for asymmetrisk celledeling hvor bare en av ESC i sentrum klone beholder ikke-begrensende reproduksjonsevnen, mens den andre datteren cellen gir opphav til generasjon av stamceller, er differensiering allerede kommer inn. Derfor er graden av multiplikasjon av klonen ved periferien av embryoidlegemet høyere enn i midten. De voksende klonens marginalceller undergår spontan uordnet differensiering, migrere eller dø av mekanismer av apoptose. Disse hendelsene bestemme skjebnen til klon hvis formeringshastigheten overskrider den migreringshastigheten og apoptotisk celledød, klon størrelser fortsetter å øke, skjer stabilisering med lik apoptose og hastigheten for dannelsen av ny celle hastighet, regresjon - det motsatte forholdet mellom disse prosessene. Progenitorceller deler symmetrisk, det vil si, begge datterceller blir videre differensiert til modne spesialiserte cellelinjer. Forholdet mellom ESC / stamceller varierer, men alltid er mengden av ESC bare en brøkdel av en prosent av stamcellenpopulasjonen. Derfor kan bare forsiktig pipetting og rettidig oppdeling av kloner øke antall ESC i kultur. For å oppnå maksimalt utbytte av ESC var den mest effektive disaggregasjonen av klonene i trinnet på 10-12 celler. Retningen og graden av differensiering av celler i embryoidlegemet avhenger av deres plassering. Utvendig embryoid kroppens celler ikke uttrykker genet og Oct4 gjennomgå differensiering i primær endoderm celler som senere dannet epiteloide celler og parietale extraembryonic visceral endoderm. De indre cellene til embryoidlegemet uttrykker okt4-genet og beholder pluripoten i 48 timer kultur. Men da den morfologiske omstilling skjer i epiteliale monolagkultur begynner og ekspresjon av gener som styrer utviklingen av primær ektoderm. Deretter begynner prosessen med totalt uordnet cytodifferentiering med utseendet av forskjellige celletyper som er derivatene av alle tre germinalplater. I prosessen med spontan differensiering av embryoide kroppens celler oppstår først aggregater endoderm markører i form av fragmenter (cyster) plommesekken. Videre vises angioblaster og endotelceller av voksende kapillærer i disse strukturene. I sluttfasen av spontan differensiering av de indre cellene i embryoid legeme utvikler forskjellige terminalt differensierte celler, inkludert neuroner, gliale elementer, kardiomyocytter, makrofager og erytrocytter. I visse tilnærmelse (med tanke på den romlige inversjon av ark som danner det embryoniske vev) via embryoidlegemer in vitro kan utforske morfogenetiske prosesser og analysere de molekylære mekanismer av embryonale cytodifferentiation innledende periode, og etablere rollen til spesifikke gener i gjennomføringen av disse prosesser.

Dermed er det i klonene celler der ulike genetiske utviklingsprogrammer oppdages - ESCer, tidlige progenitorer og differensierende forfedrepopulasjoner. Dyrkningen av ESC ved hjelp av metoder for en hengende dråpe eller massekultur uten et materlager og uten tilsetning av LIF i mediet fører uunngåelig til dannelsen av embryoidlegemer. Morfologien til cellene i de ytre og indre lagene av de embryoide legemene er forskjellig. Ytre laget består av store prosessceller. Overflaten, mot miljøet, er dekket av mange mikrovilli. Det ytre lag av celler er skilt fra den indre basale membranen som ligner Reichert-membranen, mens cellene i det indre laget av de embryoide legemene er et sylindrisk epitel. Morfologisk er det indre lag, selv om det inneholder mange delende celler, mer minner om utifferentierte ESC kolonier.

Egenskaper av menneskelige embryonale stamceller

Fravær av parenchymale-mesenchymale interaksjoner bakgrunnssignalet blokkerer gener homeosis forårsaker uordnet vekst av PGC i kultur, ettersom denne kategorien er brutt og dannelsen infrastruktur provisorisk organer. Uorganisert vekst og uordentlig spontan differensiering av hESCs i kultur grunn av manglende mesenchymale merking stromal rammeverk av fremtidig organer: in vitro er det mulig dannelse av millioner av hepatocytter, men man kan ikke få noen segmenter av leveren, herunder slike strukturelle og funksjonelle elementer, slik som bihulene, løpet av Disse og Kupffer celler.

Det antas at den pluripotency av ESCs realisert utelukkende i embryogenesen for å danne vev og organer for embryoet, mens navlestrengen og morkaken er avledet trofoblast. Innesluttet i et skall trofektodermalnuyu ESK gående generere cellekloner provisorisk realisere utviklingsprogram ved kombinatoriske mRNA bulk Nohteyaov topografisk matriks som forhåndsbestemme den romlige arrangementet, form, dimensjoner, antall midlertidige og endelige organceller og parenchyma montering i strukturell og funksjonell enhet. Samtidig ESC er den eneste celletype, hvor den molekylære mekanismen for realisering av deres potensialer fullstendig dissosiert fra genetisk program for utvikling og ESCOs seg berøvet muligheten for interaksjon med andre celler på grunn av blokkering av både reseptor oppfatninger og transsignalizatsii systemer. Imidlertid er tilstrekkelig aktivisering ESCs resulterer i gradvis utrulling embryogenese program avslutning fødsel helt dannet og klar til å extrauterine livet av en organisme som består av milliarder av celler. I denne korte tid, men utenkelig gjeld i den cellulære plass banen uunngåelig forekomsten av feil i de molekylære mekanismer som gir vitale funksjoner i celler, og i programvaren som styrer deres proliferasjon, differensiering og spesialisering. Derfor, i moderne pharmacogenomics vurderes separat sykdom molekylære enheter, og sykdom celle programmering. Og virkningen av de fleste nye medikamenter som tar sikte på å rette opp navn av programmet for differensiering, proliferasjon og organogenese, samt regenerering av organer og vev. I den voksne organismen via ESCs blir det mulig å kontrollere oppførselen til stammen / forløperceller transplantert inn i hjernen, lever, milt, benmarg og andre organer i menneske for å reparere en beskadiget mottaker parenkymale organer på grunn av differensiering og fordypnings donor mesenchymale celler bevart matrise. I hovedsak er totipotency program lanserer en annen eggcelle genomnivå, zygotes og blastomeres, men disse cellene er ennå ikke mulig å klone og passert i de mengder som er nødvendige for behovene til experiental og praktisk medisin. Derfor er det ESC en unik kilde av genetisk informasjon som inneholder den tre-dimensjonale lineære restriksjonskart av embryoet og koder for spesialiserte cellelinjer under gastrulation.

Praktisk talt ubegrensede muligheter for regenerativ ESC på grunn av det faktum at deres genom, i kontrast til den genetiske apparat av differensierte somatiske celler, opprettholder pluripotency. En manifestasjon av sovende tilstand forankret i ESCs genetiske informasjon er den såkalte minimale fenotype - på overflaten av ESC uttrykke et begrenset antall reseptorer, og derfor utplassert svært få programmer for å samhandle transsignalizatsii atom apparat av cellen med dens mikromiljøet. På bakgrunn av dvale gener som er ansvarlige for begrensning av spesialiserte cellelinjer og differensiering av celler, aktivert bare omtrent 30 av de 500 gener hvis produkter gir kommunikasjon celler med den omgivende mikromiljøet. Ved hjelp av fremgangsmåten i serie analyse av genekspresjon vist at generaliteten av de viktigste funksjonelle genom bokser som regulerer energi og metabolisme i somatiske celler og ESCs i siste bestemmes ekstremt lav mengde av mRNA av reseptorer, G-proteiner, andre budbringere, transkriptaser, kofaktorer uttrykk og undertrykkelse , det vil si hele systemet for transmembranoverføring av regulatorisk signal inn i cellen. Dette skyldes mangelen eller svært lavt uttrykk for transsanaliseringsgener. Under differensiering induseres i genomet av ESC 18 operasjonen blir stoppet synkront fungerer gener for bakgrunns aktivering transsignalizatsii 61 gen som styrer syntesen av celleadhesjonsreseptorer, ekstracellulære matriks-komponenter, transkriptaser begrensning messendzhernyh elementene og signaloverføringssystem for en kjernefysisk enhet med plasmacellemembranreseptorer. Blokkeres samtidig ekspresjon av gener som er ansvarlige for syntesen av proteiner lyddempere, samt genekspresjon koingibitorov gi totipotency genom hESCs.

Genetiske markører ble funnet for cellene i alle tre embryonale brosjyrer. Identifisering ectodermal celle laget bæres på ekspresjonen av gener nodal, oct3 og FGF-5, mesodermal celler - genet brachyury, zeta-globin, endoderm - ved gata 4-genekspresjon. I normal embryogenese, under gastrulation observert en aktiv migrering av umodne populasjoner av stamceller og forløperceller, lokalt utpeke områder av ansiktsbenene i skallen, noen deler av hjernen, perifere nervesystem, hjerteledning system og thymus vev som er dannet fra klonene forskyves celler. Cellemerking tidlige gener kimlag gjør det lettere for topografisk analyse av migrering av forløperceller i utvikling av embryo. Det er spesielt funnet at cellene i aggregater embryocarcinoma P19 ekspresjon av det første genet mesoderm brachyury starter under reduksjonen av genekspresjon av vevsplasminogenaktivator, a-fetoprotein, keratin 8, og keratin 19, som er markører for tidlig mesoderm trekkende populasjoner. Følgelig dannelsen av vev av mesodermal opprinnelse begynner først etter at prosessen med migrasjon og avsetningspunkt mesodermal progenitorceller.

Med ekstremt begrensede fenotypiske egenskaper og fraværet av det meste av blokkene transsignalizatsii ESC likevel uttrykker noen antistoffer som kan brukes til å identifisere dem. Det er bemerkelsesverdig at antigener-markører av ESCer hos mennesker og primater ble funnet å være vanlige. Oftest benyttes for merking av hESCs merkede antistoffer til antigener membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (entydige lipid-antigener som representerer kompleks glykolipid GL7 med sialinsyre), så vel som høy polymer glykoproteiner TRA-1-81, TRA-1-60. Videre hESCs uttrykker spesifikt embryonisk antigen SSEA-1 og endogen alkalisk fosfatase, så vel som en spesifikk transkripsjonsfaktor Oct4. Sistnevnte er nødvendig for å opprettholde hESCs spredningsmekanismer - spesifikk transkripsjonsfaktor Oct4 gen aktiverer ekspresjon av fibroblast vekstfaktor 4 gen-ekspresjon og stabiliserer bokset ansvarlig for ikke-begrensende DNA reduplication i umodne celler. De viktigste intracellulære markørproteinene er Oct3, Oct4, Tcf og Groucho, som er relatert til kromatin-lyddempereproteiner.

Nesten umiddelbart etter at de langsiktige dyrkede ESCS forsøk er mislykket, og organismen ble først fremstilt ved dyrkning av stamceller isolert fra mus blastocyster, og primær bakterie-cellekultur, begynte scene ESC pluripotency kapasitet studier når det administreres i de tidlige stadier av embryoutvikling. Det ble vist at ved morula og blastocyst PGC-er i stand til å danne kimære embryoer der giver PGC-etterkommere detektert i alle somatiske vev og til og med i kjønnsceller. Således, i Developmental Biology ved hjelp av ESC skript "bro" mellom de eksperimentelle studier in vivo og in vitro, noe som i betydelig grad økt mulighet for å studere prosesser favoritter primære vev og organer, deres differensiering og embryonale organogenese.

Det er velkjent at in vivo i løpet av embryogenesen ESK integrert i cellemasse av tidlig embryo, og deres derivater er funnet i alle organer og vev. ESCs koloniserer i det kimære embryoet en linje av kjønnceller, hvorav etterkommere danner fullfylte egger og spermatozoer. Embryonale stamceller er klonogen - enkelt PGC kan skape genetisk identisk med en koloni av celler med molekylære markører, som inkluderer Oct4 genekspresjon og alkalisk fosfatase, høy telomeraseaktivitet, så vel som ekspresjon av spesifikke embryoniske antigener.

For å studere mekanismene embryogenese ved hjelp av teknikken med hESCs chimerization morula ved å skape en biologisk struktur, som ligger utenfor lags tetraploide blastomeres mottaker og donor PGC-er blir administrert inn. Således er trofoblast dannet av etterkommere tetraploid blastomeres mottaker som gjør implantasjon og placentation, og donor-PGC-er virker som den indre cellemasse, som er dannet av en levedyktig bakterie linje av de primære kroppen og forløperceller gameter. Studien ESC verdi ligger ikke bare i at når manipulering in vitro med deres genom bibeholdt pluripotency, men også i det faktum at mens bevare evnen til å delta i dannelsen av hESCs opprinnelige kjønnscellene til det kimære embryo. Det er vist at bare ett avkom av genetisk modifiserte PGC-kolonisere alle primære og bakterier som danner stoff chimerisk embryo oppnådd ved aggregering eller ko-kultur av cellene med 8-celle embryo. Når transplantert inn i mus morula ESCs transfektert med grønt fluorescerende protein-genet, ble det fluorescerende etterkommere av cellene som finnes i alle undersøkte vev av utvikling av embryo (Shimada, 1999). Transplantasjon av ESC i morula kan skape levedyktige mus, legeme som består utelukkende av etterkommere donert ESC, som åpner muligheter for en rekke terapeutiske klonings alternativer. Nå en slik metodisk tilnærming har blitt brukt til å studere problemene med utviklingsbiologi, spesielt, kan det analysere de genetiske mekanismer for inaktivering av X-kromosomet eller epigenetisk ustabilitet av hESCs. Transplantasjon av ESC til tidlig embryo brukes også i bioteknologi i landbruk, samt i genterapiforsøk.

Transplantasjoner av genetisk modifiserte ESCs brukes til å teste målceller av mutantgener. In vitro dyrkede ESC er brukt i bioteknologi for å skape knockout-mus. For dette formål ved hjelp av homolog rekombinasjon for å bli fjernet fra undersøkelsen ESCs gen (knockout) og selektive media utskiller celler som mangler dette gen. Deretter injiseres knockout ESCs i blastocysten eller aggregeres med blastomerer av morula. De således oppnådde kimære tidlige embryoer blir transplantert inn i en mottaker kvinnelig og nyfødte mus valgt blant personer med gameter, nullizigotnymi av dette gen. Ifølge denne teknologien opprettes mange linjer med knockout-mus, som er mye brukt i eksperimentell biologi og eksperimentell medisin. På disse biologiske modeller studert verdien av visse gener i embryoutvikling, så vel som deres rolle i mekanismen for andre sykdommer og patologiske tilstander hos mennesker. I tillegg brukes linjene med knockout dyr i den prekliniske testfasen av nye metoder for genterapi. For eksempel, ved bruk av genet transfeksjon i ESK normal allel av mutantgenet administrere effektivt rettet mutasjon, slår det hemopoetiske system. Innføring av fremmede gener i ESC tillater opprettelse av linjer homozygote transgene laboratoriedyr i en akselerert hastighet. Imidlertid bør det bemerkes at den teknikk som er rettet rekombinasjon gendelesjon virket på en pålitelig måte ut som ennå bare relativt ESC mus. Ved hjelp av murine ESCs dobbel knockout installert funksjonell rolle område gruppe gener på kromosom 7 (kopi genomisk region 19 minutter humant kromosom), og den proksimale delen av det 11. Kromosom (kopier humant kromosom 5d) - delesjon av disse genene i ESK-mus fikk lov til å evaluere funksjonen av deres analoger hos mennesker.

De kapasitet funksjon studier av humane embryoniske gener, transfeksjon i genet som forsøksdyr tillatt hESCs særlig krypto klargjøre rollen av genet i fanen og danner kardio mesoderm, pax-6-gen - i embryogenese øye. Utgjør den første ekspresjon av gener i umodne prolifererende kort ESC teratokarsinom og blastocyst mus bekreftet overveldende undertrykkelse i ESK transsignalizatsii gener. Kombinasjonen av mutante ESCs 60-80 og 20-30 celler fra normale pre-implantation museembryoer fører til utvikling av kimære embryoer som bokmerker legemer består av donor- og resipientceller, som tillater oss å fastslå rollen til ukjente gener i gastrulation og organogenese. Funksjonell kart av genet utvikler mus embryo forstørrede detaljer av rollen til genet sf-1 tab i binyrene og genital primordia, wt-1-gen - i nyrene fanen myod genetikk - i tappen på skjelettmuskulatur genfamilien gata-1-4 - i restriksjons modning Rødimenter av erytro- og lymfopoisis.

Rettet ut av maternale og fars alleler av genene i hESCs hjelp av vektor rekombinasemålsetene tjente til å klargjøre arbeidsfunksjonene for forskjellige gener som i løpet av tidlig embryogenese og teknologi for målsøking av humane ukjente gener i mus ESCs bidra til oppdagelsen av nye mutante gener som er ansvarlige for utviklingen av alvorlige arvelige sykdommer. Ved hjelp av knockout-metoden definert obligat betydningen av noen gener for legging av embryonale vev: gata-4 - for infarkt, gata-1 - erythroid til hemopoetiske vev, myod - skjelettmuskel, brachyury - for mesoderm begrensning transkriptaser hnf3 og hnf4 - for lever stamceller, rag-2 - bokmerker for kloner av T og B-lymfocytter (Repins, 2001). Dobbel sletting av gener i hESCs har åpnet adgang til studiet av den funksjonelle rolle av gener av germinal lag, segmentering og homeosis og ESC transplantasjon gitt mulighet til å få levedyktige interspesifikk hybrid embryoer. Med forbedrede metoder for transplantasjon av donor PGC-er i en enkelt 8-celle embryo påvist at chimerization på cellenivå av mange organer i mottageren embryo. Legg merke til at celle spirer finnes i menneskelig vev resipientmus organer etter administrering av humane hematopoietiske stamceller til en blastocyst. Det ble funnet at i mus embryo under dannelsen av blodlegemene sirkulerende pluripotent hESCs. Det er mulig at deres biologiske funksjon er i den embryonale organisasjonen av det fremtidige immunsystemet. Med ESC in vitro gjengitt adekvate modeller av human genetisk sykdom: dobbel knockout-modeller dystrofingenet i mus av Duchenne muskeldystrofi, avslutning atm gen (styresignal syntese kinase kromatin) - ataxia-teleangektaziyu. I dette tilfellet, en dødelig arvelig sykdom hos barn på grunn av defekter i DNA-reparasjon utvikler degenerering av Purkinje-celler i lillehjernen, noe som er ledsaget av en involusjon av thymus på grunn av død av de prolifererende celler. Clinic, patofysiologi og patomorfologija ataksi-teleangek- tazii reprodusert via innføring i ESC unormal genetisk informasjon fra musekimærer tilsvarer dem hos mennesker. Videre ataksi-teleangektazii ved hjelp PGC og knockout-mus utviklet eksperimentell modell, noen arvelige homozygote humane sykdommer forbundet med forstyrrelser av karbohydrat og lipid metabolisme, katabolisme av aminosyrer, fjernelse av kobber og bilirubin, som i betydelig grad øker muligheten for eksperimentell medisin for preklinisk testing av nye metoder for behandling av disse sykdommene person.

[12], [13], [14], [15]

Bruken av stamcelle cytohybrid

Hybridceller oppnådd ved å fusjonere somatiske celler fra hESCs, er tilstrekkelig og lovende modell for undersøkelse av stamcelle pluripotency og omprogrammering av differensierte cellekromosomer. Tsitogibridy erholdt ved sammenslåing av ESC med differensierte celler fra voksne dyr, gir en mulighet for å studere sammenhengen mellom genomene til forskjellige "aldre": utvikler en enestående situasjon hvor de homologe kromosomer avledet fra celler fra forskjellige trinn av differensiering, og varierende grad av modenhet, er i den samme kjerne, hvor de lett transdeystvuyuschimi dele regulatoriske signaler. ■ Det er vanskelig å forutse hvordan vil reagere tsisregulyatornye epigenetisk system av homologe kromosomer eksisterende under yn dividual utvikling, i respons til virkningen transdeystvuyuschih signalene fra embryoniske beslektede genomer. Videre, i hybridcellene finner sted segregering av foreldre kromosom som gjør det mulig å studere vekselvirkningen mellom genomene på separate kromosomnivå, dvs. Potensielt identifisere den delen av spesifikke kromosomer i vedlikehold av pluripotency, eller Tvert imot, en utgang i differensiering.

Som den første forsøksmodellen for å studere interaksjonen av genomene til forskjellige "historie for utvikling" som brukes tsitogibridy oppnådd ved å slå sammen teratokartsinomnyh pluripotente og differensierte somatiske celler. I noen tilfeller beholdt slike hybridceller pluripotente egenskaper på et tilstrekkelig høyt nivå. I særdeleshet induserte teratokarcinom-somatiske hybridceller in vivo utviklingen av ekte teratomer inneholdende derivatene av alle tre germinalplater, og in vitro-embryoidkropper ble dannet i suspensjonskulturer. Selv i denne type av inter tsitogibridov noterte nærværet av føtale antigener i tilfeller hvor somatisk partner i fusjon med teratokarsinomceller ble lymfocytter eller thymocytter. Det er bemerkelsesverdig at cyto-hybrider opprettet ved fusjon av teratokarcinomceller med fibroblaster korresponderte med fibroblaster i henhold til fenotypen.

Det viktigste er at et etablert faktum at i-teratokartsinomno somatiske hybridceller viste tegn genomet omprogrammering av differensierte celler, karakterisert ved en reaktivering av individuelle gener eller inaktive X-kromosom somatisk partner. Resultatene av studier på cytohybridider som teratokarcinom-somatiske celler indikerer således at hybridceller ofte beholder pluripotency og det er tegn på omprogrammering av den somatiske partnerens genom.

I forsøkene for å oppnå embryoniske intraspecific hybridceller ved å fusjonere splenocytter med muse ESCs voksent dyr som ble undersøkt karakteristika slik tsitogibridov, segregering analyse av foreldre kromosomer og vurderes pluripotency hybrid genom. For de interspesifikk hybridceller som produseres av fusjons teratokarsinomceller med somatiske celler, generelt karakterisert ved lav segregasjon av kromosomer med tetraploid eller nær-tetraploid karyotype. En lignende kromosomal sammensetning ble observert i cytohybriden ved fusjon av primære kjønnceller med lymfocytter. Samtidig er de interspesifikk hybridcellene oppnådd som et resultat av fusjon av muse lymfocyttcellelinje teratokartsinomnyh mink, var intens segregasjon av kromosomer somatisk partner.

Et kvalitativt ny fase i studiet av segregering av foreldre kromosomer i interspesifikk hybrider kom etter at utviklingen av mikroanalysemetode ved bruk av polymerase kjedereaksjon, hvorved hver mus kromosom funnet noen hundre markører, slik at en pålitelig måte diskriminere mellom hvilket som helst par av homologe kromosomer i hybridcellene.

Ved å slå sammen ESK (ved hjelp av HM-1-celler som mangler gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivitet, 2n = 40, XY, isolert fra blastocyster musestamme 129 / 01a) med splenocytter fra mus congenic linjen DD / c mislyktes i å motta et sett av hybridkloner morfologisk måtte likhet med hESCs. Alle kloner ble isolert på selektivt medium, hvor veksten er mulig bare med den aktive celle gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforetisk analyse viste nærvær av alle kloner allel variant gipoksantinfosforiboziltransferazy karakteristisk mus DD / c. Ved hjelp av cytogenetisk analyse, ble det funnet at fire hadde tre hybridkloner okolodiploidny sett av kromosomer. En nær-tetraploid klon inneholdt to populasjoner av hybridceller, hvorav den ene var tetraploid, og den andre, mindre - diploid.

Analyse av mikro tillater å diskriminere et hvilket som helst par av homologe kromosomer mus 129 / 01a og DD / c, i de hybride kloner med okolodiploidnym sett viste at kloner oppsto i to distinkte preferensiell fjerning autosomer somatisk partner. De fleste autosomal kloner HESS2 og HESS3 hadde markører linje 129 / 01a, dvs. Pluripotent partner. Unntaket var kromosom 1 og I: kloner HESS2 og HESS3, sammen med markører av HM-1 celler, et lite antall markører liggende somatisk partner. Disse resultater kan skyldes ufullstendig segregasjon av kromosomer 1 og og somatisk partner og er i overensstemmelse med data som cytogenetisk trisomy av kromosomer som forekommer i 30-40% HESS2 og HESS3 cellekloner. HESS4 klon var signifikant forskjellig i kromosomal sammensetning: mange autosomer Denne klonen stammer fra genomet ESK (kromosomer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 og 17), men kromosomer 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 og 19 ble representert av begge foreldres homologer. De kvantitative forhold mellom mikrosatellittmarkører disse homologe kromosomer tilsvarte ca. 1: 1. Dette tillot forfatterne til å antyde at en homolog er avledet fra genomet av ESC og den andre - fra differensierte celler. I noen subkloner av klon HESS4 kun observert tegn nærvær av kromosomer 18 og 19 somatiske partner. Resultatene indikerer at cellene klone HESS4, i tillegg til segregering av kromosomer somatisk partner, det var eliminering av en eller begge homologer av ovennevnte kromosom pluripotente genom, det vil si, det var en tosidig segregering av kromosomer fra begge foreldre - fenomenet er ganske uvanlig, fordi tsitogibridov karakteristisk segregering av kromosomene bare en av foreldrene.

I tillegg, etter den 20. Passasje, alle kloner av hybride celler som inneholder bare X-kromosomet markører av den somatiske partner, det vil si i klonene ble erstattet X-kromosom ESC på X-kromosomet av den somatiske partner. Dette bekreftes ved in situ hybridiseringsdata ved bruk av en FITC-merket probe spesifikk for musekromosomet: et positivt signal ble detektert bare på ett kromosom. Det skal bemerkes at i tidligere kultiveringsstadier (opp til 15. Gang), i henhold til cytogenetiske data, var det i mange celler to X-kromosomer. Følgelig gjør bruk av selektive medier det mulig å manipulere den kromosomale sammensetningen av hybridceller og selektivt målrette kloner som bærer enkeltkromosomer av den somatiske partner mot bakgrunnen av ESC-genomet.

Som en unik egenskap av genomet tsitogibridov er lokalisering av parentale genomer i en enkelt kjerne, selvfølgelig, reiser spørsmålet om å opprettholde egenskapene til pluripotente embryonale genom ESC-somatiske cellehybrider i forholdene i nær kontakt med genomet av differensierte celler. Morfologisk likte cytohybriden av ESC og somatiske celler foreldrenes linje i ESC. Kvalifikasjon pluripotency viste at alle kloner okolodiploidnym kromosomsett var i stand til å danne i suspensjonskulturer av embryoide legemer hvor derivater av de tre kimlag til stede.

De fleste hybridceller inneholdt ECMA-7 antigenet, en markørkarakteristikk for tidlige musembryoer, og hadde også en høy aktivitet av alkalisk fosfatase. De mest overbevisende dataene på hybridplasternes høye pluripotente egenskaper ble oppnådd i eksperimenter for å oppnå en serie injiserbare kimærer som involverte hybridceller av klonen HESS2. En analyse av biokjemiske markører viste at etterkommere av donorhybridceller ble funnet i de fleste kimærvev. Følgelig beholdes hybridceller oppnådd ved fusjon av ESC og somatiske differensierte celler pluripoten på et høyt nivå, inkludert evnen til å danne kimærer når de settes inn i blastocystkaviteten.

Kloner HESS2 og HESS4 var signifikant forskjellig i sammensetningen av de overordnede kromosomer, men de hadde lignende pluripotente egenskaper. Man kan tro at pluripotency i hybridgenomet manifesterer seg som en dominerende funksjon, men det er mulig at ikke alle kromosomer i det embryonale genomet er involvert i prosessen med å opprettholde pluripotens. Hvis denne antakelsen er riktig, kan man forvente at eliminering av noen kromosomer fra pluripotentpartneren fra hybridomgenomet ikke vil bli ledsaget av en endring i deres pluripotente status. I dette tilfellet ville en analyse av segregeringen av foreldrekromosomer i embryonale hybridceller tillate en nær tilnærming til identifisering av kromosomer som er ansvarlig for å kontrollere pluripotency av embryonale celler.

Serov O. Et al (2001) funnet blant de 50 avkom oppnådd fra krysninger av kimærene med normale mus, slike som ville ha genotypen mus 129 / 01a, og som bærer X-kromosomet DD mus. Forfatterne ser årsaken til dette ved reduksjon av pluripotency i hybridceller under påvirkning av det somatiske genom. En alternativ forklaring kan være den negative effekten av trisomy for noen ubalanse mellom autosomer og kjønnskromosomer (XXY observert i celler opp til den 15. Passasje) i hybridcellene ved passering av meiose. Det er kjent at celler av XXY ikke kan passere gjennom meioser og danne gameter. Trisomi kan også forårsake en reduksjon i proliferativ aktivitet av hybridceller, som et resultat av hvilken den selektive fordel i utviklingen av kimærer kan tilhøre cellene i mottakerembryoen. Det følger at for å tilfredsstillende evaluere hybridcellens pluripotente potensial, er det nødvendig å oppnå hybridkloner med et normalt diploid sett med kromosomer.

I forsøk Serova O. Et al (2001) først demonstrerte muligheten for reprogrammering av X-kromosomet i genomet til en somatisk cellehybrid celle. Denne konklusjon følger av forfatterne analysere ekspresjonen av kimærer HPRT-gen (X-kromosom markør): tilstedeværelse av alleliske varianter hprt DD / c-mus ble detektert i alle vev analysert kimære. Det bør understrekes at etter innføringen av hybridceller i blastocysten hulrom tsitogibridy faller inn i ikke-selektive betingelser og bevaring av X-kromosomet i genomet av hybridcellene betyr at det er blitt en obligat komponent i sitt genom, og diskriminerer ikke den fra Y-kromosomet pluripotent partner.

Oppsummerer resultatene av analysen av samspillet mellom somatiske og pluripotente genomene i hybridfostercellene, konkluderer forfatterne at i noen cytohybrider manifesterer pluripotency seg som en dominerende egenskap. Et hybridgenom er i stand til å omprogrammere individuelle kromosomer av differensierte celler, som imidlertid ikke utelukker muligheten for det somatiske genomes revers effekt på pluripotency av det embryonale genom. Ved dyrking av hybridceller skjer induksjon av differensiering mye oftere enn i den opprinnelige stammen til ESC NM-1. En lignende effekt observeres i dannelsen av primære kolonier: mange primære kolonier av embryonale hybride celler differensiert i de tidlige stadier av utdannelse med store tap av kloner under avl og reproduksjon.

Således opprettholder cytohybrider opprettet ved sammensmeltning av ESC med somatiske celler, til tross for nær kontakt med genomet av differensierte celler, pluripotency som en unik egenskap av det embryonale genom. Videre er det i slike hybridceller mulig å omprogrammere de individuelle kromosomer som stammer fra diffuserte celler. Det er fortsatt uklart hvor fullt de pluripotente egenskapene til det embryonale genomet i hybridceller vedvarer, spesielt deres evne til å delta i dannelsen av den embryonale bane i kimærene. For dette er det nødvendig å oppnå embryonale hybridceller med en normal karyotype. I alle fall kan de pluripotente embryonale hybridcellene være en reell modell for genetisk identifikasjon av kromosomer som er involvert i opprettholdelse av pluripotency eller hennes kontroll som bilateral segregering av kromosomene foreldre potensielt gir en slik mulighet.

Ikke mindre attraktivt er studien av fenomenet, som O. Serov og medforfattere (2001) definerer som "kromosomalt minne". I hybrid genomet homologe kromosomer er to alternative konfigurasjoner: homologer somatisk partner gang gjennomgått differensiering, mens homologer pluripotente partner er denne prosessen bare begynnelsen. Derfor opprettholde høye pluripotente egenskaper av hybridceller indikerer at "pluripotente" konfigurasjon homologer ESC nokså stabile i hybrid genomer, til tross for virkningen av transdeystvuyuschih faktorer som kommer fra det somatiske partner. De ovenfor beskrevne trekk av reprogrammeringsdata differensiert homologe genom-kromosomer under utvikling av kimærer utelukker ikke muligheten for at de første stadiene av dannelse in vitro og dyrking tsitogibridov de beholder sin status ervervet under differensiering in vivo. Ifølge nyere data, ved overføring av embryonale hybridcellene i ikke-selektivt medium i hvilket det er en intensiv bare eliminering kromosomer somatisk partner, dvs. Genomet av hybridceller diskriminerer lett homologer etter in vitro kultur i 10-15 passasjer. Således embryonale hybridcellene representerer et lovende eksperimentell modell for studiet ikke bare av de grunnleggende egenskaper av embryoniske genom som pluripotency, men også dets alternativer - embryonale differensiering.

Terapeutisk effekt av embryonal stamceltransplantasjon

Før vi analyserer den terapeutiske effekten av ESC-transplantasjon og deres derivater, oppsummerer vi det ovennevnte materialet. Funksjoner ESC i form av full gjennomføring av embryogenesen in vitro er utilstrekkelig på grunn av defekter i dette tilfelle på grunn av fraværet av stamceller som oppstår i kroppen selvstendig og uavhengig av hverandre fra hESCs. Den genetiske styrken til ESC er mindre enn det genetiske potensialet for zygoten, derfor er det ikke direkte brukt til kloning av embryoer. ESCs unike biologiske potensial som de eneste cellene der utviklingsprogrammer blir distribuert i full sekvensiell implementering, finner søknad i studier om generens funksjon. Ved hjelp av ESC, deklareres de første kombinasjonene av signaler som aktiverer uttrykket av tidlige og sente gener som koder for utvikling av tre embryonale ark. Konservering genom pluripotency av ESCs in vitro gjør dem unike verktøy for reparasjon regenerering som automatisk kan kompensere for tap celle skadede organer og vev. I en ideell hypotetisk utførelsesform kan anta at "... I transplantasjon av donor PGC-er i mottakerorganismen blir overført kompakt pakket programmer som under gunstige betingelser er realisert ved konstruksjonen av nye tkani'7 stand" ... Effektivt integrert inn i mottagerens legeme som morfologiske, både funksjonelle og funksjonelle. "

Naturligvis, etter utviklingen av metoder for monodifferentiering av ESC, begynte in vivo-studien av den funksjonelle aktiviteten til celler oppnådd in vitro fra en enkelt spesialisert klon. Den spredende ESO-klonen genererer populasjoner av migrerende stamceller som virkelig er i stand til aktivt å integrere i vevsskadezonene til mottakeren, som brukes i regenerativ plastmedisin. Det er blitt fastslått at transplantasjon av Dopa-neuroner i substantia nigra reduserer kliniske manifestasjoner i eksperimentell hemiparkinsonisme. Regionale transplantasjoner av donor-neurale stamceller reduserer graden av motoriske lidelser forårsaket av traumer eller forvirring av ryggmargen og hjernen. Mottatt og de første positive resultatene av stamcelletransplantasjon i demyeliniserende sykdommer. Det ser ut til at de regenerative plastpotensialene til ESCer åpner ubegrensede muligheter for bruk av celletransplantasjon i praktisk medisin. Men når transplantasjon til ektopiske soner, forvandles ESC uunngåelig til svulster. Når subkutan injeksjon av ESC i immunodeficiente mus-teratomer dannes. Når ESK-suspensjonen transplanteres under testisens kapsel i syngene mus, dannes også en teratom bestående av forskjellige vev, hvor cellene er avledet fra alle tre embryonale brosjyrer. I slike teratomer er prosessene med redusert organogenese ekstremt sjeldne.

En rekke arbeider gir informasjon om de positive resultatene av transplantasjon av tidlige derivater av ESCOer til dyr med en ex-perimental patologi. Celle neurotransplantasjon ved bruk av derivater av PGC-er videre utviklet i eksperimentet, og de første kliniske forsøk på korrigering av funksjonelle forstyrrelser i hjernen og ryggmargstraume, behandling av syringomyelia og multippel sklerose (Pinn igjen, 2001). Med bruk av teknologi neyronogeneza ESCs in vitro, i stedet for å bruke embryonale hjerne vevstransplantasjon teknikker utviklet derivater av neurosfærer, erholdt fra kulturer av embryonale neurale vev. Slike transplantasjonssuspensjoner er mye mer homogene og inneholder engasjerte neuronale og neurogliaforløpere.

I tillegg til den vanlige dyrkningsmediet med retinsyre i en dose på 10 ug / ml i 6 uker i embryonale linjer (teratomas) NTERA-2 human -kartsinomy dannet over 80% av post-mitotiske neuroner. Den fullstendige homogeniteten til neuronal populasjon oppnås ved strømningssortering merkede immunophenotypic markører av modne neuroner som kan kvitte seg med restene teratokartsinomnyh og umodne celler. Etter transplantasjon i forskjellige områder av hjernen hos forsøksdyr slike neuroner ikke bare overlever, men også innleiret i regionale nevrale nettverk. Hos dyr med eksperimentmodeller for lokale defekter CNS neurotransplantasjon reduserer kliniske manifestasjoner av human patologi, slik som virkningen av kraniocerebralt traume, slag, demyeliniserende sykdommer, arvelige cerebellar utvikling defekter, sykdommer avsetning av lipider og polysakkarider.

For å optimalisere regenereringsprosessene i degenerative sykdommer i sentralnervesystemet utvikles teknologier for fremstilling av myelinproducerende oligodendrocytter fra ESK. Den første fasen innebærer tradisjonelt spredning av ESC med multiplikasjon av antall celler som er nødvendige for transplantasjon. I andre trinn utføres rettet differensiering av celler til en populasjon av myelinproducerende oligodendrocyt-forløpere, som styres av selektive markørantigener.

Noen prospekter er åpnet for bruk derivater ESCs å utvikle metoder for korreksjon av immunsvikt forårsaket av genetiske defekter i modningen av thymus. I studier på knockout (rag 1) mus med indusert gen feil - brudd rekombinasjon mekanisme V (D) J genloci TCR, som fører til tap av funksjon av T-lymfocytter, transplantasjons tidlige derivater av PGC-er i thymus dyret gjenvinner modning av normale populasjoner av immun-kloner som er ansvarlige for cellulær immunitet. Kliniske forsøk med transplantasjon forformede in vitro hESCs for å behandle dødelig arvelig anemi hos barn.

Innvendinger mot rask introduksjon av stamcelletransplantasjon inn i klinikken er begrunnet av et begrenset antall stabile linjer av humane embryonale stamceller og behovet for standardisering. For å øke renheten til standardiserte ESC-linjer, så vel som voksne stamceller, foreslås det å anvende metoden for linjevalg basert på molekylærgenetisk analyse av korte tandemrepetater av DNA. Det er også nødvendig å teste ESC-linjene for tilstedeværelsen av små kromosomale omlegginger og genetiske mutasjoner, den potensielle muligheten for at de forekommer under kultivirkningsbetingelser er tilstrekkelig høy. Thesis strekker obligatorisk å teste egenskapene til alle typer PGC-er og de regionale pluripotente stamceller, siden deres forplantning in vitro kan gi opphav til nye egenskaper ikke er iboende i embryonale stamceller til definitiv eller vev. Spesielt er det antatt at langvarig dyrking i medier med cytokiner Hess nærmere til tumorcellene, ettersom de oppstår tilsvarende endring trasé som regulerer cellesyklusen med anskaffelsen av evnen til å gjennomføre et ubegrenset antall av celledelinger. Noen forfattere, på grunnlag av potensialet for utviklingen av svulster, anser menneskelig transplantasjon av tidlige derivater av embryonale stamceller som hensynsløshet. Etter deres mening er det mye tryggere å bruke ESC's forpliktede etterkommere, det vil si linjene til forfedrene til differensierte celler. Imidlertid er det ennå ikke utviklet en pålitelig teknikk for å oppnå stabile humane cellelinjer som skiller seg i riktig retning.

I litteraturen er det således flere og flere data om den positive terapeutiske effekten av transplantasjon av humane embryonale stamcellederivater. Imidlertid er mange av disse arbeidene gjenstand for revisjon og kritikk. Noen forskere mener at resultatene av tidlige kliniske studier er foreløpige og foreslår at stamceller kan ha en gunstig effekt på den kliniske løpet av en sykdom. Derfor er det nødvendig å oppnå data om de langsiktige resultatene av celletransplantasjon. Som et argument er stadier av utvikling av klinisk nevrotransplantologi gitt. Faktisk, i litteraturen, først dominert av publikasjonen av den høye virkningsgrad av hjernen Transplants fragmenter av embryoene i Parkinsons sykdom, men deretter begynte å dukke rapporter nekte terapeutisk effekt av embryonale eller føtale neuralt vev transplantert inn i hjernen til pasienter.

Ledet av de første kliniske forsøk bedømme sikkerheten til transplantasjon neuroblast - derivater av PGC NTERA-2 teratokarsinom, ble umodne celler som prolifererer i kultur utsettes for lagring nummer 100 millioner cellemasse. Noen av de således oppnådde celler ble brukt til å karakterisere fenotypen og å bestemme celleforurensninger, samt å teste for mulig forurensning av virus og bakterier. Fra kulturmediet ble fjernet LIF og matelag av stromale celler og føtale skapt betingelser for rettet differensiering av hESCs til neuroblaster med en kombinasjon av cytokiner og vekstfaktorer. Derefter ble neuroblasterne renset fra umodne teratokarcinomceller på en strømningsburingssorter. Etter den andre rensing og karakterisering av fenotypen av transplanterte celler neuroblaster (10-12 millioner kroner) suspensjon ved hjelp av en spesiell sprøyte og microcannulas stereotaxy og under kontroll av CT injisert i nucleus basalis i hjernen hos pasienter (den syvende måned etter hemoragisk slag). Post-transplantasjon ettårig screening av konsekvensene av nevrontransplantasjon i slagzonen viste ingen bivirkninger og uønskede effekter. Halvparten av pasientene opplevde en forbedring i motorfunksjonen i perioden fra 6 til 12 måneder etter transplantasjonen. Positive kliniske endringer ble ledsaget av en økning i blodtilførsel slag sone etter transplantasjon av celler: midlere absorpsjonstiden økning av fluorescens-merket 2-deoksyglukose, ifølge positronemisjonstomografi nådde 18%, og i noen pasienter - 35%.

Det amerikanske sosialhelseinstituttet har imidlertid gjennomført en uavhengig studie av den kliniske effekten av nevrotransplantasjon hos pasienter med Parkinsonisme. Pasienter i den første gruppen ble transplantert med embryonalt nervevev som produserte dopamin, mens den andre gruppen av pasienter var under en falsk operasjon. Resultatene indikerer en null klinisk effekt av slik nevrotransplantasjon, til tross for at dopamin-produserende embryonale nevroner overlevde i hjernen til mottakere. Dessuten, etter 2 år etter transplantasjon av føtale nervevevet i 15% av pasientene utviklet vedvarende dyskinesi, som er fraværende hos pasienter i placebogruppen (Stamceller: vitenskapelige utvikling og fremtidige forsknings retninger Nat Inst, Helse USA ...). Observasjoner av den videre utviklingen av sykdommen hos disse pasientene fortsetter.

Noen forfattere tilskriver motstridende litteratur om evaluering av kliniske effekt neurotransplantasjon data med en annen tilnærming til valg av pasientgrupper, utilstrekkelig valg av objektive metoder for å vurdere deres tilstand, og, viktigst av alt, forskjellige når det gjelder utvikling av fosterets nervevev, og i forskjellige deler av hjernen fra hvilken duken er produsert i forskjellige størrelser transplantasjon og metodiske egenskaper ved kirurgi.

Det bør bemerkes at forsøk på å direkte transplantasjon av pluripotente embryonale stamceller i de striatale region av hjernen hos rotter med eksperimentell legeme gemiparkinsonizmom ledsaget ESC proliferasjon og deres differensiering til dopaminerge neuroner. Det bør antas at nydannede nevroner ble effektivt bygd inn i nevrononale nettverk, siden etter transplantasjon av ESC ble korreksjonen av atferdsavvik og motorisk asymmetri i apomorfinprøven observert. Samtidig døde noen av dyrene på grunn av transformasjon av transplantert ESK i hjernesvulsten.

Eksperter fra US National and Medical Academy, spesialister av National Institutes of Health mener at det kliniske potensialet hESCs fortjener seriøs oppmerksomhet, men insisterer på behovet for en detaljert studie av deres egenskaper, sannsynligheten for komplikasjoner og langtidsvirkninger i eksperimenter med tilstrekkelige biologiske modeller av menneskelige sykdommer (Stamceller og fremtidig regenerativ medisin National Academy Press, stamceller og fremtidige forskningsveiledninger., Nat. Inst, of Health USA).

Fra dette synspunkt er det viktig at det sammenlignende histologisk analyse av forsøks teratoma oppnådd ved transplantasjon i testis slam PGC med teratomas som har utviklet på grunn av transplantasjon tidlig embryo, som inkluderte også til stede ESC viste at ESK uavhengig av deres opprinnelse eller interaksjon med av de eller andre omkringliggende celler på samme måte innser deres tumoregeneriske potensiale. Det viste seg at slike teratomas har en klonal opprinnelse, som fra en tumor ESCs kan forekomme, som består av de deriverte av alle tre kimlag (.Rega, 2001). Det er bemerkelsesverdig at når transplantert inn i immunodefekte mus klonede PGC med normal karyotype og dannet teratomas som består av en rekke forskjellige typer av differensierte somatiske celler. Disse eksperimentelle dataene er det perfekte bevis på teratomens klonale opprinnelse. Fra perspektivet til utviklingsbiologi, tyder de på at det ikke er multiplum av engasjerte progenitorceller og pluripotent stamcelle identitet er kilden til differensierte derivater av alle de tre kimlag, teratom komponenter. Imidlertid, i de praktiske celletransplantasjon Resultatene av disse studiene er, hvis ikke er prohibitive, deretter en advarsel tegn på potensiell fare, ettersom inokulering ESC eller opphavelige kjønnsceller i forskjellige vev fra voksne immunodefekte mus fører uunngåelig til utvikling av svulster fra de transplanterte stamceller. Neoplastisk degenerasjon ectopically transplantert ESC ledsaget av fremveksten av satellitt populasjoner av differensierte celler - ved delvis å differensiere er absolutt ESCs og progenitor-kloner dedikerte linjer. Interessant, når transplantasjon av ESC i skjelettmuskler ved siden av teratokarcinomceller, er neuroner oftest dannet. Men i administrering av PGC-Mace egg eller blastocyst ledsages av full integrasjon i kjønnsceller uten dannelse av neoplastiske celler. I dette tilfellet er ESCer bygget inn i nesten alle organer og vev i embryoet, inkludert det seksuelle rudimentet. Slike allofeniske dyr ble først oppnådd ved å introdusere cellene av teratokarcinom 129 til tidlige embryoer i stadiene av 8-100 celler. I allofennyh mus populasjoner geterogenomnyh celleavledede donor PGC-er blir innført i benmarg, tarm, hud, lever og kjønnsorganer, som gjør det mulig å opprette i forsøket med interspecies-celle-kimærer. Jo mindre tid for tidlig embryo, jo høyere andel av celle chimerization, den høyeste grad chimerization observert i det hematopoetiske system, huden, nervesystemet, lever og tynntarm allofennogo embryo. I den voksne organismen beskyttede vevet mottagelig chimerization fra eksponering til immunsystemet til mottakeren gistogematicalkie barrierene: transplanterte opprinnelige kjønnsceller i testiklene parenkym fulgt av innsetting av donor stamceller i mottakervevet germenativny lag. Imidlertid ikke ESC transplantasjon inn i en blastocyst formasjons kimære primordia genitalia med generering donor opprinnelige bakterieceller ikke forekomme. ESC pluripotency ved oppretting av spesielle betingelser, og kan benyttes for kloning: ESC transplantasjons mus 8-16-celle museembryocelle mitosen hvori tsitokalazinom blokkert, bidrar til normal embryogenese med utviklingen av embryoet donor PGC-er.

Følgelig er en alternativ transplantasjon av allogene ESC terapeutisk kloning basert på somatisk cellekjernetransplantasjon inn i en oocytt enucleated for å skape en blastocyst indre cellemasse hvorfra det deretter avsatt linje genetisk identiske donor PGC-somatisk nucleus. Teknisk sett er denne ideen er mulig, da muligheten for at etableringen av hESC linjer fra blastocyster som oppnås etter transplantasjon av somatiske kjerner i enukleert eggcelle gjentatte ganger vist seg ved forsøk på laboratoriedyr (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Spesielt i mus som var homozygote for mutasjonen rag2, fibroblaster oppnådd ved å dyrke subepidermal vevs-celler ble brukt som donor-kjerner blir transplantert inn erte utskrapte oocytter. Etter aktivering oocytter "zygote" dyrket inntil blastocyst-dannelse, fra den indre cellemasse er isolerte PGC-er og å føre dem inn i en linje for de mutante gen nullizigotnyh celler (rag2 ~ / ~). Ved homolog rekombination i slike ESCer ble mutasjonen av et allel-gen korrigert. I den første forsøksserie fra hESCs rekombinante gen utvinnes embryoidlegemene ble fremstilt transfekterte celler derav med et rekombinant retrovirus (HoxB4i / GFP) og etter forplantning i mus injisert vene rag2 ~ / ~. I den andre serien ble tetraploidblastomerer aggregert med genetisk modifiserte ESC og transplantert til deres kvinnelige mottakere. De fødte immunokompetente musene fungerte som beinmargedonorer for transplantasjon til mutantmus rag2 ~ / ~. I begge serier var resultatet positivt: i 3-4 uker ble alle voksne mus funnet å ha normale normale myeloid- og lymfoide celler som er i stand til å produsere immunoglobuliner. Således kan transplantasjon inn i oocytt-kjerner av somatiske celler bli anvendt ikke bare for å fremstille hESC linjer, men også for tsitogenoterapii - Korreksjon av arvelige avvik ved hjelp av ESC som en vektor for transport av korrigere genetiske informasjon. Men i denne retningen for celletransplantasjon, foruten bioetiske problemer, er det begrensninger. Det er ikke klart hvordan sikker transplantering ville være terapeutisk klonet celler med en genotype identisk med genotypen til en spesiell pasient, fordi slike celler kan innføre mutasjoner som skaper en predisposisjon for visse sykdommer. Normale menneskelige egg forbli utilgjengelig objekt, mens selv når transplantere somatiske kjerner i enucleated dyr eggcelle bare 15-25% konstruert "zygote" utvikler til blastocyststadiet. Det er ikke bestemt hvor mye blastocyst er nødvendig for å oppnå en enkelt linje av pluripotente klonede ESCer. Det bør bemerkes og høyt nivå av økonomiske kostnader forbundet med kompleksiteten av terapeutisk kloning metodikk.

Som konklusjon, i ESC pluripotency genomet hypomethylated DNA blir kombinert med høy telomeraseaktivitet og kort C ^ cellesyklus fase, noe som sikrer intens og potensielt uendelig multiplikasjon, hvorunder PGC beholder diploide kromosomer og "juvenil" sett med fenotypiske egenskaper. Klonevekst av PGC-er i kulturen ikke utelukker dem å differensiere til en hvilken som helst spesiell celle av organismen ved en stopplinje spredning og tilsetning av egnede regulatoriske signaler. Begrensning differensiering av hESCs i linje in vitro somatisk celle realiseres uten medvirkning av mesenkym, utenom Nohteyaov, er organogenese og uten dannelse av embryoet. Ektopisk administrasjon av ESC in vivo fører uunngåelig til dannelsen av teratokarcinomer. ESC transplantasjon inn i en blastocyst eller tidlig embryo ledsaget av deres integrasjon med vevet til embryoet og dets stabile chimerization organer.

Regenerative og plast teknologier basert på celletransplantasjon er skjæringspunktet mellom interessene til medlemmene i cellebiologi, utviklingsbiologi, eksperimentelle genetikk, immunologi, nevrologi, kardiologi, hematologi, og mange andre felt av eksperimentell og praktisk medisin. De viktigste forsøksresultater påvise muligheten for omprogrammering av stamceller med retningen av endringen av deres egenskaper, som åpner perspektiver for kontroll av cytodifferentiation prosesser med vekstfaktorer - for myocardial regenerering, restaurering av CNS-lesjoner og normalisering av funksjon av øyen apparat i bukspyttkjertelen. Imidlertid, den utbredte innføring transplantasjons derivater ESC i medisinsk praksis er nødvendig for å undersøke egenskapene til humane stamceller i mer detalj og ytterligere eksperimenter med PGC-er i eksperimentelle modeller av sykdommer.

Bioetiske spørsmål og problemet med avvisning av allogene cellen transplantasjon kunne løse den observerte plastisitet av genomet av regionale voksne stamceller. Imidlertid er den første informasjonen som når transplantere leveren isolert og grundig kjennetegnet autologe hematopoetiske celler, hvorav det er nye hepatocytter, som omfatter i hepatiske lobules, blir nå vurdert og kritisert. Imidlertid publiserte data at transplantasjon av nevrale stamceller i thymus er dannelse av nye spirer av donor T-og B-lymfocytter, og transplantere neurale stamceller i hjernen i benmargen fører til dannelse av hematopoetiske bakterie vedvarende donor myeloid og erytropoese . Følgelig, i voksne organer kan bevares pluripotente stamceller som er i stand til genom omprogrammering av ESC til kapasitet.

Kilde ESCs for medisinsk bruk forblir menneskelige embryo, som forutbestemmer det uunngåelige i en ny kryssing av moralske, etiske, moralske, juridiske og religiøse spørsmål ved opprinnelsen av menneskeliv. Oppdagelsen av ESCs ga en kraftig impuls til gjenopptakelsen av harde diskusjoner om hvor linjen mellom levende celler og materie, substans og personlighet ligger. Samtidig er det ingen universelle normer, regler og lover angående bruk av ESC i medisin, til tross for gjentatte forsøk på å opprette og akseptere dem. Hver stat i sin lovgivning løser dette problemet alene. For deres del fortsetter leger fra hele verden å forsøke å utvikle regenerativ plastmedisin utover slike diskusjoner, hovedsakelig ved bruk av ikke-embryonale stamceller, og stamcellereserver av en voksen organisme.

Noen av historien om embryonisk stamcelleisolasjon

Terato- (embryo-celler) ble isolert fra -kartsinomnye spontant forekommende testikkel teratomas musestamme 129 / ter-Sv, spontane ovarie teratomas mus linjer Lt / Sv, og fra teratomas, ektopichno kilde ble det transplanterte celler eller embryoniske vev. Blant således oppnådde terato- stabile muselinjer (embryo) -kartsinomnyh enkelte cellene er pluripotente, andre ble utsatt for differensiering bare i celler av en spesiell type, og noen har vært stort sett ute av stand til cytodifferentiation.

På den tiden ble det fokusert forskning som viser en mulig retur terato- (embryo) -kartsinomnyh celler til normal fenotype etter deres innføring i utvikling av embryo vev, samt arbeide for å skape in vitro genetisk modifisert terato- (embryo) -kartsinomnyh celler, ved hjelp av hvilke mutante mus ble oppnådd for biologisk modellering av arvelig patologi fra mennesker.

For å isolere terato- linjer (embryo) har blitt brukt i luftkondisjone -kartsinomnyh cellesuspensjonskultur. I kultur terato- (embryo) -kartsinomnye celler, som ESCs, vokse til å danne embryoidlegemer og krever å bli oversatt til en linje bindende dissosiasjon opprettholde pluripotency på et matelag av embryoniske fibroblaster eller suspensjon dyrking i kondisjonert medium. Terato- pluripotente celler (embryo) - karsinomlinjer store, kuleformede, har en høy aktivitet av alkalisk fosfatase, danne aggregater og er i stand til multidirectional differensiering. Når det innføres i en blastocyst aggregeres med morulae, noe som resulterer i dannelsen av kimære embryoer, i de forskjellige organer og vev som derivater er funnet terato- (embryo) -kartsinomnyh celler. Men det store flertallet av slike chimeriske embryoer dør i livmoren, og i organer overlevende kimærer nyfødte fremmede celler og sjelden detektert med en lav tetthet. Samtidig forekomst av tumorer (fibrosarkom, rhabdomyosarkom, og andre typer av ondartede hevelser og adenom Pancreas) kraftig øker, og neoplastiske degenerasjon oppstår ofte til og med i utero kimære embryoer.

De fleste av terato-embryo-karsinomceller i mikromiljøet av normale embryonale celler kjøper nesten naturlig maligne neoplastiske egenskaper. Det antas at irreversibel malignitet skyldes aktiveringen av proto-onkogener i prosessen med strukturelle omarrangementer. Ett unntak er de cellelinjer embriokartsinomnoy SST3, teratom avledet fra murine testikkel (linje 129 / Sv-ter), som oppviser en høy evne til å integrere inn i vev og organer i fosteret uten den påfølgende dannelse av svulster hos kimære mus. Derivater av terato-embryo-karsinomcellelinjer i chimera-mus bidrar praktisk talt ikke til dannelsen av primære gonocytter. Selvfølgelig, er det forbundet med en høy frekvens av kromosomforstyrrelser som er felles for de fleste terato- (embryo) -kartsinomnyh linjer i hvilke celler observert som Aneuploidy eller kromosomalt avvik.

I laboratoriet ble det oppnådd flere stabile linjer av humane terato-embryokarsinomer, karakterisert ved pluripotency, høy proliferativ aktivitet og evnen til å differensiere med vekst i kulturer. Spesielt ble linjen av humane terato-embryo-karsinomceller NTERA-2 brukt til å studere mekanismer for neural cytodifferentiering. Etter transplantasjon av celler av denne linjen inn i subventrikulærregionen av forebrain av nyfødte rotter, ble deres migrasjon og nevonogenese observert. Det har vært endog forsøk på å transplantere neuronal terato- oppnådd ved å dyrke celler (embryo) -kartsinomnoy linje NTERA-2 til pasienter med langt slag, som ifølge forfatterne, som fører til klinisk forbedring av sykdommen. Samtidig ble ikke tilfeller av ondartede transplanterte celler av terato-embryo-karsinomlinjen NTERA-2 observert hos pasienter med hjerneslag.

Den første linje av udifferensierte pluripotente embryonale stamceller fra mus i begynnelsen av 80-tallet av det forrige århundre kom Evans og Martin, ved å velge dem fra den indre cellemasse av en blastocyst - embryoblast. De isolerte ESC-linjene har lenge bevart pluripotency og evnen til å differensiere til forskjellige typer celler under påvirkning av faktorer i et spesialkulturmedium.

Uttrykket "embryonale pluripotent stamcelle" tilhører Leroy Stevens at undersøkelsen av tobakk tjære innvirkning på frekvensen for tumorutvikling rettet oppmerksomheten mot forekomst av spontane testikkel teratokarsinom av lineær (129 / v) av musene i kontrollgruppen. Testikkel teratokarsinomceller ble karakterisert ved en høy formeringshastigheten, og i nærvær av væske igjen i bukhulen med dannelse av spontan differensiering av nerveceller, keratinocytter, kondrocytter, kardiomyocytter, samt hår og beinrester, men uten noen indikasjon på en ordnet cytoarchitectonics passende vev. Ved planting i teratokarsinom cellekultur dyrket fristilt til substratet pluripotent klonene og dannet embryoidlegemer ble deretter stanset og utsatt for spontan fisjon uordentlig differensiere til neuroner, gliaceller, muskelceller og kardiomyocytter. Stevens funnet at teratokarsinom mus 129 / volum inneholder mindre enn 1% av celler som er i stand til å differensiere til en rekke spesialiserte somatiske linje, og selv differensiering er avhengig av faktorer som påvirker dem (sammensetning peritoneal væske, de produkter som tilsettes til kulturen i modne celler eller vev). Leroy Stevenson antagelse om tilstedeværelse blant teratokarsinomceller embryoniske forløperceller seksuell kimceller ble bekreftet: suspensjonen embryoblast pre-implantasjonsembryoer celler i vev fra voksne mus dannet teratokarsinom, og atskilt fra dem rene cellelinjer etter intraperitoneal administrering til mottakende dyr hadde forskjellige neuroner, kardiomyocytter og andre somatiske kletki derivater av alle tre kimlag. Ved forsøk in vivo transplantasjon ESK (oppnådd fra embryoblast men ikke trofoblast) i museembryoer på forskjellige stadier linjene 8-32 blastomere avsluttet fødselen av det kimære dyr (ingen tumordannelse) i organer som påviser spirer donorvev. Kimerisme ble observert selv i linjen av kjønnsceller.

Primær forløperceller kjønnsceller isolert fra museembryo bakterie kjønn, morfologi, immunologiske fenotype og funksjonelle karakteristika i overensstemmelse med hESCs avledet fra teratokarsinom Stevenson og embryoblast. Ved kimærer født etter administrering av hESCs inn i en blastocyst, allofenny organ morfogenese karakterisert mosaikk alternerende donor og mottaker strukturelle og funksjonelle enheter i lever, lunge og nyre. I en rekke tilfeller ble dannelsen av intestinale krypter eller lobuler i leveren, som ble funnet samtidig av mottaker og donorceller, observert. Imidlertid oppnådde alltid realiseringen av morfogenese i henhold til det genetiske programmet av arten som mottakeren tilhørte, og kimerisme var begrenset utelukkende til cellulær nivå.

Deretter ble det funnet at spredning av hESCs uten cytodifferentiation på et matelag-avledet mesenchymale celler (føtale fibroblaster) skjer i nærvær av LIF-binding i selektive næringsmedia, som selektivt gir bare overlevelse av stamceller og forløperceller, mens de aller fleste av de spesialiserte cellulære elementer dør. Med hjelp av disse teknikkene i 1998 av James Thomson ble tildelt fem udødeliggjorte linjer av embryonale stamceller fra den indre cellemasse av en blastocyst person. Samme år, har John Gerhart utviklet en metode for å isolere de udødelige MGP linjer fra seksuell puff med fire-fem uker menneskelige embryoer. På grunn av deres unike egenskaper, på bare to år, har embryonale stamceller og stamceller av endelig vev allerede begynt å bli brukt i praksis med regenerativ medisin og genterapi.