Embryonale stamceller

Oppdagelsen av embryonale stamceller oppsto ikke ved en tilfeldighet, men dukket opp på den forberedte grunnen for vitenskapelig forskning innen utviklingsbiologi. Begrepet «stamcelle» ble introdusert i medisinen i 1908 på kongressen til det hematologiske selskap i Berlin av Alexander Maximov i forbindelse med hematopoietiske celler. Lenge før isoleringen og produksjonen av stabile linjer av pluripotente embryonale stamceller, ble stamterato-(embryokarsinom)celler brukt i studier av tidlige utviklingsprosesser, ved hjelp av hvilke ukjente mekanismer for embryogenese ble studert, inkludert uttrykksekvensen av tidlige gener og proteinprodukter av deres aktivitet.

Men går totipotensen til det menneskelige genomet ugjenkallelig tapt i evolusjonsprosessen? Nei, og embryogenesen er bevis på dette. Hvis dette er tilfelle, når vil da i prinsippet den andre veien for evolusjonær utvikling bli realisert? Sannsynligvis når mennesket kommer inn i verdensrommet, hvor miljøforholdene vil være relativt konstante i tilstrekkelig lang tid. Tapet av beinvev (demineralisering av bein i vektløshet), som veldig sakte gjenstand for ombygging og regenerering, kan betraktes som det første trinnet i prosessen med tilpasning av mennesket, som art, til eksistens i romforhold. Prisen for den andre veien for evolusjonær utvikling vil imidlertid være annerledes - prisen for tilbakeføring av totipotens og absolutt plastisitet til alle celler vil være sterilitet. Så i denne verdenen av "evolusjonære kameleoner" må vi reprodusere oss uten meiose, ved knoppskyting. Men vi vil leve lenge. Telomerase-udødelighet er en amøbes udødelighet. I en flercellet organisme er stamceller substratet for kvantitativ og kvalitativ levetid.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Kilder til embryonale stamceller

I dag er kildene til embryonale stamceller for laboratorieforskning museteratokarsinomlinjer (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) og humant teratokarsinom (NTERA-2, TERA-2, H-9 klon), samt Trauneon ESC-linjer. Tilgjengeligheten av et detaljert cellepass som indikerer immunfenotypen, resultater av kromosomanalyse, mRNA-ekspresjonsprofiler, eksponerte reseptorer og intracellulære signalproteiner kompenserer imidlertid ikke for de betydelige manglene ved teratokarsinom ESC-linjer - raskt tap av totipotens og umuligheten av å bruke dem i kliniske studier, mens blandet differensiering i kultur gjør det svært vanskelig å isolere en ren spesialisert linje fra en heterogen cellepopulasjon. Derfor er kilden til ESC-linjer som er laget for kliniske formål vanligvis den indre cellemassen til blastocysten, individuelle blastomerer fra 8-cellede embryoer, morulaceller fra senere stadier, samt primordiale kimceller.

Det skal bemerkes at teratokarsinomceller, selv om de har pluripotens, er karakterisert av et betydelig lavere pluripotent potensial sammenlignet med ESC-er. Integrasjonen deres med embryonale celler fører sjelden til dannelse av kimærer, som dessuten aldri danner gameter med genotypen til teratokarsinomceller. Det antas at dette skyldes den hyppige forekomsten av kromosomavvik under dyrking av teratokarsinomceller: tap av Y-kromosomet, forskjellige trisomier, delesjoner eller translokasjoner.

Det har blitt gjort gjentatte forsøk på å isolere en menneskelig ESC-linje, men denne oppgaven har ikke blitt løst, siden normale menneskelige blastocyster er vanskelige å få tilgang til. I tillegg er hyppigheten av kromosomavvik hos mennesker høyere enn i dyreembryogenese. Det overveldende flertallet av tidlige menneskelige embryoer oppnådd etter in vitro-fertilisering viser kaotisk kromosomal mosaikk og har ofte numeriske og strukturelle avvik. Selv senere, på blastocyststadiet, består bare 20–25 % av menneskelige embryoer av celler med normal karyotype. Det var praktisk talt umulig å bruke slike embryoer til å lage ESC-er, siden zygoter vanligvis ble dyrket til to- eller fireblastomerstadiet og deretter transplantert inn i livmoren. Først relativt nylig har en pålitelig teknikk for å dyrke befruktede menneskelige egg til blastocyststadiet blitt utviklet. Innføringen av denne teknikken i praksisen med in vitro-fertilisering har ikke bare økt hyppigheten av vellykkede implantasjonsresultater, men har også gjort normale blastocyster til et mer tilgjengelig objekt.

En annen pluripotent stamcellekilde er de primordiale kimcellene, som, i motsetning til de mer avanserte progenitorpopulasjonene i germinalepitelet, ikke har beta-integrin på overflaten, men uttrykker høy aktivitet av alkalisk fosfatase. Det skal bemerkes at populasjoner av stamceller som ble dannet fra primordiale kimceller har blitt studert eksperimentelt siden 1980-tallet. På den tiden ble det utviklet en teknikk for å isolere primordiale kimceller fra det rudimentære av museembryoets gonade. De første mislykkede resultatene av dyrking av primordiale kimceller in vitro antydet at disse forsøkene var nytteløse, siden cellene, selv om de overlevde, ikke prolifererte og døde i løpet av den første dagen. Det ble senere fastslått at primordiale kimceller fra mus reproduserer seg in vitro bare i nærvær av løselige og membranbundne spesifikke polypeptidvekstfaktorer i kulturmediet. Resultatene fra en rekke studier har vist at for overlevelse og proliferasjon av primære kimceller er tilstedeværelsen av ikke bare LIF, men også membranbundne og løselige stålfaktorer (SIF) i kulturmediet nødvendig. Disse peptidene produseres av somatiske celler fra embryoer som er homozygote for Steel-mutasjonen, og en av dem er en ligand av cKit-proto-onkogenet.

Primære kimceller hos pattedyr og mennesker har en ekstragonadal opprinnelse og er kilden til klonal utvikling av kimcellelinjen. Opprinnelsen til den primordiale kimcellelinjen, så vel som alt embryonalt vev og den ekstraembryonale mesodermen, er epiblasten (primær ektoderm) hos tidlige embryoer, som har en mosaikkstrukturell organisering. Ved hjelp av metoden med mikrokirurgisk fjerning av forskjellige deler av det tidlige embryoet ble det etablert en lokaliseringssone i epiblasten av klonen av dedikerte forløpere til primordiale kimceller. Ved hjelp av rhodamindekstran, som ble brukt som cellemarkør, ble det fastslått at forløperne til primordiale kimceller er lokalisert i den proksimale regionen av epiblasten, nær den ekstraembryonale ektodermen. Den primordiale kimcellelinjen stammer fra en 45-cellet klon, hvis allokering skjer helt i begynnelsen av gastruleringen. Deretter segregerer klonen, og under gastruleringen går de primære kimcellene inn i det ekstraembryonale mesodermet og finnes ved bunnen av allantoisrudimentet, bak den primære stripen. Derfra migrerer de primære kimcellene mot den ventrale delen av hindgut-endodermen og beveger seg deretter aktivt langs mesenteriet, og fyller genitalryggene på slutten av migrasjonen. Under migrasjonen, så vel som i de første 2-3 dagene av lokaliseringen i gonaderudimentet, prolifererer de primære kimcellene aktivt og gjennomgår åtte replikasjonssykluser. Hvis det er omtrent 50 primære kimceller ved begynnelsen av migrasjonen, overstiger antallet primære kimceller 25 000 i genitalryggene til museembryoer med tolv dagers utvikling.

Den funksjonelle likheten mellom ESC-er og primordiale kimceller fremgår av den fullstendige integreringen av sistnevnte i blastocysten med erstatning av den interne cellemassen og den påfølgende fullverdige utviklingen av embryoet, hvis vev kun består av etterkommere av de primordiale kimcellene. I andre egenskaper viste musens primordiale kimceller seg også å være identiske med ESC-er, og demonstrerte evnen til å differensiere i en rekke retninger, til å danne embryoide legemer in vitro, og til å danne teratomer in vivo når de administreres subkutant til immunsviktige mus, noe som ligner spontane testikkelteratomer hos 129/ter-mus.

Det ble funnet at når LIF, membranbundet og løselig SIF tilsettes mediet, overlever og reproduserer isolerte primære kimceller fra 8 dager gamle museembryoer i kulturen i 4 dager, men dør deretter. Dessuten sammenfaller perioden da død av primære kimceller observeres i kulturen med utviklingsstadiet til museembryoer (12,5–13,5 dager) når kvinnelige primære kimceller går inn i meiose i gonadens rudiment, og mitotiske delinger blokkeres i hannlige primære kimceller. Men hvis ikke bare vekstfaktorene LIF og SIF, men også FGF2 tilsettes mediet, fortsetter de primære kimcellene å proliferere, og kolonier av celler som er i stand til å formere seg selv etter at vekstfaktorene (SIF og FGF) er fjernet fra mediet, dannes i subkulturene. Slike celler kan dyrkes i lang tid på et substrat av embryonale fibroblaster uten å tilsette den løselige vekstfaktoren LIF. Det ble foreslått å kalle disse stabile cellelinjene oppnådd fra primordiale kimceller for embryonale kimceller. Denne betegnelsen er slett ikke vellykket, siden det er umulig å oppnå embryonale kimceller som er i stand til å utføre påfølgende stadier av oogenese eller spermatogenese når man dyrker EG-celler. Dette skyldes det faktum at EG-cellelinjer, selv om de stammer fra primordiale kimceller, mister evnen til å binde seg til kimlinjer når de tilegner seg egenskapene til embryonale pluripotente stamceller i kultur. Med andre ord, primordiale kimceller mister egenskapene til gametforløpere når de dyrkes og transformeres til ESC-lignende pluripotente celler.

Det har blitt bemerket at teratomer ikke oppstår når EG-celler introduseres i immunsviktige mus. Det antas at tapet av menneskelige EG-cellers evne til å gi opphav til teratomer skyldes det faktum at disse linjene ikke ble laget direkte fra dyrkede primære kimceller, men ble oppnådd fra celler isolert fra embryoide legemer. Derfor er det mulig at de er etterkommere av pluripotente, men allerede dedikerte celler.

Det skal bemerkes at det er grunnleggende forskjeller mellom EG-celler og primordiale kimceller. Sistnevnte tillater ikke å oppnå kimære museembryoer, noe som indikerer manglende evne hos primordiale kimceller til å integreres i den indre cellemassen eller trofektodermen. Egenskapene til den primordiale kimcellepopulasjonen ligner mer på dedikerte linjer av somatiske celler fra senere embryoer, hvis introduksjon i blastocysten heller ikke fører til dannelse av kimære embryoer.

Modifisering av teknikken for dyrking av embryoide legemer oppnådd ved aggregering av EG-celler gjorde det mulig å oppnå en annen populasjon av pluripotente celler, kalt "embryoide legemsavledede celler" (EBD-celler), ved bruk av seleksjon på selektive medier. EBD-cellers evne til å proliferere i kultur over lang tid gjorde det mulig å lage stabile cellelinjer av engasjerte celler. Kloner av celler som uttrykker et bredt spekter av mRNA- og proteinmarkører fra spesialiserte celler ble oppnådd. Denne tilnærmingen beviste til slutt at menneskelige primære kimceller er pluripotente og differensierer in vitro til forskjellige celletyper: nevroner, nevroglia, vaskulært endotel, hematopoietiske celler, muskel- og endodermale celler.

Alternative kilder til embryonale stamceller

En alternativ kilde til humane ESC-linjer kan være hybridceller. Implantasjon i livmoren til pseudo-drekte kyr av en heterogen konstruksjon oppnådd ved fusjon ved elektroporering av somatiske celler fra det menneskelige fosteret med et kuegg hvorfra pronukleusen tidligere er fjernet, gjør det mulig å oppnå en intern cellemasse fra et kunstig embryo i pre-implantasjonsstadier av utviklingen. For dette formålet oppnås i det første stadiet en blastocyst fra et kuegg med en transplantert human cellekjerne.

I det andre trinnet isoleres en embryoblast fra blastocysten, og fra den isoleres ESC-er ved hjelp av Thomson-metoden. Det er verdt å merke seg at de beste resultatene i isolering av ESC-linjer ved hjelp av denne metoden ble oppnådd ved bruk av kjerner av follikulære celler eller primære kimceller som forblir i menneskekroppen i dvaletilstand. Dette skyldes det faktum at kjernene i humane celler transplantert inn i et kuegg må ha ikke-forkortede telomerer og høy telomeaseaktivitet, noe som bidrar til å unngå for tidlig aldring av ESC-kloner oppnådd fra et hybridegg (Repin, 2001). Det er kjent at de viktigste intracellulære markørproteinene til ESC-er er Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, som tilhører de såkalte kromatin-dempingsproteinene. Dempingsproteiner gir en spesielt kompakt pakke av heterokromatin, som forhindrer dannelsen av eukromatinløkker. Kromatinpakking mediert av disse proteinene korrelerer med totipotensen til ESC-genomet. Det er hittil fastslått at modne bovine og humane oocytter er den eneste typen spesialiserte celler som inneholder høye konsentrasjoner av silencerproteiner i cytoplasmaet. På dette grunnlaget ble det utviklet en metode for å oppnå hybride ESC-er ved å overføre somatiske cellekjerner til enukleerte bovine oocytter. Foreløpige in vitro-studier har vist at cytoplasmaet til bovine oocytter gjenoppretter totipotensen til det humane somatiske cellekjernegenomet etter 12–24 timers dyrking.

Av spesiell interesse er dataene om særegenhetene ved preimplantasjonsutviklingen av menneskelige embryoer, noe som indikerer en senere erstatning av totipotente celler med en populasjon av pluripotente celler enn hos mus. En studie av cellulære transformasjoner viste at trofoblastceller også oppstår fra cellene i den indre cellemassen til menneskelige blastocyster, i tillegg til ESC-er, noe som indikerer deres totale potens.

Det er kjent at det i blastocyststadiet oppstår to ulikt engasjerte cellepopulasjoner. En av dem danner det ytre laget av blastocysten - trofektodermet, hvis derivater er trofoblastcellene og andre embryonale komponenter i morkaken. Den andre cellepopulasjonen er gruppert i en tett masse som er i kontakt med den indre overflaten av trofektodermet. Derivatene av cellepopulasjonen i den indre cellemassen er alle vev og rudimenter av embryoorganene. I det sene blastocyststadiet dannes den ekstraembryonale endodermen fra den indre cellemassen, og epiblasten (primær ektoderm) dannes. I dette tilfellet beholder epiblastcellene pluripotens, mens evnen til å differensiere celler i den ekstraembryonale endodermen er begrenset.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Innhenting av menneskelige embryonale stamceller

Inntil nylig trodde man at det var umulig å utvinne ESC-er fra trofoblast. Imidlertid prolifererer en linje av diploide trofektodermstamceller isolert fra en blastocyst og transformeres til stamceller i et medium som inneholder FGF2 og heparin i stedet for LIF. Hvis FGF2 fjernes fra mediet, slutter trofektodermcellene å multiplisere, kromosomendoreduplikasjon begynner i dem, og trofektodermcellulære elementer transformeres gradvis til gigantiske trofoblastceller. Sannsynligvis stimulerer ikke LIF proliferasjon av trofektodermceller på grunn av det faktum at FGF2 utløser en annen transsignaliseringsmekanisme, siden FGF2, som binder seg til plasmareseptoren (FGFR2), aktiverer MAP-kinaser i cytoplasmaet - ERK1 og ERK2. Følgelig, når én signalvei (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) slås på i blastocystceller, transformeres cellene i den indre cellemassen til pluripotente ESC-er, og når den andre mekanismen for transmembran signaltransduksjon (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) aktiveres, dannes trofektoderme stamceller i blastocysten. Valget av signalvei avhenger igjen av aktiviteten til oct4-genet. Dette genet, som tilhører POU-domenet, er lokalisert i t-lokuset til autosom 17 og uttrykkes under oogenese, under kløyvingsperioden, så vel som i cellene i den indre cellemassen til blastocysten og i de primære kimcellene. Den funksjonelle rollen til oct4-genet er å kode for en transkripsjonsfaktor som er nødvendig for fremveksten av pluripotente celler, deres differensiering og dedifferensiering.

Ekspresjon av oct4-genet i ESC-er varierer avhengig av interaksjonen mellom denne transkripsjonsfaktoren og kofaktorer. Styrt regulering av oct4-ekspresjon i blastocyster viste at når aktiviteten reduseres, danner halvparten av cellene trofektoderm, mens når indusert ekspresjon av oct4 øker, oppstår hovedsakelig ESC-er.

I forsøket kan ikke ESC-er overføres til en linje under dyrking av totipotente blastomerer i kløyvingsstadiet, så vel som i gastruleringsstadiet og senere stadier av embryonal utvikling. Mus-ESC-er isoleres vanligvis på 3,5-4,5. dag av svangerskapet, som tilsvarer det sjette stadiet (enkeltlagsblastocyst) og syvende stadiet (tolagsblastocyst - tidlig eggsylinder) av normal embryogenese. Det er åpenbart bare i preimplantasjonsperioden at museembryoer inneholder cellepopulasjoner som er i stand til å transformere til ESC-er. Følgelig er isolering av ESC-linjer bare mulig i visse stadier av embryogenesen. Zygoten og blastomerene som oppstår under kløyvingen er totipotente, sett fra muligheten for å utvikle et levedyktig embryo med embryonale membraner og morkake. Tapet av total potens av kimceller begynner på det sene morulastadiet, når ytterligere forpliktelse av blastomerer avhenger av deres plassering. Tidlige morula-blastomerer beholder totipotens, siden eksperimentelle manipulasjoner med endringer i lokaliseringen deres, for eksempel inversjon av plasseringen deres, ikke forhindrer utviklingen av et fullverdig embryo.

Det er fastslått at effektiviteten av å isolere ESC-er i en linje påvirkes av blastocystenes tilstand på tidspunktet for eksplantasjonen. Bruk av blastocyster etter modellering av en syv dager lang diapause i reproduksjonskanalen hos mus som har fått ovariektomert på den 3,5. dagen av drektigheten og fått progesteron, letter mer vellykket isolering av embryonale stamcellelinjer. Det antas at antallet blastomerer som danner den indre cellemassen øker under slike forhold. Det er også mulig at cellesyklusen forlenges og at de fleste blastomerer går inn i G0-fasen.

I tillegg avhenger etableringen av stabile pluripotente ESC-linjer av embryoenes genotype: ESC-er isoleres ganske enkelt fra blastocyster fra 129-muselinjen, de er mye vanskeligere å oppnå ved bruk av CS7BL/6-mus, og det er praktisk talt umulig å isolere en ESC-linje fra blastocyster fra CBA/Ca-mus. Tidlige embryoer har åpenbart noen genetiske trekk som påvirker utviklingen av en pluripotent ESC-linje. Likevel, ved dyrking av isolerte epiblaster, samt ved selektiv seleksjon av differensierende celler, ble ESC-linjer likevel isolert fra tidlige embryoer fra CBA/Ca-mus.

En velprøvd standardteknikk for å utvinne ESC-linjer fra blastocyster er gitt i laboratoriehåndbøker om teknikken til eksperimenter med tidlige embryoer. Eksperimentelle ESC-linjer kan også utvinnes ved å dyrke isolerte epiblast (primær ektoderm) fra 4,5 dager gamle museembryoer ved hjelp av en ganske kompleks mikrokirurgisk teknikk og modifiserte dyrkingsforhold. Arbeidsintensiteten til denne prosedyren er berettiget, siden hyppigheten av ESC-linjedannelse i dette tilfellet viste seg å være betydelig høyere enn i arbeider med blastocystens indre cellemasse.

For å isolere ESC-linjer overføres hver klon til en mikrobrønn, et aggregat på 40–60 celler dyrkes og dispergeres deretter igjen. Flere repetisjoner av denne prosedyren lar oss oppnå en udødeliggjort ESC-linje med maksimal proliferasjonsrate for normokaryotypiske celler festet til plast, som beholder totipotens og høy telomeraseaktivitet etter 50–100 passasjer. I prosessen med å opprettholde ESC-linjer er den største faren forurensning av mediet eller serumet med bakterielle endotoksiner – selv sporkonsentrasjoner av endotoksin i kulturmediet forårsaker massedød av umodne kimceller. Med nøye overvåking av lineær vekst og rettidig dispersjon er ESC-er i kultur i stand til symmetrisk deling, der begge dattercellene forblir pluripotente og i stand til å utføre et ubegrenset antall cellesykluser, samtidig som de opprettholder en diploid karyotype og total potens.

Seleksjon av en ren populasjon av humane ESC-er kan utføres etter transfeksjon av genomet deres med rekombinante DNA-molekyler som inneholder genet som koder for syntesen av grønt fluorescerende protein (GFP). GFP-ekspresjon øker når ESC-er dyrkes under forhold som støtter deres proliferasjon, mens ekspresjonsnivået av dette genet synker med starten av differensiering, noe som tillater seleksjon av rene stabile pluripotente cellelinjer på et selektivt medium. Ved dyrking av ESC-er isolert ved bruk av GFP-seleksjon øker hyppigheten av kolonidannelse mange ganger, siden den kraftige antiproliferative effekten av differensierte celler elimineres under betingelsene for seleksjonskulturer.

Translasjonen av humane embryonale stamceller til en linje utføres ved hjelp av metoden for isolering fra preimplantasjonsembryoer (på stadiet 80-120 celler), som er igjen etter in vitro-fertiliseringsprosedyren. For dette formålet dispergeres kunstig oppnådde "overskudd" av embryoer mekanisk i Delbecco-Eagle-mediet. Etter merking av cellene med selektive monoklonale antistoffer med en fluorescerende markør, isoleres embryoblastcellene. Embryoblasten dispergeres i individuelle celler ved hjelp av en dispase-kollagenase-blanding. De dissosierte cellene dyrkes i et spesielt medium (80 % Delbeccos medium + 20 % føtalt kalveserum i nærvær av 500 μg/ml IL-6, LIF og SCF) over et tilførselsmonolag av embryonale fibroblaster fra de første 3 passasjene. I dette tilfellet opprettholdes overlevelse og proliferasjon av stam- og progenitorceller på grunn av effekten av IL-6, LIF og SCF. I et slikt medium vokser ESC-ene som suspensjonskloner av løse, sammenknyttede celler, som må dissosieres ved myk, gjentatt pipettering. Nye kloner dukker opp i den suspenderte kulturen på 5.-7. dag. Maksimal vekstrate for ESC-er oppnås ved gjentatt dissosiasjon av kloner på stadiet 10-15 celler. Deretter overføres hver klon til en mikrobrønn og dyrkes til et aggregat på 40-50 celler. Prosedyren gjentas mange ganger i passasjer, noe som øker kulturvolumet til en tetthet på 5-10 millioner celler per 6 cm skål. Ved å bruke slik passasjering isolerte Thomson 10 udødelige kloner av humane ESC-er, som etter 100 passasjer beholdt høy telomeraseaktivitet, evnen til kraftig proliferasjon, minimale fenotypiske egenskaper og total potens med evnen til å differensiere til hvilken som helst av 350 spesialiserte cellelinjer avledet fra ekto-, meso- og endoderm. Differensiering av humane ESC-er begynte (ved mediumbytte, tilsetning av serum og eliminering av LIF) med cellebinding til substratet, noe som indikerer utviklingen av cytoskjelettet og uttrykk av adhesjonsreseptorer. Viktigere er det at med ubegrenset proliferasjon beholdt humane ESC-er en normal karyotype.

Den andre metoden for å isolere humane ESC-linjer er basert på bruk av primære kimceller. Eksperimentelle studier har vist at E-cellelinjer kan utvinnes fra kjønnsfoldene til 12,5 dager gamle museembryoer. I disse tilfellene var imidlertid hyppigheten av dannelse av progenitorcellelinjer betydelig lavere enn i eksperimenter med tidligere embryoer. Samtidig er primære kimceller fra gonadene til museembryoer med 13,5 dagers svangerskapsalder ikke i stand til å transformere seg til linjer i det hele tatt.

De første stabile linjene av pluripotente humane EG-celler ble oppnådd fra primære gonocytter isolert fra gonadene til 5-9 uker gamle embryoer. De isolerte cellene ble dyrket på et substrat av inaktiverte museembryonale fibroblaster i DMEM-medium med føtalt serum tilsatt merkaptoetanol, forskolin og rekombinante humane vekstfaktorer (FGF og LIF). Etter 7-12 dager dukket det opp flercellede kolonier i kulturen, som korresponderte med humane EG-celler ved morfologiske trekk og molekylære markører. Etter aggregering dannet disse cellene embryoide legemer, med videre utvikling av disse dukket det opp spesialiserte celler karakteristiske for derivater av alle tre kimlagene. I løpet av 10-20 passasjer beholdt EG-cellelinjene en normal karyotype og mistet ikke pluripotens.

Det har også blitt vist at den kombinerte virkningen av LIF, membranbundne og løselige stålfaktorer, og TGF-b endrer utviklingsprogrammet til primordiale kimceller. I stedet for å opphøre mitotiske delinger og begynne å differensiere mot oogenese eller spermatogenese, fortsetter primordiale kimceller å proliferere. Etter flere ytterligere mitotiske sykluser blir de lik epiblastceller, og mister egenskapene til kimcelleforløpere og transformeres til pluripotente embryonale stamceller (EG).

I 1998 ble derfor udødeliggjorte linjer av primordiale kimceller isolert for første gang fra det genitale rudimentet av menneskelig føtalt obduksjonsvev. I menneskelig embryogenese opptrer primordiale kimceller i plommesekken i den tredje uken av utviklingen, og i den fjerde-femte uken migrerer disse cellene til den genitale tuberkelsonen, hvor de danner sovende populasjoner av primære gonocytter. I en inaktiv tilstand bevares primordiale kimceller i embryoet frem til fødselen. Linjer av primordiale kimceller isoleres fra den føtale genitale tuberkelen til 5-9 uker gamle embryoer, hvor det ekstraherte vevet behandles ex tempore med en blanding av kollagenaser av typene IV-V, hyaluronidase og DNase for å øke det kvantitative og kvalitative utbyttet av celler. Primordiale kimceller i vevet til den føtale genitale tuberkelen er omgitt av stromale (mesenkymale) Sertoli-celler. Det funksjonelle formålet til Sertoli-celler er å produsere antiapoptotiske faktorer (Fas-ligand), mitogener og immunsuppressive midler som beskytter kimceller mot immunangrep fra kroppen. I tillegg spiller det stromale mikromiljøet i genital tuberkel en viktig rolle i modningen av gameter. De isolerte primære kimcellene plantes i kultur over et stromalt materlag bestående av føtale fibroblaster fra de tre første passasjene. Den mest effektive kombinasjonen av mitogener er et kompleks bestående av LIF, FGF og forskolin (en stimulator av cAMP-dannelse). Proliferasjon av primære kimceller in vitro krever tilsetning av føtalt serum, i hvis nærvær reproduksjonen av primære gonocytter i kultur ledsages av dannelsen av kloner av sfæriske celler som ikke er festet til substratet.

Ved National Institutes of Health i USA ble det, basert på en oppsummering av eksisterende data om metoder for å isolere humane ESC-linjer fra blastocyster, trukket en foreløpig konklusjon om at vellykket isolering av ESC-er er mest sannsynlig når man dyrker blastocyster med en velformet indre cellemasse (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Fra dette synspunktet er den optimale kilden til ESC-er for å lage linjer humane blastocyster på den 5. utviklingsdagen, hvorfra trofektodermen bør fjernes forsiktig når man isolerer den indre cellemassen. Den isolerte indre cellemassen, som består av 30–35 celler på dette stadiet, bør dyrkes på et substrat av embryonale musefibroblaster, noe som er en avgjørende betingelse for dannelsen av ESC-kolonier i kultur.

Analyse av fenotypiske trekk ved embryonale stamceller

Av spesiell interesse er den interspesielle komparative analysen av de fenotypiske trekkene til ESC-er. Det ble funnet at humane ESC-kolonier er tette klynger av flate, epitellignende celler, mens museembryoide kropper består av et løst konglomerat av avrundede celler. I humane ESC-er er kjerne-plasma-forholdsindeksen lavere enn i muse-ESC-er. Embryonale stamceller fra aper danner flatere kolonier av celler med ujevne kanter. Individuelle celler er lett synlige i tidlige kloner av primat-ESC-er. Prolifererende ESC-er fra alle studerte dyrearter uttrykker ikke MHC klasse I og II-molekyler. Samtidig gir humane ESC-er en positiv reaksjon på TERA 1-60 og GCTM-2-antistoffer, noe som indikerer tilstedeværelsen av keratin/kondroitinsulfatproteoglykaner på overflaten, karakteristisk for embryo-(terato)-karsinomstamceller. Ekspresjon av oct4-genet i ESC-er hos alle dyrearter tyder på at, til tross for fenotypiske forskjeller, er det samme settet med gener som er ansvarlige for å opprettholde pluripotens tilsynelatende aktivert i ESC-er fra mennesker og mus (Peru, 2001). I tillegg har ESC-linjer isolert fra rotte-, gris-, kanin-, primat- og storfeembryoer lignende morfologiske egenskaper, et lignende sett med molekylære identifikasjonsmarkører og en nesten identisk molekylær mekanisme for implementering av embryogeneseprogrammer, noe som lar oss se på problemet med xenotransplantasjon på nytt.

I motsetning til normal embryogenese in vivo, er proliferasjon av ESC-er in vitro ikke ledsaget av dannelse av kimlag og skjer mot bakgrunnen av blokkering av homeotiske Hoxgener, dvs. uten organogenese. Siden segmenteringsgenene ikke fungerer, er det umulig å reprodusere slike perioder med embryogenese som legging av somitter, embryosegmentering, dannelse av plommesekken, allantois og andre provisoriske organer og vev i ESC-kultur. Dyrkede ESC-er ser ut til å ha frosset i begynnelsen av prosessen med dannelse av 350 restriksjonslinjer av spesialiserte celler. Dermed representerer en klon av datterprogenitorceller og en sentralt lokalisert ESC bare en modell av et embryo, under hvis utvikling forskjellige linjer av spesialiserte celler dannes samtidig i forskjellige vevsregioner, som imidlertid stammer fra felles forløpere. Til tross for det minimale nivået av reseptorer på overflaten av ESC-er, beholder de evnen til å utføre primitive morfogenetiske prosesser, og imiterer de volumetriske strukturene til et tidlig embryo: en suspensjon av ESC-er i kulturaggregater og danner strukturer som ligner blastocyster eller til og med senere embryoer (eggsylindere). Slike suspensjonsaggregater kalles henholdsvis enkle og komplekse embryoide legemer.

Ved blandet differensiering uttrykkes tidlige gener fra ektoderm (oct3, fgf-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogen mesoderm (pkh-2.5), nevralrør (msx3) og hematopoiesen (elkf) samtidig i forskjellige celler i en embryoidkropp. Ved å bruke forskjellige kombinasjoner av vekstfaktorer og cytokiner for målrettet virkning på dannelsen av kimlagsceller in vitro, var det i en rekke tilfeller mulig å oppnå embryoidkropper der ektoderm- eller mesodermgener ble fortrinnsvis uttrykt, noe som åpner veien for modellering av gastrulering og de innledende fasene av organogenesen.

Klonal vekst av ESC-er er bevis på asymmetrisk celledeling, der bare én ESC i sentrum av klonen beholder ubegrenset proliferasjonspotensial, mens den andre dattercellen genererer en generasjon av stamceller som allerede gjennomgår differensiering. Derfor er klonproliferasjonsraten i periferien av embryoidkroppen høyere enn i sentrum. De marginale cellene i den voksende klonen gjennomgår spontan uordnet differensiering, migrerer eller dør ved apoptotiske mekanismer. Disse hendelsene bestemmer klonens skjebne: hvis proliferasjonsraten overstiger migrasjonsraten og apoptotisk celledød, fortsetter klonen å øke i størrelse, stabilisering skjer når apoptoseraten og hastigheten på ny celledannelse er like, og regresjon skjer når forholdet mellom disse prosessene er invers. Stamceller deler seg symmetrisk, dvs. begge dattercellene differensierer deretter til modne spesialiserte cellelinjer. Forholdet mellom ESC-er og stamceller varierer, men antallet ESC-er er alltid bare en brøkdel av en prosent av stamcellepopulasjonen. Derfor kan bare nøye pipettering og rettidig oppdeling av kloner øke antallet ESC-er i kulturen. Disaggregering av kloner på stadiet 10-12 celler viste seg å være mest effektivt for å oppnå maksimalt utbytte av ESC-er. Retningen og graden av differensiering av celler i embryoidkroppen avhenger av deres plassering. De ytre cellene i embryoidkroppen uttrykker ikke oct4-genet og differensieres til celler i den primære endodermen, hvorfra epitellignende celler i parietal og visceral ekstraembryonal endoderm deretter dannes. De indre cellene i embryoidkroppen uttrykker oct4-genet og beholder pluripotens i 48 timer med dyrking. Kulturen blir imidlertid deretter morfologisk omstrukturert til et epitelmonolag, og uttrykket av gener som kontrollerer utviklingen av den primære ektodermen begynner. Deretter begynner prosessen med total uordnet cytodifferensiering med fremveksten av forskjellige celletyper som er derivater av alle tre kimlagene. I prosessen med spontan differensiering av cellene i embryoidkroppen er det først aggregater med endodermmarkører i form av fragmenter (cyster) av plommesekken som dukker opp. Deretter dukker angioblaster og endotelceller fra de voksende kapillærene opp i disse strukturene. I de siste stadiene av spontan differensiering utvikles forskjellige terminalt differensierte celler fra de indre cellene i embryoidkroppen, inkludert nevroner, gliaelementer, kardiomyocytter, makrofager og erytrocytter. Til en viss grad (tatt i betraktning den romlige inversjonen av dannelsen av germinalvevslagene) er det ved hjelp av embryoidkropper mulig å studere morfogenetiske prosesser in vitro og analysere de molekylære mekanismene i de innledende periodene med embryonal cytodifferensiering,samt å etablere rollen til spesifikke gener i implementeringen av disse prosessene.

Innenfor klonen finnes det således celler der ulike genetiske utviklingsprogrammer har blitt oppdaget – ESC-er, tidlige progenitorceller og differensierende progenitorpopulasjoner. Dyrking av ESC-er ved hjelp av hengende dråpe- eller massekulturmetoder uten et materlag og uten å tilsette LIF til mediet fører uunngåelig til dannelsen av embryoide legemer. Morfologien til cellene i de ytre og indre lagene av embryoide legemer er forskjellig. Det ytre laget består av store, forgrenede celler. Overflaten deres som vender mot omgivelsene er dekket av en rekke mikrovilli. Det ytre cellelaget er atskilt fra det indre laget av en basalmembran som ligner Reicherts membran, mens cellene i det indre laget av embryoide legemer er søyleformet epitel. Morfologisk sett ligner det indre laget, selv om det inneholder mange delende celler, mer på udifferensierte kolonier av ESC-er.

Kjennetegn ved menneskelige embryonale stamceller

Fraværet av parenkymatøs-mesenkymale signalinteraksjoner mot bakgrunnen av homeose-genblokkering fører til forstyrret vekst av ESC-er i kultur, siden dette forstyrrer dannelsen og utviklingen av infrastrukturen til provisoriske organer. Uorganisert vekst og forstyrret spontan differensiering av ESC-er i kultur skyldes fraværet av mesenkymal markering av det stromale rammeverket til fremtidige organer: in vitro er det fullt mulig å danne millioner av hepatocytter, men det er umulig å oppnå en enkelt leverlobule som inkluderer slike strukturelle og funksjonelle elementer som bihuler, Disse-rom og Kupffer-celler.

Det antas at pluripotensen til ESC-er utelukkende realiseres i embryogenesen med dannelsen av vev og organer i embryoet, mens morkaken og navlestrengen er derivater av trofoblasten. ESC-er innesluttet i den trofektodermale membranen genererer sekvensielt kloner av provisoriske celler som implementerer utviklingsprogrammet gjennom det kombinatoriske mRNAet til den volumetriske topografiske matrisen til Nokhteyov, som forhåndsbestemmer den romlige arrangementet, formen og størrelsen, antall celler i provisoriske og definitive organer, samt montering av parenkymet i strukturelle og funksjonelle enheter. Samtidig er ESC-er fortsatt den eneste typen celler der den molekylære mekanismen for implementering av deres potenser er fullstendig frakoblet det genetiske utviklingsprogrammet, og ESC-ene selv er fratatt evnen til å samhandle med andre celler på grunn av blokkering av både reseptorpersepsjoner og transsignalsystemer. Imidlertid fører tilstrekkelig aktivering av ESC-er til en trinnvis utvikling av embryogeneseprogrammet, som slutter med fødselen av en fullformet organisme, bestående av milliarder av celler, klar for ekstrauterint liv. På denne kortsiktige, men ufattelig langsiktige veien i cellerommet oppstår det uunngåelig feil både i de molekylære mekanismene som sikrer cellenes vitale aktivitet og i programmene som kontrollerer deres proliferasjon, differensiering og spesialisering. Derfor vurderes sykdommer i molekylstrukturen og sykdommer i celleprogrammering separat i moderne farmakogenomikk. Dessuten er virkningen av de fleste nye legemidler rettet mot å korrigere programmene for differensiering, proliferasjon og organogenese, samt regenerering av organer og vev. I en voksen organisme gjør ESC-er det mulig å kontrollere oppførselen til stam-/progenitorceller transplantert inn i hjernen, leveren, milten, benmargen og andre menneskelige organer for å gjenopprette skadet parenkym i mottakerens organer ved å differensiere og spesialisere donorceller på den bevarte mesenkymale matrisen. I hovedsak begynner totipotensprogrammet å bli realisert på nivået av oocytt-, zygote- og blastomergenomene; disse cellene har imidlertid ennå ikke blitt klonet og transplantert i mengder som er nødvendige for behovene til eksperimentell og praktisk medisin. Derfor forblir ESC-er en unik kilde til genetisk informasjon som inneholder koder for et tredimensjonalt kart over embryoet og koder for lineær restriksjon av spesialiserte cellelinjer under gastrulering.

Det praktisk talt ubegrensede regenerative potensialet til ESC-er skyldes det faktum at genomet deres, i motsetning til det genetiske apparatet til differensierte somatiske celler, beholder pluripotens. En av manifestasjonene av den sovende tilstanden til den genetiske informasjonen som er innebygd i ESC-er er den såkalte minimale fenotypen - et begrenset antall reseptorer uttrykkes på overflaten av ESC-er, og følgelig er svært få transsignaliseringsprogrammer distribuert for samspillet mellom cellens kjerneapparat og dens mikromiljø. Mot bakgrunnen av dvaletilstanden til gener som er ansvarlige for begrensning av spesialiserte cellelinjer og celledifferensiering, aktiveres bare omtrent 30 av 500 gener, hvis produkter sikrer cellens forbindelse med det omkringliggende mikromiljøet. Ved hjelp av metoden for seriell analyse av genuttrykk ble det vist at med det felles arbeidet til de viktigste funksjonelle boksene i genomet som regulerer energi og metabolisme i somatiske celler og ESC-er, har sistnevnte et veldig lavt nivå av mRNA av reseptorer, G-proteiner, sekundære budbringere, transkriptaser, ekspresjons- og undertrykkelseskofaktorer, dvs. hele systemet for transmembran overføring av regulatorisk signal til cellen. Dette skyldes fravær eller svært lav ekspresjon av transsignaliserende gener. I løpet av perioden med indusert differensiering i ESC-genomet slutter 18 fungerende gener synkront å virke mot bakgrunnen av aktivering av 61 transsignaliserende gener som kontrollerer syntesen av celleadhesjonsreseptorer, komponenter i den ekstracellulære matrisen, restriksjonstranskriptaser og budbringerelementer i signaloverføringssystemet til kjerneapparatet fra reseptorene i celleplasmamembranen. Samtidig blokkeres ekspresjonen av gener som er ansvarlige for syntesen av silencerproteiner, samt ko-hemmere av genekspresjon som sikrer totipotensen til ESC-genomet.

Genmarkører er funnet for celler i alle tre kimlagene. Identifisering av det ektodermale cellelaget utføres ved uttrykk av nodal-, oct3- og fgf-5-genene, mesodermceller - ved uttrykk av brachyury- og zeta-globin-genene, endoderm - ved uttrykk av gata-4-genet. Ved normal embryogenese observeres aktiv migrasjon av umodne populasjoner av stam- og progenitorceller i gastrulasjonsperioden, som lokalt markerer utviklingssonene til ansiktsbeina i hodeskallen, noen deler av hjernen, det perifere nervesystemet, hjertets ledningssystem og tymus, hvis vev er dannet fra kloner av migrerende celler. Merking av celler ved hjelp av tidlige gener i kimlagene letter oppgaven med topografisk analyse av migrasjonsprosessene til forløperceller i det utviklende embryoet. Det er spesielt fastslått at i aggregater av P19-embryokarsinomceller begynner uttrykket av det første mesodermgenet brachyury i perioden med redusert uttrykk av genene til vevsplasminogenaktivator, α-fetoprotein, keratin 8 og keratin 19, som er markører for de første migrerende mesodermpopulasjonene. Følgelig begynner dannelsen av vev av mesodermal opprinnelse først etter at prosessen med punktmigrasjon og spredning av mesodermale stamceller er fullført.

Til tross for ekstremt begrensede fenotypiske trekk og fraværet av de fleste transsignaliseringsenheter, uttrykker ESC-er fortsatt noen reseptormolekyler som kan brukes til identifisering av dem. Det er verdt å merke seg at ESC-markørantigener hos mennesker og primater viste seg å være vanlige. Oftest brukes merkede antistoffer mot membranbundne antigenene SSEA-3, SSEA-4 (unike lipidantigener som representerer et kompleks av glykolipid GL7 med sialinsyre), samt høypolymerglykoproteinene TRA-1-81, TRA-1-60 til ESC-merking. I tillegg uttrykker ESC-er det spesifikke embryonale antigenet SSEA-1 og endogen alkalisk fosfatase, samt den spesifikke transkripsjonsfaktoren Oct4. Sistnevnte er nødvendig for å opprettholde mekanismene for ESC-proliferasjon - den spesifikke transkripsjonsfaktoren Oct4 aktiverer uttrykket av fibroblastvekstfaktor 4-genet og stabiliserer uttrykket av boksen med gener som er ansvarlig for ubegrenset DNA-replikasjon i umodne celler. De viktigste intracellulære markørproteinene er Oct3, Oct4, Tcf og Groucho, som er relatert til kromatin-dempingsproteiner.

Nesten umiddelbart etter mange års vellykkede forsøk på å dyrke ESC-er utenfor kroppen, og de første stamcellekulturene isolert fra museblastocyster og kulturer av primære kimceller ble oppnådd. En fase av forskning på det pluripotente potensialet til ESC-er startet da de ble introdusert i embryoer i tidlige utviklingsstadier. Det ble vist at ESC-er i morula- og blastocyststadiene er i stand til å danne kimære embryoer der etterkommere av donor-ESC-er oppdages i alt somatisk vev og til og med i gameter. I utviklingsbiologi ble det dermed etablert en "bro" ved bruk av ESC-er mellom eksperimentelle studier in vivo og in vitro, noe som betydelig utvidet mulighetene for å studere prosessene med å legge primære vev og organer, deres differensiering og embryonale organogenese.

Det er tydelig slått fast at ESC-er in vivo under embryogenesen integreres i cellemassen til det tidlige embryoet, og derivatene deres finnes i alle organer og vev. ESC-er koloniserer en linje av kimceller i det kimære embryoet, hvis etterkommere danner fullverdige egg og sædceller. Embryonale stamceller er klonogene - en enkelt ESC er i stand til å skape en genetisk identisk koloni av celler med molekylære markører, som inkluderer uttrykk av oct4-genet og alkalisk fosfatase, høy telomeraseaktivitet og uttrykk av visse embryonale antigener.

For å studere mekanismene for embryogenese ved bruk av ESC-er, er det utviklet en metode for morula-kimerisering ved å lage en biologisk konstruksjon, utenfor hvilken det er et lag med mottaker-tetraploide blastomerer, og donor-ESC-er introduseres inni. Dermed dannes trofoblasten fra etterkommerne av mottakerens tetraploide blastomerer, noe som sikrer implantasjon og placentasjon, og donor-ESC-er fungerer som en intern cellemasse hvorfra kroppen til et levedyktig embryo og en linje av primære progenitor-kimceller dannes. Forskningsverdien av ESC-er ligger ikke bare i det faktum at pluripotensen bevares under in vitro-manipulasjoner med genomet deres, men også i det faktum at ESC-enes evne til å delta i dannelsen av primære kimceller i et kimært embryo bevares. Det har blitt vist at etterkommerne av bare ett genetisk modifisert ESC befolker alle primære rudimenter og utviklende vev i et kimært embryo oppnådd ved aggregering eller samdyrking av denne cellen med et 8-cellet embryo. Da ESC-er transfektert med genet for grønt fluorescerende protein ble transplantert inn i morulaen hos mus, ble fluorescerende etterkommere av denne cellen funnet i alt studert vev i det utviklende embryoet (Shimada, 1999). Transplantasjon av ESC-er inn i morulaen muliggjør opprettelse av levedyktige mus hvis organisme kun består av etterkommere av donor-ESC-en, noe som åpner for muligheter for ulike alternativer for terapeutisk kloning. Denne metodiske tilnærmingen brukes nå med hell til å studere problemer innen utviklingsbiologi, spesielt brukes den til å analysere mekanismene for genetisk inaktivering av X-kromosomet eller epigenetisk ustabilitet av ESC-er. Transplantasjon av ESC-er inn i et tidlig embryo brukes også i landbruksbioteknologi, så vel som i genterapieksperimenter.

Transplantasjon av genetisk modifiserte ESC-er brukes til å teste målceller for mutante gener. In vitro-dyrkede ESC-er brukes i bioteknologi for å lage knockout-mus. For dette formålet fjernes genet som skal studeres fra ESC-ene ved homolog rekombinasjon (knockout), og celler som mangler dette genet isoleres på selektive medier. Knockout-ESC-er introduseres deretter i blastocysten eller aggregeres med morula-blastomerer. De kimære tidlige embryoene som oppnås på denne måten transplanteres til mottakerhunner, og individer med gameter som er nullizygote for et gitt gen, velges blant de nyfødte musene. Denne teknologien har blitt brukt til å lage mange linjer av knockout-mus, som er mye brukt i eksperimentell biologi og eksperimentell medisin. Slike biologiske modeller brukes til å studere betydningen av visse gener i embryonal utvikling, samt deres rolle i mekanismene for menneskelige sykdommer og patologiske tilstander. I tillegg brukes knockout-dyrelinjer i preklinisk testing av nye genterapimetoder. For eksempel, ved å transfektere det normale allelet til et mutantgen inn i ESC-genomet, er det mulig å effektivt korrigere en mutasjon som påvirker det hematopoietiske systemet. Introduksjon av fremmede gener i ESC-er muliggjør rask etablering av linjer av homozygote transgene forsøksdyr. Det bør imidlertid bemerkes at teknikken med målrettet rekombinasjonsgendelesjon så langt bare har blitt pålitelig utviklet i forhold til mus-ESC-er. Ved bruk av dobbel knockout-mus-ESC-er ble den funksjonelle rollen til genklyngeregionen på kromosom 7 (en kopi av den genomiske regionen på humant kromosom 19) og den proksimale regionen av kromosom 11 (en kopi av humant kromosom 5g) etablert - delesjon av disse genene i mus-ESC-er gjorde det mulig å evaluere funksjonen til deres analoger hos mennesker.

Mulighetene for å studere funksjonen til menneskelige embryogenesegener har utvidet seg, og transfeksjon av disse inn i genomet til ESC-er hos forsøksdyr har gjort det mulig å avklare kryptogenets rolle i dannelsen og utviklingen av det kardiogene mesodermet, pax-6-genet - i øyeembryogenesen. De første kartene over genuttrykk i umodne prolifererende ESC-er av teratokarsinom og blastocyster hos mus blir samlet, og undertrykkende undertrykkelse av transsignalgener i ESC-er er bekreftet. En kombinasjon av 60–80 mutante ESC-er og 20–30 celler fra normale preimplantasjonsmuseembryoer fører til utviklingen av kimære embryoer der organprimordier består av donor- og mottakerceller, noe som gjør det mulig å avklare rollen til ukjente gener i gastrulering og organogenese. Det funksjonelle kartet over gener fra utviklende museembryoer ble supplert med informasjon om rollen til sf-1-genet i dannelsen av binyrene og gonadene, wt-1-genet i dannelsen av nyrene, gener fra myoD-familien i dannelsen av skjelettmuskulatur og gener fra gata-1-4-familien i restriksjonsmodningen av erytropoiese- og lymfopoiese-rudimentene.

Direkte utkobling av maternelle og paternale alleler av gener i ESC-er ved bruk av vektorrekombinaser gjorde det mulig å avklare funksjonene til ulike gener i den tidlige perioden av embryogenesen, og teknologien for direkte overføring av ukjente menneskelige gener til mus-ESC-er bidrar til oppdagelsen av nye mutante gener som er ansvarlige for utviklingen av alvorlig arvelig patologi. Ved hjelp av knockout-metoden ble den obligatoriske betydningen av noen gener for dannelsen av embryonale vev bestemt: gata-4 - for myokardiet, gata-1 - for den erytroide avstamningen av hematopoietisk vev, myoD - for skjelettmuskulatur, brachyury - for mesoderm, restriksjonstranskriptasene hnf3 og hnf4 - for leverstamceller, rag-2 - for dannelsen av T- og B-lymfocyttkloner (Repin, 2001). Dobbel sletting av gener i ESC-er har åpnet tilgang til studiet av den funksjonelle rollen til kimlagsgener, segmentering og homeose, og ESC-transplantasjon har gjort det mulig å oppnå levedyktige interspecies hybridembryoer. Ved å bruke en forbedret teknikk for transplantasjon av en enkelt donor-ESC inn i et 8-cellet embryo, er det bevist at mange organer i mottakerembryoet kimeriseres på cellenivå. Det bør bemerkes at cellespirer av menneskelig vev er funnet i organene til mottakermus etter at humane hematopoietiske stamceller er blitt introdusert i blastocysten. Det er fastslått at pluripotente ESC-er sirkulerer i blodet til museembryoer i løpet av organdannelsesperioden. Det er mulig at deres biologiske funksjon ligger i den embryonale organiseringen av det fremtidige immunsystemet. Ved hjelp av ESC-er er tilstrekkelige modeller av menneskelig genetisk patologi blitt reprodusert under laboratorieforhold: dobbel knockout av dystrofin-genet modellerer Duchenne muskeldystrofi hos mus, og nedstengning av atm-genet (kontroll av kromatinsignalkinasesyntese) - ataksi-telangectasia. I denne dødelige arvelige sykdommen hos barn utvikles degenerasjon av Purkinje-celler i lillehjernen på grunn av defekter i DNA-reparasjon, som er ledsaget av involusjon av tymus på grunn av død av prolifererende celler. Det kliniske bildet, patofysiologien og patomorfologien til ataksi-telangiektasi, reprodusert ved å introdusere patologisk genetisk informasjon i ESC-er, hos kimære mus tilsvarer de hos mennesker. I tillegg til ataksi-telangiektasi, er det ved bruk av ESC-er og knockout-mus utviklet eksperimentelle modeller av noen arvelige homozygote menneskelige sykdommer assosiert med patologi i karbohydrat- og lipidmetabolisme, aminosyrekatabolisme og kobber- og bilirubinutskillelse, noe som har utvidet mulighetene til eksperimentell medisin betydelig i stadiet av preklinisk testing av nye metoder for behandling av de tilsvarende menneskelige sykdommene.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Bruk av stamcelle-cytohybrider

Hybridceller oppnådd ved å fusjonere ESC-er med somatiske celler er en adekvat og lovende modell for å studere pluripotensen til stamceller og omprogrammere kromosomene til differensierte celler. Cytohybrider oppnådd ved å fusjonere ESC-er med differensierte celler fra et voksent dyr gjør det mulig å studere forholdet mellom genomer av ulik "alder": en unik situasjon oppstår når homologe kromosomer som stammer fra celler i forskjellige differensieringsstadier og forskjellige modenhetsgrader befinner seg i samme kjerne, hvor de enkelt kan utveksle trans-virkende regulatoriske signaler. Det er vanskelig å forutsi hvordan de cisregulatoriske epigenetiske systemene til homologe kromosomer, dannet under individuell utvikling, vil reagere på påvirkningen av trans-virkende signaler som kommer fra embryonale relaterte genomer. I tillegg forekommer segregering av foreldrekromosomer i hybridceller, noe som lar oss studere samspillet mellom genomer på nivået av individuelle kromosomer, det vil si potensielt å identifisere deltakelsen til spesifikke kromosomer i å opprettholde pluripotens eller omvendt, utgangen til differensiering.

Cytohybrider oppnådd ved å fusjonere pluripotent teratokarsinom og differensierte somatiske celler ble brukt som den første eksperimentelle modellen for å studere samspillet mellom genomer med forskjellige "utviklingshistorier". I noen tilfeller beholdt slike hybridceller pluripotente egenskaper på et ganske høyt nivå. Spesielt induserte teratokarsinom-somatiske hybridceller in vivo utviklingen av ekte teratomer som inneholdt derivater av alle tre kimlagene, og in vitro i suspensjonskulturer dannet de embryoide legemer. Selv i interspesifikke cytohybrider av denne typen ble tilstedeværelsen av embryonale antigener observert i tilfeller der de somatiske partnerne i fusjonen med teratokarsinomceller var lymfocytter eller tymocytter. Det er verdt å merke seg at cytohybrider dannet ved å fusjonere teratokarsinomceller med fibroblaster tilsvarte fibroblaster i fenotype.

Det viktigste etablerte faktum er at i teratokarsinom-somatiske hybridceller dukket det opp tegn på omprogrammering av det differensierte cellegenomet, som var karakterisert ved reaktivering av enten individuelle gener eller det inaktive X-kromosomet til den somatiske partneren. Resultatene fra studier på cytohybrider av teratokarsinom-somatisk celletype indikerer dermed at pluripotens ofte er bevart i hybridceller, og det er tegn på omprogrammering av det somatiske partnergenomet.

I eksperimenter for å oppnå intraspesifikke embryonale hybridceller ved å fusjonere mus-ESC-er med voksne splenocytter, ble egenskapene til slike cytohybrider studert, segregering av foreldrekromosomer ble analysert, og pluripotensen til hybridgenomet ble vurdert. Intraspesifikke hybridceller oppnådd ved å fusjonere teratokarsinomceller med somatiske celler er vanligvis karakterisert av et lavt nivå av kromosomsegregering med en tetraploid eller nær-tetraploid karyotype. En lignende kromosomal sammensetning ble observert i cytohybrider under fusjon av primære kimceller med lymfocytter. Samtidig viste interspesifikke hybridceller oppnådd ved å fusjonere mus-teratokarsinomceller med minklymfocytter intens segregering av kromosomene til den somatiske partneren.

Et kvalitativt nytt stadium i studiet av segregering av foreldrekromosomer i intraspesifikke hybrider begynte etter utviklingen av en metode for å analysere mikrosatellitter ved hjelp av polymerasekjedereaksjon, takket være hvilken flere hundre markører ble funnet for hvert musekromosom, noe som muliggjør pålitelig diskriminering av ethvert par homologe kromosomer i hybridceller.

Ved å fusjonere ESC-er (HM-1-celler med mangel på hypoksantinfosforibosyltransferaseaktivitet, 2n = 40, XY, isolert fra blastocyster fra 129/01a-mus) med splenocytter fra de kongene DD/c-musene, var det mulig å oppnå et sett med hybridkloner som morfologisk liknet ESC-er. Alle klonene ble isolert på et selektivt medium der bare celler med aktiv hypoksantinfosforibosyltransferase kan vokse. Elektroforetisk analyse viste at alle klonene hadde en allelisk variant av hypoksantinfosforibosyltransferase som er karakteristisk for DD/c-mus. Cytogenetisk analyse viste at tre av de fire hybridklonene hadde et nesten diploid sett med kromosomer. En nesten tetraploid klon inneholdt to populasjoner av hybridceller, hvorav den ene var tetraploid og den andre, mindre, var diploid.

Mikrosatellittanalyse, som tillater å skille mellom et hvilket som helst par homologe kromosomer hos musene 129/01a og DD/c, i hybridkloner med et nesten diploid sett, viste at det i to kloner var en klar preferensiell eliminering av autosomer fra den somatiske partneren. De fleste autosomer i klonene HESS2 og HESS3 hadde markører for 129/01a-linjen, dvs. den pluripotente partneren. Unntaket var kromosom 1 og I: i klonene HESS2 og HESS3, sammen med markører for HM-1-celler, var markører for den somatiske partneren tilstede i små mengder. Slike resultater kan gjenspeile ufullstendig segregering av kromosom 1 og I hos den somatiske partneren og er i samsvar med cytogenetiske data som viser at trisomi for disse kromosomene observeres i 30–40 % av cellene i klonene HESS2 og HESS3. Klon HESS4 skilte seg betydelig ut i sin kromosomale sammensetning: mange autosomer i denne klonen stammet fra ESC-genomet (kromosom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 og 17), men kromosomene 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 og 19 var representert av homologer fra begge foreldrene. Det kvantitative forholdet mellom mikrosatellitter som markerte disse homologe kromosomene var omtrent 1:1. Dette tillot forfatterne å anta at én homolog stammet fra ESC-genomet, og den andre fra differensierte celler. I noen subkloner av klon HESS4 var det bare markører for kromosomene 18 og 19 til den somatiske partneren som var tilstede. De oppnådde resultatene indikerer at i cellene i HESS4-klonen, i tillegg til segregeringen av kromosomene til den somatiske partneren, skjedde eliminering av en eller begge homologene til de ovennevnte kromosomene i det pluripotente genomet, det vil si at det var en bilateral segregering av kromosomene til begge foreldrene - et svært uvanlig fenomen, siden segregering av kromosomene til bare én av foreldrene er karakteristisk for cytohybrider.

I tillegg, etter den 20. passasje, inneholdt alle kloner av hybridceller kun markører for den somatiske partnerens X-kromosom, dvs. at ESC X-kromosomet ble erstattet av den somatiske partnerens X-kromosom i klonene. Dette viktige faktum bekreftes av in situ hybridiseringsdata ved bruk av en FITC-merket probe spesifikk for musens X-kromosom: et positivt signal ble kun detektert på ett kromosom. Det skal bemerkes at i tidligere stadier av dyrking (før den 15. passasje), ifølge cytogenetiske data, inneholdt mange celler to X-kromosomer. Derfor tillater bruk av selektive medier manipulering av den kromosomale sammensetningen av hybridceller og selektivt selektering av kloner som bærer enkeltkromosomer fra den somatiske partneren mot bakgrunnen av ESC-genomet.

Siden et unikt trekk ved cytohybridgenomet er lokaliseringen av foreldregenomene i én cellekjerne, oppstår det naturlig nok spørsmålet om bevaring av de pluripotente egenskapene til det embryonale genomet i ESC-somatiske cellehybrider under forhold med nær kontakt med genomet til en differensiert celle. Morfologisk var cytohybridene av ESC-er og somatiske celler lik den foreldre ESC-linjen. Evaluering av pluripotens viste at alle kloner med et nesten diploid sett med kromosomer var i stand til å danne embryoide legemer i suspensjonskulturer, der derivater av tre kimlag var tilstede.

De fleste hybridcellene inneholdt ECMA-7-antigenet, en markør som er karakteristisk for tidlige museembryoer, og hadde også høy alkalisk fosfataseaktivitet. De mest overbevisende dataene om de høye pluripotente egenskapene til hybridceller ble innhentet i eksperimenter med å oppnå en serie injeksjonskimærer som involverte hybridceller av HESS2-klonen. Analyse av biokjemiske markører viste at etterkommere av donorhybridcellene var tilstede i de fleste vev i kimærene. Derfor beholder hybridceller oppnådd ved å fusjonere ESC-er og somatiske differensierte celler pluripotens på et høyt nivå, inkludert evnen til å danne kimærer når de injiseres i blastocysthulrommet.

Klonene HESS2 og HESS4 skilte seg betydelig ut i sammensetningen av foreldrekromosomene, men hadde lignende pluripotente egenskaper. Det kan antas at pluripotens i hybridgenomet manifesterer seg som et dominant trekk, men det er mulig at ikke alle kromosomer i det embryonale genomet er involvert i prosessen med å opprettholde pluripotens. Hvis denne antagelsen er riktig, kan det forventes at elimineringen av noen kromosomer fra den pluripotente partneren fra genomet til hybridceller ikke vil bli ledsaget av en endring i deres pluripotente status. I dette tilfellet vil analysen av segregering av foreldrekromosomer i embryonale hybridceller tillate oss å nærme oss identifiseringen av kromosomer som er ansvarlige for kontrollen av pluripotensen til embryonale celler.

O. Serov et al. (2001) fant ingen avkom blant 50 avkom oppnådd ved å krysse kimærer med normale mus som hadde 129/01a-musegenotypen og bar X-kromosomet til DD-mus. Forfatterne mener at dette skyldes en reduksjon i pluripotens i hybridceller under påvirkning av det somatiske genomet. En alternativ forklaring kan være den negative effekten av trisomi på noen autosomer og ubalanse i kjønnskromosomer (XXY ble observert i celler frem til 15. passasje) i hybridceller under meiose. Det er kjent at XXY-celler ikke er i stand til å gjennomgå meiose og danne gameter. Trisomi kan også forårsake en reduksjon i den proliferative aktiviteten til hybridceller, noe som resulterer i at den selektive fordelen i utviklingen av kimærer kan tilhøre cellene i mottakerembryoet. Det følger at for en tilstrekkelig vurdering av det pluripotente potensialet til hybridceller, er det nødvendig å oppnå hybridkloner med et normalt diploid sett med kromosomer.

I eksperimentene til O. Serov og medforfattere (2001) ble muligheten for å omprogrammere X-kromosomet til en somatisk celle i genomet til hybridceller demonstrert for første gang. Denne konklusjonen fra forfatterne følger av analysen av uttrykket av hprt-genet (en X-kromosommarkør) i kimærer: tilstedeværelsen av den alleliske varianten av hprt hos DD/c-mus ble påvist i alle analyserte kimære vev. Det er passende å understreke at etter introduksjonen av hybridceller i blastocysthulen, faller cytohybridene inn i ikke-selektive forhold, og bevaringen av X-kromosomet i genomet til hybridceller betyr at det har blitt dets obligate komponent, og genomet skiller det ikke fra Y-kromosomet til den pluripotente partneren.

Forfatterne oppsummerer resultatene av analysen av samspillet mellom somatiske og pluripotente genomer i hybride embryonale celler, og konkluderer med at pluripotens manifesterer seg som et dominant trekk hos noen cytohybrider. Hybridgenomet er i stand til å omprogrammere individuelle kromosomer i differensierte celler, noe som imidlertid ikke utelukker muligheten for en omvendt effekt av det somatiske genomet på pluripotensen til det embryonale genomet. Ved dyrking av hybridceller forekommer induksjon av differensiering betydelig oftere enn i den opprinnelige foreldrelinjen til ESC-ene HM-1. En lignende effekt observeres under dannelsen av primære kolonier: mange primære kolonier av embryonale hybridceller differensierer i tidlige stadier av dannelsen med store tap av kloner under seleksjon og reproduksjon.

Dermed beholder cytohybrider skapt ved fusjon av ESC-er med somatiske celler, til tross for nær kontakt med genomet til differensierte celler, pluripotens som en unik egenskap ved det embryonale genomet. Dessuten er omprogrammering av individuelle kromosomer som stammer fra differensierte celler mulig i slike hybridceller. Det er fortsatt uklart i hvilken grad de pluripotente egenskapene til det embryonale genomet beholdes i hybridceller, spesielt deres evne til å delta i dannelsen av kimærlinjen i kimærer. Dette krever at man får embryonale hybridceller med en normal karyotype. Uansett kan pluripotente embryonale hybridceller bli en reell genetisk modell for å identifisere kromosomer involvert i å opprettholde pluripotens eller kontrollere den, siden bilateral segregering av foreldrekromosomer potensielt gir en slik mulighet.

Ikke mindre attraktivt er studiet av fenomenet som O. Serov et al. (2001) definerer som «kromosomminne». I hybridgenomet finnes homologe kromosomer i to alternative konfigurasjoner: homologer av den somatiske partneren har en gang gjennomgått differensiering, mens i homologer av den pluripotente partneren har denne prosessen bare begynt. Følgelig indikerer bevaringen av høye pluripotente egenskaper hos hybridceller at den «pluripotente» konfigurasjonen av ESC-homologer er tilstrekkelig stabil i hybridgenomet, til tross for påvirkningen av transaksjonsfaktorer som kommer fra den somatiske partneren. De ovennevnte tegnene på omprogrammering av homologe kromosomer i det differensierte genomet under utviklingen av kimærer utelukker ikke muligheten for at de i de første stadiene av dannelse og dyrking av cytohybrider in vitro beholder sin status ervervet under differensiering in vivo. I følge nylig innhentede data, når embryonale hybridceller overføres til et ikke-selektivt miljø, viser de intensiv eliminering av kromosomer fra bare den somatiske partneren, dvs. genomet til hybridceller skiller lett mellom homologer etter in vitro-dyrking i 10–15 passasjer. Dermed representerer embryonale hybridceller en lovende eksperimentell modell for å studere ikke bare en så grunnleggende egenskap ved det embryonale genomet som pluripotens, men også dens alternativ - embryonal differensiering.

Terapeutisk effekt av embryonal stamcelletransplantasjon

Før vi analyserer den terapeutiske effekten av transplantasjon av ESC-er og deres derivater, oppsummerer vi materialet ovenfor. ESC-enes evne til full implementering av embryogenese in vitro er utilstrekkelig, siden utviklingsdefekter i dette tilfellet skyldes fravær av mesenkymale stamceller, som oppstår i kroppen autonomt og uavhengig av ESC-er. Det genetiske potensialet til ESC-er er mindre enn det genetiske potensialet til zygoten, derfor brukes ikke ESC-er direkte til kloning av embryoer. Det unike biologiske potensialet til ESC-er, som de eneste cellene der utviklingsprogrammer er fullt ut distribuert i en konsistent implementering, brukes i studier av genfunksjon. Ved hjelp av ESC-er dekodes de første kombinasjonene av signaler som aktiverer uttrykket av tidlige og sene gener som koder for utviklingen av tre kimlag. Bevaring av pluripotensen til ESC-genomet in vitro gjør dem til et unikt verktøy for reparativ regenerering, i stand til automatisk å etterfylle cellulære tap i tilfelle skade på organer og vev. I et ideelt hypotetisk scenario kan det antas at «... ved transplantasjon av donor-ESC-er overføres kompaktpakkede programmer til mottakerens kropp, som under gunstige forhold realiseres i konstruksjonen av nytt vev»7, som er i stand til «... å integreres effektivt i mottakerens kropp på både morfologisk og funksjonelt nivå.»

Naturligvis, etter utviklingen av metoder for monodifferensiering av ESC-er, startet in vivo-studien av den funksjonelle aktiviteten til celler oppnådd in vitro fra én spesialisert klon. En prolifererende ESC-klon genererer populasjoner av migrerende progenitorceller som virkelig er i stand til aktivt å integrere seg i områder med mottakervevsskade, noe som brukes i regenerativ-plastisk medisin. Det er fastslått at transplantasjon av DOPA-nevroner inn i substantia nigra reduserer kliniske manifestasjoner ved eksperimentell hemiparkinsonisme. Regionale transplantasjoner av donor-nevrale stamceller reduserer graden av motoriske forstyrrelser forårsaket av traumer eller kontusjon av ryggmargen og hjernen. De første positive resultatene av stamcelletransplantasjon ved demyeliniserende sykdommer er også oppnådd. Det ser ut til at det regenerativ-plastiske potensialet til ESC-er åpner ubegrensede muligheter for bruk av celletransplantasjon i praktisk medisin. Men når de transplanteres inn i ektopiske soner, transformeres ESC-er uunngåelig til svulster. Teratomer dannes når ESC-er injiseres subkutant i immunsviktige mus. Når ESC-suspensjoner transplanteres under testikelkapselen hos syngene mus, dannes det også teratomer, som består av forskjellige vev, hvis celler er derivater av alle tre kimlagene. I slike teratomer er prosesser med redusert organogenese ekstremt sjeldne.

En rekke studier gir informasjon om de positive resultatene av transplantasjon av tidlige ESC-derivater til dyr med eksperimentell patologi. Cellulær nevrotransplantasjon ved bruk av ESC-derivater blir videreutviklet i eksperimenter og de første kliniske studiene for å korrigere funksjonelle forstyrrelser i hjerne- og ryggmargsskader, og for å behandle syringomyeli og multippel sklerose (Repin, 2001). Med fremveksten av teknikken med in vitro-nevrogenese fra ESC-er, i stedet for å bruke embryonalt hjernevev, utvikles metoder for transplantasjon av nevrosfærederivater hentet fra embryonale nervevevskulturer. Slike transplantasjonssuspensjoner er betydelig mer homogene og inneholder dedikerte forløpere til nevroner og nevroglia.

Med regelmessig tilsetning av retinsyre i en dose på 10 μg/ml til kulturmediet i 6 uker, dannes mer enn 80 % av postmitotiske nevroner i den menneskelige embryo-(terato)-karsinomlinjen NTERA-2. Fullstendig homogenitet i nevronpopulasjonen oppnås ved flytsortering av modne nevroner merket med immunofenotypiske markører, noe som gjør det mulig å kvitte seg med rester av teratokarsinom og umodne celler. Etter transplantasjon til forskjellige regioner i hjernen hos forsøksdyr, overlever slike nevroner ikke bare, men integreres også i regionale nevrale nettverk. Hos dyr med eksperimentelle modeller av lokale CNS-defekter reduserer nevrotransplantasjon de kliniske manifestasjonene av slike menneskelige patologier som konsekvensene av traumatisk hjerneskade, hjerneslag, demyeliniserende sykdommer, arvelige defekter i utviklingen av lillehjernen, sykdommer i lipid- og polysakkaridavsetning.

For å optimalisere regenereringsprosesser ved degenerative sykdommer i sentralnervesystemet utvikles teknologier for å utvinne myelinproduserende oligodendrocytter fra ESC-er. Det første stadiet inkluderer tradisjonelt proliferasjon av ESC-er med reproduksjon av antall celler som kreves for transplantasjon. I det andre stadiet utføres målrettet differensiering av celler til en populasjon av myelinproduserende oligodendrocyttforløpere, som kontrolleres av selektive markørantigener.

Det åpner seg visse muligheter for bruk av ESC-derivater for utvikling av metoder for å korrigere immunsvikt forårsaket av genetiske defekter i tymusmodningen. I studier på knockout-mus (rag 1) med en indusert gendefekt – en forstyrrelse av rekombinasjonsmekanismen til V(D)J-loci i TCR-gener, som fører til tap av T-lymfocyttfunksjon – gjenoppretter transplantasjon av tidlige ESC-derivater inn i tymus hos dyr modningen av normale populasjoner av immunkloner som er ansvarlige for cellulær immunitet. Kliniske studier av transplantasjon av in vitro-preformede ESC-er for behandling av dødelige arvelige anemier hos barn er i gang.

Innvendinger mot rask introduksjon av stamcelletransplantasjon i klinikken er basert på det begrensede antallet stabile linjer av humane embryonale stamceller og behovet for standardisering av disse. For å øke renheten til standardiserte ESC-linjer, så vel som voksne humane stamceller, foreslås det å bruke en metode for linjeseleksjon basert på molekylærgenetisk analyse av korte tandem-DNA-repetisjoner. Det er også nødvendig å teste ESC-linjer for tilstedeværelsen av små kromosomale omorganiseringer og genetiske mutasjoner, som potensialet for å forekomme under cellekulturforhold er ganske høyt. Det fremsettes en tese om obligatorisk testing av egenskapene til alle typer ESC-er og regionale pluripotente stamceller, siden deres reproduksjon in vitro kan føre til fremveksten av nye egenskaper som ikke er iboende i embryonale stamceller eller definitive vev. Spesielt antas det at langvarig dyrking i medier med cytokiner bringer ESC-linjer nærmere tumorceller, siden de gjennomgår lignende endringer i cellesyklusreguleringsveiene med tilegnelsen av evnen til å utføre et ubegrenset antall celledelinger. Noen forfattere, basert på potensialet for tumorutvikling, anser transplantasjon av tidlige embryonale stamcellederivater til mennesker som hensynsløs. Etter deres mening er det mye tryggere å bruke dedikerte etterkommere av ESC-er, dvs. linjer av differensierte celleprogenitorer. Imidlertid er det for øyeblikket ikke utviklet en pålitelig teknikk for å oppnå stabile humane cellelinjer som differensierer i ønsket retning.

Dermed dukker det opp stadig flere data i litteraturen om den positive terapeutiske effekten av transplantasjon av humane embryonale stamcellederivater. Imidlertid blir mange av disse studiene gjennomgått og kritisert. Noen forskere mener at resultatene fra tidlige kliniske studier er foreløpige og bare indikerer at stamceller er i stand til å ha en gunstig effekt på det kliniske forløpet av en bestemt sykdom. Derfor er det nødvendig å innhente data om de fjerne resultatene av celletransplantasjon. Utviklingsstadiene i klinisk nevrotransplantasjon trekkes frem som et argument. Faktisk var det i begynnelsen publikasjoner om den høye effektiviteten av transplantasjon av embryonale hjernefragmenter ved Parkinsons sykdom som var rådende i litteraturen, men deretter begynte det å dukke opp rapporter som benektet den terapeutiske effektiviteten av embryonalt eller føtalt nervevev transplantert inn i hjernen til pasienter.

De første kliniske studiene ble utført for å vurdere sikkerheten ved transplantasjon av nevroblaster avledet fra NTERA-2 teratokarsinom-ESC-er, hvor umodne celler ble utsatt for proliferasjon i kultur inntil akkumulering av 100 millioner cellemasse. Noen av cellene som ble oppnådd på denne måten ble brukt til å karakterisere fenotypen og bestemme cellulære urenheter, samt for å teste for mulig kontaminering med virus og bakterier. LIF og materlaget av føtale stromale celler ble fjernet fra kulturmediet, og det ble skapt forhold for målrettet differensiering av ESC-er til nevroblaster ved bruk av en kombinasjon av cytokiner og vekstfaktorer. Deretter ble nevroblastene renset fra umodne teratokarsinomceller på en flowcellesorterer. Etter sekundær rensing og fenotypekarakterisering av transplanterte celler ble en suspensjon av nevroblaster (10–12 millioner) injisert i basalkjernen i pasientenes hjerne (i den syvende måneden etter hemoragisk hjerneslag) ved bruk av en spesiell mikrokanyle og sprøyte under stereotaksisk og computertomografisk kontroll. Ett års screening etter transplantasjon av konsekvensene av nevrontransplantasjon i slagsonen avdekket ingen bivirkninger eller uønskede effekter. Halvparten av pasientene viste forbedring i motorisk funksjon i perioden fra 6 til 12 måneder etter transplantasjon. Positive kliniske endringer ble ledsaget av økt blodtilførsel til slagsonen etter celletransplantasjon: den gjennomsnittlige økningen i absorpsjonen av fluorescensmerket 2-deoksyglukose, ifølge positronemisjonstomografi, nådde 18 %, og hos noen pasienter - 35 %.

De amerikanske National Institutes of Health har imidlertid gjennomført en uavhengig studie av den kliniske effektiviteten av nevrotransplantasjon hos pasienter med Parkinsonisme. Pasientene i den første gruppen ble transplantert med deler av embryonalt nervevev som produserer dopamin, mens den andre pasientgruppen gjennomgikk en simulert operasjon. Resultatene indikerer null klinisk effektivitet av slik nevrotransplantasjon, til tross for at dopaminproduserende embryonale nevroner overlevde i mottakernes hjerner. Dessuten utviklet 15 % av pasientene vedvarende dyskinesi to år etter transplantasjonen av embryonalt nervevev, noe som var fraværende hos pasienter i placebogruppen (Stamceller: vitenskapelig fremgang og fremtidige forskningsretninger. Nat. Inst, of Health. USA). Observasjoner av videre utvikling av sykdommen hos disse pasientene pågår.

Noen forfattere forbinder de motstridende litteraturdataene om vurdering av den kliniske effektiviteten av nevrotransplantasjon med ulike tilnærminger til valg av pasientgrupper, utilstrekkelig valg av metoder for objektiv vurdering av tilstanden deres, og, viktigst av alt, ulike utviklingsperioder av embryonalt nervevev og ulike områder av hjernen som dette vevet ble hentet fra, ulike transplantasjonsstørrelser og metodologiske trekk ved kirurgisk inngrep.

Det bør bemerkes at forsøk på direkte transplantasjon av pluripotente embryonale stamceller inn i striatumregionen i hjernen hos rotter med eksperimentell hemiparkinsonisme ble ledsaget av proliferasjon av ESC-er og deres differensiering til dopaminerge nevroner. Det bør antas at nydannede nevroner ble effektivt integrert i nevrale nettverk, siden det etter ESC-transplantasjon ble observert korreksjon av atferdsavvik og motorisk asymmetri i apomorfintesten. Samtidig døde noen dyr på grunn av transformasjonen av transplanterte ESC-er til hjernesvulster.

Eksperter fra de nasjonale og medisinske akademiene i USA, spesialister fra National Institute of Health i USA mener at det kliniske potensialet til ESC-er fortjener den mest seriøse oppmerksomheten, men insisterer på behovet for en detaljert studie av deres egenskaper, sannsynligheten for komplikasjoner og langsiktige konsekvenser i eksperimenter på adekvate biologiske modeller av menneskelige sykdommer (Stamceller og fremtidens regenerative medisin National Academy Press.; Stamceller og fremtidige forskningsretninger. Nat. Inst, of Health USA).

Fra dette synspunktet er det viktig at en komparativ histologisk analyse av eksperimentelle teratomer oppnådd ved transplantasjon av ESC-suspensjon inn i testiklene med teratomer dannet som et resultat av transplantasjon av et tidlig embryo, som også inneholder ESC, viste at ESC, uavhengig av opprinnelseskilde eller interaksjon med visse omkringliggende celler, implementerer sitt tumorigeniske potensial på samme måte. Det er bevist at slike teratomer har en klonal opprinnelse, siden svulster bestående av derivater av alle tre kimlagene kan oppstå fra én ESC (Rega, 2001). Det er verdt å merke seg at da klonede ESC-er med normal karyotype ble transplantert inn i immunsviktige mus, ble det også dannet teratomer bestående av forskjellige typer differensierte somatiske celler. Disse eksperimentelle dataene er et upåklagelig bevis på den klonale opprinnelsen til teratomer. Fra et utviklingsbiologisk synspunkt indikerer de at det ikke er flere engasjerte progenitorceller, men en enkelt pluripotent stamcelle som fungerer som en kilde til differensierte derivater av alle tre kimlagene som utgjør et teratom. På veien til praktisk celletransplantasjon er imidlertid resultatene av disse studiene, om ikke avskrekkende, så et varseltegn på potensiell fare, ettersom inokulering av ESC-er eller primordiale kimceller i forskjellige vev hos voksne immunsviktige mus uunngåelig forårsaker utvikling av svulster fra transplanterte stamceller. Neoplastisk degenerasjon av ektopisk transplanterte ESC-er ledsages av fremveksten av satellittpopulasjoner av differensierte celler - på grunn av delvis differensiering av ESC-er og progenitorkloner til spesialiserte linjer. Interessant nok, når ESC-er transplanteres inn i skjelettmuskulatur, dannes nevroner oftest ved siden av teratokarsinomceller. Innføring av ESC-er i et delende egg eller blastocyst ledsages imidlertid av fullstendig integrering av cellene i embryoet uten dannelse av neoplastiske elementer. I dette tilfellet integreres ESC-er i praktisk talt alle organer og vev i embryoet, inkludert genital primordium. Slike allofene dyr ble først oppnådd ved å introdusere teratokarsinom 129-celler i tidlige embryoer i 8-100-cellestadiene. Hos allofene mus integreres populasjoner av heterogene celler avledet fra donor-ESC-er i vev i benmarg, tarm, hud, lever og kjønnsorganer, noe som gjør det mulig å lage jevne interart-cellekimærer i eksperimentet. Jo kortere utviklingsperioden til det tidlige embryoet er, desto høyere er prosentandelen av cellekimærisering, med den høyeste graden av kimærisering observert i det hematopoietiske systemet, huden, nervesystemet, leveren og tynntarmen til allofene embryoet. I en voksen organisme er vev beskyttet mot mottakerens immunsystem av histohematiske barrierer utsatt for kimærisering:Transplantasjon av primære kimceller inn i testikkelparenkymet ledsages av inkorporering av donorstamceller i mottakerens kimvevslag. Ved transplantasjon av ESC-er inn i en blastocyst forekommer imidlertid ikke dannelsen av kimære rudimenter av kjønnsorganene med generering av donorprimære kimceller. Pluripotensen til ESC-er, når spesielle forhold skapes, kan også brukes til kloning: transplantasjon av mus-ESC-er inn i et 8-16-cellers museembryo, der cellulære mitoser blokkeres av cytokalsin, fremmer implementeringen av normal embryogenese med utvikling av et embryo fra donor-ESC-er.

Derfor er et alternativ til allogen ESC-transplantasjon terapeutisk kloning basert på transplantasjon av somatiske cellekjerner inn i et enukleert egg for å lage en blastocyst, fra den indre cellemassen hvorfra linjer av ESC-er som er genetisk identiske med donoren av den somatiske kjernen, deretter isoleres. Teknisk sett er denne ideen ganske gjennomførbar, siden muligheten for å lage ESC-linjer fra blastocyster oppnådd etter transplantasjon av somatiske kjerner inn i enukleerte egg gjentatte ganger har blitt bevist i forsøk på forsøksdyr (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Spesielt hos mus som var homozygote for rag2-genmutasjonen, ble fibroblaster oppnådd ved dyrking av subepidermale vevsceller brukt som donorer av kjerner, som ble transplantert inn i enukleerte oocytter. Etter oocyttaktivering ble "zygoten" dyrket inntil blastocystdannelse, fra den indre cellemassen hvorfra ESC-er ble isolert og overført til en linje av celler som var nullizygote for det mutante genet (rag2~/~). Mutasjonen av ett allelgen ble korrigert i slike ESC-er ved hjelp av homolog rekombinasjon. I den første serien med eksperimenter ble embryoide legemer oppnådd fra ESC-er med et rekombinant restaurert gen, cellene deres ble transfektert med et rekombinant retrovirus (HoxB4i/GFP) og, etter reproduksjon, injisert i venen til rag2~/~-mus. I den andre serien ble tetraploide blastomerer aggregert med genetisk modifiserte ESC-er og transplantert til mottakerhunner. De resulterende immunkompetente musene fungerte som benmargsdonorer for transplantasjon til rag2~/~-mutantmus. I begge seriene var resultatet positivt: etter 3–4 uker ble modne normale myeloide og lymfoide celler som var i stand til å produsere immunglobuliner funnet i alle mus. Dermed kan transplantasjon av somatiske cellekjerner til oocytter ikke bare brukes til å oppnå ESC-linjer, men også til cytogenoterapi – korrigering av arvelige anomalier, ved bruk av ESC som en vektor for transport av korrigerende genetisk informasjon. Men denne retningen for celletransplantasjon, i tillegg til bioetiske problemer, har sine begrensninger. Det er uklart hvor trygg transplantasjon av terapeutisk klonede celler med en genotype identisk med genotypen til en spesifikk pasient vil være, siden slike celler kan introdusere mutasjoner som skaper en predisposisjon for andre sykdommer. Normale menneskeegg er fortsatt et vanskelig tilgjengelig objekt, mens selv med transplantasjon av somatiske kjerner til enukleerte dyreegg, utvikler bare 15–25 % av de konstruerte "zygotene" seg til blastocyststadiet. Det er ennå ikke bestemt hvor mange blastocyster som kreves for å oppnå én linje med pluripotente klonede ESC-er. Det er også verdt å merke seg de høye økonomiske kostnadene forbundet med kompleksiteten til den terapeutiske kloningsmetoden.

Avslutningsvis bør det bemerkes at i ESC-er kombineres genomets pluripotens med hypometylert DNA med høy telomeraseaktivitet og en kort C^-fase av cellesyklusen, noe som sikrer deres intensive og potensielt uendelige reproduksjon, der ESC-er beholder et diploid sett med kromosomer og et "juvenilt" sett med fenotypiske egenskaper. Klonal vekst av ESC-er i kultur forstyrrer ikke deres differensiering til noen spesialiserte cellelinjer i organismen når proliferasjonen stoppes og passende regulatoriske signaler legges til. Restriksjonsdifferensiering av ESC-er til somatiske cellelinjer in vitro realiseres uten deltakelse av mesenkymet, omgås Nochteys, utenfor organogenesen og uten embryodannelse. Ektopisk introduksjon av ESC-er in vivo fører uunngåelig til dannelse av teratokarsinomer. Transplantasjon av ESC-er til en blastocyst eller et tidlig embryo ledsages av deres integrering med embryonale vev og stabil kimerisering av organene.

Regenerativ-plastisk teknologi basert på celletransplantasjon er skjæringspunktet mellom interessene til representanter fra cellebiologi, utviklingsbiologi, eksperimentell genetikk, immunologi, nevrologi, kardiologi, hematologi og mange andre grener av eksperimentell og praktisk medisin. De viktigste resultatene fra eksperimentelle studier beviser muligheten for å omprogrammere stamceller med en målrettet endring i deres egenskaper, noe som åpner for muligheter for å kontrollere cytodifferensieringsprosessene ved hjelp av vekstfaktorer - for myokardregenerering, restaurering av CNS-lesjoner og normalisering av funksjonen til øyapparatet i bukspyttkjertelen. For den utbredte introduksjonen av transplantasjon av ESC-derivater i praktisk medisin er det imidlertid nødvendig å studere egenskapene til menneskelige stamceller mer detaljert og fortsette eksperimenter med ESC-er på eksperimentelle sykdomsmodeller.

Bioetiske problemstillinger og problemet med avstøting av en allogen celletransplantasjon kan løses ved å oppdage plastisiteten til genomet til regionale stamceller fra en voksen organisme. Imidlertid blir den første informasjonen om at når isolerte og nøye karakteriserte hematopoietiske autologe celler transplanteres inn i leveren, hvorfra nye hepatocytter utledes og integreres i leverlobulene, nå revidert og kritisert. Likevel er det publisert data som viser at transplantasjon av nevrale stamceller inn i thymus forårsaker dannelse av nye donor T- og B-lymfocyttspirer, og transplantasjon av nevrale stamceller fra hjernen inn i benmargen fører til dannelse av hematopoietiske spirer med langvarig donor myelo- og erytropoiese. Følgelig kan pluripotente stamceller som er i stand til å omprogrammere genomet til potensialet til ESC-er, vedvare i organene til en voksen organisme.

Kilden til å oppnå ESC for medisinske formål er fortsatt det menneskelige embryoet, noe som forutbestemmer det uunngåelige nye skjæringspunktet mellom moralske, etiske, juridiske og religiøse spørsmål ved menneskelivets opprinnelse. Oppdagelsen av ESC har gitt en kraftig drivkraft til gjenopptakelsen av tøffe diskusjoner om hvor grensen går mellom levende celler og materie, vesen og personlighet. Samtidig finnes det ingen universelle normer, regler og lover angående bruk av ESC i medisin, til tross for gjentatte forsøk på å skape og ta dem i bruk. Hver stat løser dette problemet uavhengig innenfor rammen av sin lovgivning. Leger over hele verden fortsetter på sin side å prøve å ta regenerativ-plastisk medisin utover omfanget av slike diskusjoner, først og fremst gjennom bruk av voksne stamcellereserver i stedet for embryonale stamceller.

Litt historie om isolering av embryonale stamceller

Terato(embryo)karsinomceller ble isolert fra spontant forekommende testikkelteratomer hos 129/ter-Sv-mus, spontane ovarielteratomer hos Lt/Sv-mus og fra teratomer avledet fra ektopisk transplanterte embryonale celler eller vev. Blant de stabile museterato(embryo)karsinomcellelinjene som ble oppnådd på denne måten, var noen pluripotente, andre differensierte bare til én spesifikk celletype, og noen var fullstendig ute av stand til cytodifferensiering.

På et tidspunkt var fokuset på studier der resultatene indikerte muligheten for å føre terato-(embryo)-karsinomceller tilbake til en normal fenotype etter at de ble introdusert i vevet til et utviklende embryo, samt arbeid med in vitro-oppretting av genetisk modifiserte terato-(embryo)-karsinomceller, ved hjelp av hvilke mutante mus ble oppnådd for biologisk modellering av menneskelig arvelig patologi.

Betinget suspensjonsdyrking ble brukt til å isolere terato-(embryo)-karsinomcellelinjer. I kultur vokser terato-(embryo)-karsinomceller, i likhet med ESC-er, til å danne embryoide legemer og krever obligatorisk dissosiasjon for linjeoverføring, opprettholder pluripotens på et materlag av embryonale fibroblaster eller under suspensjonsdyrking i et kondisjonert medium. Celler av pluripotente terato-(embryo)-karsinomlinjer er store, sfæriske, karakterisert ved høy alkalisk fosfataseaktivitet, danner aggregater og er i stand til multidireksjonell differensiering. Når de introduseres i en blastocyst, aggregerer de med morulaen, noe som fører til dannelsen av kimære embryoer, i sammensetningen av forskjellige organer og vev hvorav derivater av terato-(embryo)-karsinomceller finnes. Imidlertid dør det overveldende flertallet av slike kimære embryoer i livmoren, og i organene til overlevende nyfødte kimærer oppdages fremmede celler sjelden og med lav tetthet. Samtidig øker forekomsten av svulster (fibrosarkom, rabdomyosarkom, andre typer ondartede svulster og bukspyttkjerteladenom) kraftig, og svulstdegenerasjon forekommer ofte i perioden med intrauterin utvikling av kimære embryoer.

De fleste terato-(embryo)-karsinomceller i mikromiljøet til normale embryonale celler får nesten naturlig ondartede neoplastiske egenskaper. Det antas at irreversibel malignitet skyldes aktivering av proto-onkogener i prosessen med strukturelle omorganiseringer. Et av unntakene er celler av embryokarsinomlinjen SST3, oppnådd fra testikelteratomer hos mus (linje 129/Sv-ter), som viser en høy evne til å integreres i vev og organer i embryoet uten påfølgende tumordannelse hos kimære mus. Derivater av terato-(embryo)-karsinomcellelinjer hos kimære mus deltar praktisk talt ikke i dannelsen av primære gonocytter. Tilsynelatende skyldes dette den høye frekvensen av kromosomavvik som er karakteristiske for de fleste terato-(embryo)-karsinomlinjer, i cellene der både aneuploidi og kromosomavvik observeres.

Flere stabile linjer av humane terato-(embryo)-karsinomceller karakterisert ved pluripotens, høy proliferativ aktivitet og evne til å differensiere under vekst i kulturer ble oppnådd under laboratorieforhold. Spesielt ble linjen av humane terato-(embryo)-karsinomceller NTERA-2 brukt til å studere mekanismene for nevral cytodifferensiering. Etter transplantasjon av celler fra denne linjen inn i den subventrikulære regionen av forhjernen hos nyfødte rotter, ble deres migrasjon og nevrogenese observert. Det ble til og med gjort forsøk på å transplantere nevroner oppnådd ved å dyrke celler fra terato-(embryo)-karsinomlinjen NTERA-2 til pasienter med hjerneslag, noe som ifølge forfatterne førte til en forbedring av sykdommens kliniske forløp. Samtidig var det ingen tilfeller av malignitet av transplanterte celler fra terato-(embryo)-karsinomlinjen NTERA-2 hos pasienter med hjerneslag.

De første linjene med udifferensierte pluripotente embryonale stamceller fra mus ble fremskaffet tidlig på 1980-tallet av Evans og Martin, som isolerte dem fra blastocystens indre cellemasse – embryoblasten. De isolerte ESC-linjene beholdt pluripotens og evnen til å differensiere til ulike celletyper under påvirkning av faktorer i et spesielt kulturmedium over lang tid.

Begrepet «embryonal pluripotent stamcelle» tilhører Leroy Stevens, som, mens han studerte effekten av tobakktjære på forekomsten av tumorutvikling, trakk oppmerksomhet til den spontane forekomsten av testikkelteratokarsinom hos lineære (129/v) mus i kontrollgruppen. Cellene i testikkelteratokarsinomer ble karakterisert av en høy proliferasjonsrate, og i nærvær av væske fra bukhulen differensierte de spontant med dannelse av nevroner, keratinocytter, kondrocytter, kardiomyocytter, samt hår- og beinfragmenter, men uten tegn til ordnet cytoarkitektur av det tilsvarende vevet. Når de ble plassert i kultur, vokste teratokarsinomceller som pluripotente kloner som ikke var festet til substratet og dannet embryoide legemer, hvoretter de sluttet å dele seg og gjennomgikk spontan uordnet differensiering til nevroner, gliaceller, muskelceller og kardiomyocytter. Stevens fant at museteratokarsinom 129/v inneholder mindre enn 1 % celler som er i stand til å differensiere til en rekke spesialiserte somatiske linjer, og selve differensieringen avhenger av faktorene som påvirker dem (sammensetningen av peritonealvæsken, produkter fra modne celler eller vev tilsatt kulturen). Leroy Stevensons hypotese om tilstedeværelsen av embryonale stamceller fra kimlinjen blant teratokarsinomceller ble bekreftet: en suspensjon av embryoblastceller fra preimplantasjonsembryoer i vev hos voksne mus dannet teratokarsinomer, og rene cellelinjer isolert fra dem etter intraperitoneal administrering til mottakerdyr differensierte til nevroner, kardiomyocytter og andre somatiske celler avledet fra alle tre kimlagene. I in vivo-eksperimenter resulterte transplantasjon av ESC-er (hentet fra embryoblasten, men ikke trofoblasten) til museembryoer fra en annen linje i blastomerstadiene 8–32 i fødselen av kimære dyr (uten utvikling av svulster), i hvis organer det ble funnet spirer av donorvev. Kimærisme ble observert selv i kimcellelinjen.

Primære progenitor-kimceller isolert fra genitalrudimentet til et museembryo samsvarte i morfologi, immunologisk fenotype og funksjonelle egenskaper med ESC-er oppnådd av Stevenson fra teratokarsinom og embryoblast. I kimærer født etter at ESC-er ble introdusert i en blastocyst, ble allofenmorfogenese av organer karakterisert av en mosaikkveksling av donor- og mottakerstrukturer og -funksjoner i lever, lunger og nyrer. I noen tilfeller ble dannelsen av tarmkrypter eller leverlobuler bestående av både mottaker- og donorceller observert. Morfogenese ble imidlertid alltid realisert i henhold til det genetiske programmet til arten som mottakeren tilhørte, og kimærisme var begrenset utelukkende til cellenivå.

Det ble deretter slått fast at proliferasjon av ESC-er uten cytodifferensiering på et materlag av mesenkym-avledede celler (føtale fibroblaster) skjer med obligatorisk tilstedeværelse av LIF i selektive næringsmedier, som selektivt sikrer overlevelse av kun stam- og progenitorceller, mens det overveldende flertallet av spesialiserte cellulære elementer dør. Ved hjelp av slike metoder isolerte James Thomson i 1998 fem udødelige linjer av embryonale stamceller fra den indre cellemassen til en menneskelig blastocyst. Samme år utviklet John Gerhart en metode for å isolere udødelige ESC-linjer fra genital tuberkel av fire til fem uker gamle menneskelige embryoer. På grunn av deres unike egenskaper, bare to år senere, begynte embryonale stamceller og stamceller fra definitive vev å bli brukt i praksisen med regenerativ medisin og genterapi.