Laboratoriediagnostikk av tuberkulose

Tuberkulose er en sykdom som er lett å diagnostisere under moderne forhold og vitenskapelige bragder. Laboratoriediagnostikk av tuberkulose inntar en sentral plass blant andre diagnostiske metoder, nest etter røntgenundersøkelsesmetoder.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinisk blodprøve

Hos pasienter med tuberkulose er endringer i den generelle blodprøven ikke patognomoniske. Ved begrensede og lavaktive former for tuberkulose er hypokromi av erytrocytter med et normalt antall karakteristisk. Ved massive infiltrater eller kaeøs lungebetennelse, med utbredt kaeøs lymfadenitt, spesifikk tarmskade, samt ved store lunge- eller postoperative blødninger, observeres erytropeni og mikrocytose, oligokromasi og polykromasi. Makrocytose, og spesielt poikilocytose, forekommer mye sjeldnere, vanligvis ved alvorlig anemi. Antallet retikulocytter i det kompenserte stadiet av tuberkulose varierer fra 0,1 til 0,6 %, i det subkompenserte stadiet - fra 0,6 til 1,0 %, og for det dekompenserte stadiet er 1 % av retikulocyttene karakteristisk.

I noen tilfeller av tuberkulose kan moderat leukocytose (opptil 15 tusen leukocytter) observeres, sjeldnere leukopeni, som forekommer i 2-7% av tilfellene hos pasienter med begrensede og milde former av prosessen og i 12,5% ved destruktiv og progressiv lungetuberkulose.

Oftest forekommer endringer i leukocyttformelen. Både relativ og absolutt nøytrofili observeres, et moderat skifte i leukocyttformelen til venstre mot promyelocytter. Myelocytter forekommer svært sjelden ved ukomplisert tuberkulose. En økning i antall nøytrofiler med patologisk granularitet i hemogrammet til en pasient med tuberkulose indikerer alltid prosessens varighet: hos pasienter med alvorlig tuberkulose inneholder nesten alle nøytrofiler patologisk granularitet. Når et tuberkuloseutbrudd avtar, går kjerneforskyvningen tilbake til normalen relativt raskt. Patologisk granularitet av nøytrofiler vedvarer vanligvis lenger enn andre endringer i hemogrammet.

Innholdet av eosinofiler i perifert blod varierer også avhengig av prosessens fase og organismens allergiske tilstand. Antallet deres synker til aneosinofili ved alvorlige og langvarige utbrudd av sykdommen, og omvendt øker det under resorpsjon av infiltrater og pleuraeffusjon, samt ved tidlige former for primær tuberkulose.

De fleste former for primær tuberkulose er ledsaget av lymfopeni, som noen ganger observeres i flere år selv etter arrdannelse av spesifikke forandringer. Sekundær tuberkulose i den akutte fasen, avhengig av alvorlighetsgraden av prosessen, kan være ledsaget av enten et normalt antall lymfocytter eller lymfopeni.

Blant testene for å vurdere tuberkuloseprosessen inntar bestemmelsen av erytrocyttsedimentasjonshastighet (ESR) en spesiell plass, som er viktig for å vurdere forløpet av tuberkuloseprosessen og identifisere dens aktive former. En økning i ESR indikerer tilstedeværelsen av en patologisk prosess (infeksiøs og inflammatorisk, purulent, septisk, hemoblastose, lymfogranulomatose, etc.) og fungerer som en indikator på dens alvorlighetsgrad, men normale ESR-verdier indikerer ikke alltid fravær av patologi. Akselerasjon av erytrocyttsedimentasjon lettes av en økning i innholdet av globuliner, fibrinogen, kolesterol i blodet og en reduksjon i blodets viskositet. Nedbremsing av erytrocyttsedimentasjon er karakteristisk for tilstander ledsaget av hemokonsentrasjon, en økning i innholdet av albuminer og gallesyrer.

Hemogrammet til tuberkulosepasienter endres under behandlingen. Jo mer vellykket den terapeutiske intervensjonen er, desto raskere forsvinner de hematologiske endringene. Samtidig bør man ta hensyn til effekten av ulike antibakterielle legemidler på hematopoiesen. De forårsaker ofte eosinofili, i noen tilfeller leukocytose, og oftere leukopeni opp til agranulocytose og lymfoid-retikulær reaksjon. Systematisk hematologisk overvåking og korrekt analyse av innhentede data er avgjørende for å vurdere pasientens kliniske tilstand, prosessens dynamikk og behandlingens effektivitet.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinisk urinanalyse

Ved urinveistuberkulose er urinanalyse den viktigste laboratoriediagnostiske metoden. Leukocyturi, erytrocyturi, proteinuri, hypoisostenuri, tuberkuløs mykobakteriuri og uspesifikk bakteriuri kan observeres.

Leukocyturi er det vanligste symptomet på urinveistuberkulose før spesifikk cellegiftbehandling og er kun fraværende i unntakstilfeller, som for eksempel fullstendig utslettelse av urinlederlumen. Nechiporenkos test (bestemmelse av antall leukocytter i 1 ml urin) bidrar til å vurdere graden av leukocyturi ved nefrotuberkulose mer objektivt, og i noen tilfeller å oppdage den med en normal generell urinanalyse. Det bør imidlertid tas i betraktning at leukocyturi kan forekomme ved akutt og kronisk pyelonefritt, blærekatarr, uretritt, nyrestein og urinledere.

Erytrocyturi, i likhet med leukocyturi, regnes som et av de vanligste laboratorietegnene på urogenital tuberkulose. Hyppigheten av hematuri avhenger av prosessens forekomst; den øker etter hvert som den destruktive tuberkuløse prosessen i nyren utvikler seg. Erytrocyturi uten leukocyturi er mer typisk for de tidlige stadiene av nyretuberkulose. Hematuri, som er mer fremtredende enn leukocyturi, er et viktig argument for nyretuberkulose når man skal differensiere den fra uspesifikk pyelonefritt.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokjemisk blodprøve

Ved tuberkulose avhenger endringer i noen biokjemiske indekser først og fremst av prosessens fase, komplikasjoner og ulike samtidige sykdommer. Hos pasienter med inaktiv tuberkulose i lungene og andre organer endres ikke det totale proteinet og proteinfraksjonene i blodserumet, og dette bestemmer deres normale innhold.

Ved akutte former av sykdommen, så vel som ved forverring og progresjon av kroniske former for tuberkulose, reduseres albumin-globulin-koeffisienten.

Av vesentlig betydning for å vurdere funksjonell tilstand og organisk skade på leveren ved tuberkulose og dens komplikasjoner er bestemmelse av direkte og total bilirubin, aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT) i blodserumet. Dynamisk bestemmelse av nivået av aminotransferaser. Bilirubin i behandlingen av pasienter med tuberkulose, spesielt i alvorlige former, er en obligatorisk del av den biokjemiske undersøkelsen av pasienter med tuberkulose og utføres månedlig.

Evaluering av nyrenes funksjonelle tilstand inkluderer bestemmelse av serumkreatinin og beregning av glomerulær filtrasjonshastighet ved hjelp av Cockcroft-Gault-formelen. Beregning av glomerulær filtrasjonshastighet ved hjelp av Reberg-testen gir mindre nøyaktige resultater.

Hovedmålet med dynamiske biokjemiske studier av pasienter med tuberkulose er å overvåke prosessens forløp, rettidig oppdagelse av bivirkninger av legemidler og tilstrekkelig korrigering av nye homeostaseforstyrrelser.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Anvendelse av biokjemiske forskningsmetoder ved ekstrapulmonal tuberkulose

Den mest informative indikatoren anses å være innholdet av tuberkulostearinsyre i biologiske væsker, men bestemmelsen er forbundet med tekniske vanskeligheter (behovet for å bruke gasskromatografi og massespektrometri).

Det er lovende å måle aktiviteten til adenosindeaminase – et enzym som bestemmes i væsker: synovial, perikardial, ascites eller cerebrospinal. De viktigste produsentene av adenosindeaminase er lymfocytter og monocytter. Bestemmelse av aktiviteten til adenosindeaminase i biologiske væsker letter diagnosen tuberkuløs synovitt, tuberkulose i lymfeknutene, tuberkuløs meningitt og tuberkuløs serositt.

Noen biokjemiske indikatorer bestemmes, på grunn av deres manglende spesifisitet, kun i biologiske væsker nær lesjonen. Nivået av indikatorer måles som respons på subkutan eller intradermal administrering av tuberkulin (vanligvis før administrering og 48 og 72 timer etter den). Etter dette beregnes graden av økning i markørnivået (i %) i forhold til det opprinnelige nivået.

Optimalt sett bestemmes aktiviteten til det organspesifikke enzymet transamidinase i urin; dets forekomst observeres ved nyreskade av ulik opprinnelse. Studiet av transamidinase er kun berettiget under subkutan administrering av tuberkulin for å forverre den lokale inflammatoriske prosessen. Transamidinaseaktivitet bestemmes i urin initialt og 24–72 timer etter administrering av 50 TE tuberkulin. En økning i fermenturi på 2 ganger eller mer gjør det mulig å skille aktiv nyretuberkulose fra forverring av kronisk pyelonefritt i 82 % av tilfellene.

Ved tuberkulose i kvinnelige kjønnsorganer bestemmes konsentrasjonene av haptoglobin og malondialdehyd i blodet under provoserende tuberkulintest. Tuberkulin administreres subkutant i en dose på 50 TE, og en gjentatt biokjemisk studie utføres etter 72 timer. Ved tuberkuløs etiologi er graden av økning i haptoglobinnivået minst 28 %, og nivået av malondialdehyd er 39 % eller mer. Bestemmelse av aktiviteten til adenosindeaminase i peritonealvæsken hentet fra Douglas-posen brukes også. Punkteringen undersøkes igjen 72 timer etter intradermal administrering av tuberkulin i doser på 0,1 TE og 0,01 TE i området der de indre kjønnsorganene projeksjonerer på den fremre bukveggen. En økning i aktiviteten til adenosindeaminase på 10 % eller mer sammenlignet med startverdien indikerer en tuberkuløs prosess.

Ved øyeskade undersøkes den fokale reaksjonen som oppstår i øyet som respons på antigenstimulering. I dette tilfellet er utviklingen av en kraftig uttrykt respons ledsaget av en reduksjon i visuelle funksjoner uønsket. Siden vurderingen av minimale fokale reaksjoner ofte er vanskelig, anbefales det å fokusere parallelt på graden av økning i haptoglobin eller adenosindeaminase i blodserumet for å objektivere konklusjonen.

Alle biokjemiske studier bør utføres i kombinasjon med andre metoder.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Studie av blodkoagulasjonssystemet

Relevansen av å studere tilstanden til blodkoagulasjonssystemet i ftisiologi skyldes tilstedeværelsen av hemoptyse eller lungeblødninger hos en rekke pasienter med lungetuberkulose, samt hemokoagulasjonskomplikasjoner ved kirurgisk behandling av tuberkulose. I tillegg påvirker den naturlig ledsagende latente intravaskulære hemokoagulasjonen sykdomsforløpet og effektiviteten av cellegift.

Hos pasienter med lungetuberkulose med en overveiende ekssudativ komponent av betennelse observeres en reduksjon i blodets antikoagulerende aktivitet. Hos pasienter med lav forekomst av spesifikk lungeskade med en overveiende produktiv komponent av betennelse, uttrykkes intravaskulær hemokoagulasjon ubetydelig. Hos pasienter med lungetuberkulose med hemoptyse og lungeblødninger er tilstanden til blodkoagulasjonssystemet annerledes: hos pasienter med mindre blodtap på høyden av hemoptøa eller umiddelbart etter at den er opphørt, observeres en kraftig økning i blodets koagulasjonskapasitet på grunn av en uttalt intensivering av trombindannelsesprosesser samtidig som økt "strukturell" koagulerbarhet opprettholdes. Hos pasienter med massivt blodtap observeres en reduksjon i koagulasjonspotensialet på grunn av en reduksjon i konsentrasjonen av fibrinogen, faktor XIII-aktivitet og antall blodplater. I kirurgisk behandlingsstadium hos pasienter med begrensede former for lungetuberkulose forekommer det ikke signifikante forstyrrelser i homeostasesystemet. Hos pasienter med utbredte prosesser, når man utfører pneumonektomi eller pleuropneumonektomi, utvikles ofte DIC-syndrom, som kan ta form av en "andre sykdom".

For å overvåke tilstanden til blodkoagulasjonssystemet hos pasienter med lungetuberkulose, er det nødvendig å bestemme aktivert partiell tromboplastintid (APTT), fibrinogen, trombintid, protrombinindeks, samt blødningstid og blodkoagulasjonstid.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonelle studier

Moderne eksperimentelle og kliniske observasjoner indikerer endringer i hormonstatus ved spesifikk tuberkuløs betennelse i lungene. Det er bevist at korrigering av dysfunksjon i hypofyse-binyre-, hypofyse-skjoldbruskkjertelsystemet og bukspyttkjertelfunksjonen i kombinasjon med antituberkulosebehandling bidrar til aktivering av fibrogenese og reparasjonsprosesser i fokus for spesifikk betennelse.

Hypofyse-skjoldbruskkjertelsystemets funksjonelle tilstand bedømmes ut fra innholdet av trijodtyronin (T3), tyroksin (T4) og hypofysisk tyreoideastimulerende hormon (TSH) i blodserumet _. Det _er fastslått at subklinisk hypotyreose oppdages hos 38–45 % av pasienter med lungetuberkulose, og det diagnostiseres oftest i disseminerte og fibrøse-kavernøse former av prosessen. I disse formene er nivåene av både T3 og T4 mest redusert _, og det oppstår _en ubalanse av disse hormonene i form av en økning i T4 _/ T3 _-forholdet.

Funksjonen til binyrebarken vurderes ut fra serumkortisolnivået, og den endokrine funksjonen til bukspyttkjertelen vurderes ut fra konsentrasjonen av immunreaktivt insulin. I den akutte fasen av en infeksjonssykdom øker behovet for endogent kortisol og insulin. Hyperinsulinemi indikerer også insulinresistens i kroppsvev, noe som er typisk for enhver aktiv inflammatorisk prosess, spesielt en spesifikk. Bestemmelse av glukokortikoidfunksjonen til binyrene ved aktiv lungetuberkulose lar oss oppdage tilstedeværelsen av hyperkortisisme hos de fleste pasienter. Normale kortisolkonsentrasjoner i blodet hos en pasient med infeksjonsbetennelse i den akutte perioden bør betraktes som en relativ insuffisiens av glukokortikoidfunksjonen til binyrebarken, noe som kan tjene som grunnlag for erstatningsterapi med tilstrekkelige doser glukokortikoider.

Nesten en tredjedel av pasienter med lungetuberkulose har et lavt insulineminivå som nærmer seg den nedre grensen for normen, mens 13–20 % har betydelig hyperinsulinisme. Både relativ hypo- og hyperinsulinisme er høyrisikofaktorer for utvikling av forstyrrelser i karbohydratmetabolismen av varierende alvorlighetsgrad. Disse endringene i den funksjonelle aktiviteten til pankreatiske B-celler krever regelmessig glykemiovervåking hos pasienter med tuberkulose og rettidig forebygging av diabetes mellitus. I tillegg tjener dette som en ytterligere begrunnelse for hensiktsmessigheten av å bruke fysiologiske doser insulin i den komplekse behandlingen av tuberkulose.

Generelt er reduksjonen i nivåene av skjoldbruskkjertelhormoner, deres ubalanse, hyperkortisolemi og hyperinsulinisme mest uttalt hos pasienter med et alvorlig forløp av tuberkuloseprosessen, med omfattende lungeskader og uttalte symptomer på tuberkuloseforgiftning.

Mikrobiologisk diagnostikk av tuberkulose

Mikrobiologiske studier er nødvendige for å identifisere pasienter med tuberkulose, verifisere diagnosen, overvåke og korrigere cellegiftbehandling, vurdere behandlingsresultater, med andre ord fra det øyeblikket en pasient med tuberkulose registreres til vedkommende fjernes fra registeret.

Alle epidemiologiske programmer og prosjekter er basert på vurdering av antall bakterieutskillere, noe som er umulig å gjøre uten bruk av laboratoriemetoder for å oppdage tuberkulosemykobakterier. Når man undersøker appellen til den såkalte uorganiserte befolkningen, når prosentandelen bakterieutskillere 70 eller mer, noe som gjør laboratoriemetoder til et ganske effektivt middel for å identifisere tuberkulosepasienter blant denne befolkningsgruppen.

Tradisjonelle mikrobiologiske metoder for å diagnostisere tuberkulose er bakterioskopiske og kulturelle studier. Moderne metoder inkluderer dyrking av tuberkulosemykobakterier i automatiserte systemer og PCR. Imidlertid er alle disse metodene nødvendigvis kombinert med klassiske bakteriologiske metoder.

Innsamling av diagnostisk materiale

Effektiviteten av laboratorietester avhenger i stor grad av kvaliteten på det diagnostiske materialet. Overholdelse av reglene for innsamling, lagring og transport av diagnostisk materiale og den nøyaktige implementeringen av pasientundersøkelsesalgoritmen påvirker direkte resultatet og sikrer biologisk sikkerhet.

En rekke materialer brukes til å teste for tuberkulose. Siden lungetuberkulose er den vanligste formen for tuberkuløs infeksjon, anses hovedmaterialet for testing å være sputum og andre typer trakeobronkial treutskillelse: utskillelse fra øvre luftveier oppnådd etter aerosolinhalasjon: bronkialskyllevann; bronkoalveolær skylling; materiale oppnådd under bronkoskopi, transtrakeal og intrapulmonal biopsi: bronkiaspirat, larynxutstryk, ekssudater, sårutstryk, etc.

Effektiviteten av forskningen øker dersom det utføres kontrollert innsamling av materiale fra pasienten. Til dette formålet tildeles et spesialutstyrt rom eller det kjøpes spesielle båser. Innsamling av materiale er en farlig prosedyre, derfor må materiale til forskning samles inn i samsvar med smittevernregler.

Materiale for testing for Mycobacterium tuberculosis samles opp i sterile hetteglass med tett skrudde korker for å forhindre forurensning av miljøet og beskytte det innsamlede materialet mot forurensning.

Ampuller for innsamling av diagnostisk materiale må oppfylle følgende krav:

• må være laget av slagfast materiale;
• skal smelte lett når den autoklaveres;
• ha tilstrekkelig volum (40–50 ml):
• ha en bred åpning for oppsamling av sputum (diameter ikke mindre enn 30 mm);
• være lett å håndtere, gjennomsiktig eller gjennomskinnelig, slik at mengden og kvaliteten på den innsamlede prøven kan vurderes uten å åpne lokket.

For å oppnå optimale forskningsresultater må følgende betingelser være oppfylt:

• innsamling av materiale bør utføres før oppstart av cellegiftbehandling;
• Materialet til studien må samles inn før du spiser eller tar medisiner om morgenen;
• For studien anbefales det å samle minst 3 morgenprøver av sputum. Sputum samles inn i 3 dager på rad;
• Det innsamlede materialet må leveres til laboratoriet så raskt som mulig:
• I tilfeller der det er umulig å levere materialet til laboratoriet umiddelbart, oppbevares det i kjøleskap ved en lufttemperatur på 4 °C i ikke mer enn 48 timer;
• Ved transport av materialet er det nødvendig å være spesielt oppmerksom på flaskenes integritet.

Korrekt innsamlet sputum har en slimete eller mukopurulent karakter. Det optimale volumet av den undersøkte sputumdelen er 3–5 ml.

Sputum samles inn under tilsyn av helsearbeider. Personer som er ansvarlige for å samle inn sputum må sørge for at visse regler følges:

• Det er nødvendig å forklare pasienten formålet med undersøkelsen og behovet for å hoste opp ikke spytt eller slim fra nesen og svelget, men innholdet i de dype delene av luftveiene. Dette kan oppnås som et resultat av en produktiv hoste som oppstår etter flere (2-3) dype åndedrag. Det er også nødvendig å advare pasienten om at han først må skylle munnen med kokende vann for å fjerne hoveddelen av mikrofloraen som vegeterer i munnhulen og matrester som kompliserer undersøkelsen av sputum;
• Helsearbeideren som er involvert i oppsamling av slim, må i tillegg til kjortel og lue, bruke maske, gummihansker og gummiforkle;
• Når pasienten står bak, anbefales det at han holder flasken så nær leppene som mulig og umiddelbart skille sputumet i den mens han hoster det opp, samtidig som det er nødvendig å sørge for at luftstrømmen rettes bort fra helsearbeideren:
• Når oppsamlingen av sputum er fullført, skal helsearbeideren lukke flasken forsiktig med lokket og vurdere mengden og kvaliteten på det innsamlede sputumet. Flasken merkes deretter og plasseres i en spesiell eske for transport til laboratoriet.

Hvis pasienten ikke produserer sputum, bør pasienten kvelden før og tidlig om morgenen på dagen for innsamling av materialet gis et slimløsende middel: ekstrakt av marshmallow-røttene (mucaltin), bromheksin, ambroxol, etc. - eller det bør brukes en irriterende inhalasjonsvæske, ved bruk av utstyr installert i rommet for innsamling av sputum. Materialet som samles inn på denne måten er ikke gjenstand for konservering og bør undersøkes på innsamlingsdagen. For å unngå at det "avvises" i laboratoriet, bør det gjøres en spesiell merknad i henvisningen.

Dersom det ikke utføres mikrobiologiske studier ved en gitt institusjon, må det innsamlede diagnostiske materialet leveres til laboratoriet sentralt, forutsatt at materialet oppbevares i kjøleskap eller med konserveringsmidler mellom leveransene. Materialet leveres til laboratoriet i transportkasser som lett kan desinfiseres. Hver prøve må være forsynt med en passende etikett, og hele partiet må ha et utfylt følgeskjema.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Metoder og hyppighet av undersøkelse av pasienter

Under den første, såkalte diagnostiske, undersøkelsen av en pasient for tuberkulose, er det nødvendig å undersøke minst 3 porsjoner sputum samlet under tilsyn av medisinsk personell i løpet av 2 eller 3 dager, noe som øker effektiviteten av mikroskopi.

Primær screening for tuberkulose bør utføres av alle medisinske og diagnostiske institusjoner i helsevesenet. For å øke effektiviteten av primærundersøkelsen har det nylig blitt organisert såkalte mikroskopisentre basert på kliniske diagnostiske laboratorier, utstyrt med moderne mikroskoper og utstyr for å sikre epidemisikkerhet.

Antituberkuloseinstitusjoner bruker en undersøkelsesordning som sørger for minst 3-ganger undersøkelse av sputum eller annet diagnostisk materiale innen 3 dager. Under behandlingen utføres mikrobiologiske studier regelmessig minst én gang i måneden i den intensive cellegiftfasen. Når man går over til oppfølgingsfasen, utføres studiene sjeldnere - med intervaller på 2-3 måneder, mens hyppigheten av studiene reduseres til to.

Funksjoner ved innsamling av diagnostisk materiale for ekstrapulmonal tuberkulose

Et trekk ved patologisk materiale i ekstrapulmonale former for tuberkulose er den lave konsentrasjonen av mykobakterier tuberkulose i den, noe som krever mer sensitive metoder for mikrobiologisk forskning, først og fremst metoder for såing på et næringsmedium.

Ved urogenital tuberkulose er urin det mest tilgjengelige materialet for undersøkelse. Urinprøvetaking bør utføres av en spesialutdannet sykepleier.

De ytre kjønnsorganene vaskes med vann og såpe eller en svak løsning av kaliumpermanganat. Den ytre åpningen av urinrøret behandles nøye. Den midtre delen av morgenurinen samles opp i en steril flaske: hos menn - naturligvis, hos kvinner - ved hjelp av et kateter. Urin fra nyrebekkenet samles opp i sterile reagensrør under kateterisering av en eller to nyrer, i sistnevnte tilfelle - nødvendigvis separat fra hver nyre. En liten mengde av denne urinen sentrifugeres, og sedimentet undersøkes.

Hos menn sentrifugeres sædceller, testikkelpunksjoner og prostatasekreter for å få et sediment. Ved enhver lokalisering av en spesifikk prosess i kjønnsområdet hos menn kan prostatamassasje fremme frigjøring av sekreter som inneholder tuberkulosemykobakterier.

Menstruasjonsblod samles inn fra kvinner ved suging eller bruk av en Kafka-hette. Det resulterende materialet befris fra erytrocytter ved å vaske det med destillert vann og deretter sentrifugere. Sedimentet undersøkes.

Utflod fra livmorhalskanalen samles i en beholder eller Kafka-hette, det vil si at det er ønskelig å akkumulere 1-2 ml patologisk materiale.

Materiale innhentet under kirurgiske inngrep på nyrer, kjønnsorganer, biopsier, endometrieskrap, homogeniseres. For å gjøre dette plasseres det i en steril morter og knuses grundig med steril saks. Steril elvesand tilsettes den resulterende suspensjonen i en mengde som tilsvarer massen, deretter tilsettes 0,5-1,0 ml isotonisk natriumkloridløsning, og alt males til en grøtete masse dannes ved tilsetning av isotonisk natriumkloridløsning (4-5 ml). Deretter får massen sette seg i 1-1,5 minutter, og supernatanten undersøkes.

Tuberkulose i bein og ledd. Punkteringen (puss fra abscesser) tatt med en steril sprøyte plasseres i en steril beholder og leveres umiddelbart til laboratoriet. Ved hjelp av en steril pipette, som tidligere er fuktet med steril isoton natriumkloridløsning, tas 2-5 ml puss, overføres til en flaske med perler og ytterligere 2-3 ml isoton natriumkloridløsning tilsettes. Flasken lukkes med en kork og ristes i en rister i 8-10 minutter. Den homogeniserte suspensjonen undersøkes.

Ved fistelformede former for osteoartikulær tuberkulose tas puss fra fistlen. Rikelig utflod samles direkte i et reagensrør. Ved sparsom pussutflod vaskes fisteltrakten med en steril isotonisk natriumkloridløsning, og vaskingen som samles i et reagensrør eller en tampong dynket i puss sendes til undersøkelse.

Kirurgisk materiale som innhentes under kirurgiske inngrep på bein og ledd kan bestå av purulent-nekrotiske masser, granulasjoner, arrvev, beinvev, synovialmembranvev og andre substrater. Behandlingen utføres som ved nyretuberkulose.

Mikrobiologisk undersøkelse av synovialvæske i en 3 % natriumcitratløsning (i forholdet 1:1) for å forhindre koagulering utføres umiddelbart etter punktering.

Tuberkulose i lymfeknutene. Puss tatt ut under punktering av lymfeknutene undersøkes på samme måte som puss fra abscesser. Lymfeknutevev tatt under kirurgiske inngrep og biopsier undersøkes som ved andre former for tuberkulose.

Studien av avføring for Mycobacterium tuberculosis utføres ekstremt sjelden på grunn av nesten fullstendig fravær av positive resultater.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopi av mykobakterier

Sputummikroskopi er en relativt rask, enkel og rimelig metode som bør brukes i alle tilfeller der det er mistanke om tuberkulose. I tillegg utføres denne studien for å vurdere effektiviteten av cellegiftbehandling og for å bekrefte bedring eller behandlingssvikt i fravær av dyrkningsresultater.

To metoder for mikroskopisk undersøkelse brukes:

• direkte mikroskopimetode, når et smøremiddel fremstilles direkte fra det diagnostiske materialet;
• en metode for mikroskopi av sediment fremstilt fra materiale behandlet med dekontamineringsmidler for kulturforskning.

Den første metoden brukes i de laboratoriene der kun mikroskopiske studier utføres (kliniske diagnostiske laboratorier i det generelle medisinske nettverket).

De beste resultatene av mikroskopisk undersøkelse oppnås ved å konsentrere det diagnostiske materialet (for eksempel ved sentrifugering).

For å kunne oppdage Mycobacterium tuberculosis med 50 % sannsynlighet ved mikroskopi, må 1 ml sputum inneholde mer enn 5000 mikrobielle celler. Sputum fra pasienter med pulmonale former for tuberkulose inneholder vanligvis et betydelig antall syrefaste bakterier, noe som gjør at de kan oppdages pålitelig ved bakterioskopi. Den diagnostiske sensitiviteten til denne metoden kan økes ved å undersøke flere sputumprøver fra én pasient. Et negativt bakterioskopisk undersøkelsesresultat utelukker ikke diagnosen tuberkulose, siden sputumet til noen pasienter inneholder mindre Mycobacterium enn det som kan oppdages ved mikroskopi. Dårlig forberedelse av sputumutstryk kan også være årsaken til et negativt bakterioskopisk undersøkelsesresultat.

Den vanligste metoden for å oppdage syrefaste mykobakterier i et utstryk er Ziehl-Neelsen-farging. Metoden er basert på penetrering av karbolfuksin inn i en mikrobiell celle gjennom en membran som inkluderer et voks-lipidlag, med samtidig effekt av oppvarming og den sterke etsende virkningen av fenol. Påfølgende avfarging av utstryket med en 25 % løsning av svovelsyre eller 3 % saltsyre fører til avfarging av alle ikke-syrefaste strukturer. De avfargede elementene i utstryket farges med en 0,3 % løsning av metylenblått. Mykobakterier oppfatter ikke konvensjonelle anilinfargestoffer, noe som resulterer i at syrefaste mykobakterier farges bringebærrøde, og andre mikrober og cellulære elementer farges blå.

For å undersøke utstryk farget i henhold til Ziehl-Neelsen, bruk et lyskikkertmikroskop med nedsenkingsobjektiv (90- eller 100-gangers forstørrelse) og et okular med 7- eller 10-gangers forstørrelse. 100 synsfelt undersøkes, noe som er tilstrekkelig til å oppdage enkeltmykobakterier i utstryket. Hvis resultatet av en slik undersøkelse er negativt, anbefales det å undersøke ytterligere 200 synsfelt for bekreftelse. Resultatene registreres, og angir antall syrefaste mykobakterier (AFB) som er oppdaget.

I tillegg til denne metoden brukes fluorokromfarging til luminescerende mikroskopi, noe som gjør det mulig å oppnå de beste resultatene. Bruken av denne metoden øker mikroskopiens effektivitet med 10–15 %. Når mykobakterier behandles med luminescerende fargestoffer (auramin, rhodamin, etc.), binder disse stoffene seg også til de vokslignende strukturene i den mikrobielle cellen. Når fargede celler bestråles med en eksiterende lyskilde (et visst spektrum av ultrafiolett stråling), begynner de å gløde oransje eller knallrødt mot en svart eller mørkegrønn bakgrunn. På grunn av den høye lysstyrken og kontrasten i det synlige bildet, kan mikroskopets totale forstørrelse reduseres med 4–10 ganger, noe som utvider synsfeltet og reduserer visningstiden for preparatet. Samtidig kan studiens komfort økes på grunn av den betydelig større dybdeskarpheten.

Ved bruk av fluorescensmikroskopi tar det betydelig kortere tid å undersøke det samme området av et utstryk enn lysmikroskopi av utstryk farget i henhold til Ziehl-Neelsen. Hvis en mikroskopist undersøker omtrent 20–25 slike utstryk i løpet av en arbeidsdag, kan vedkommende ved hjelp av fluorescensmikroskopi undersøke mer enn 60–80 prøver samtidig. Erfarne mikroskopister vet at farging av celler med en blanding av auramin og rhodamin på en eller annen måte er spesifikt for syrefaste mykobakterier, som i dette tilfellet har utseendet til gullstenger. Saprofytter farges grønnaktige.

En annen viktig fordel med fluorescensmikroskopimetoden er evnen til å oppdage endrede mykobakterier som har mistet sine syreresistente egenskaper under påvirkning av en rekke ugunstige faktorer, spesielt intensiv cellegiftbehandling, og derfor ikke oppdages ved Ziehl-Neelsen-farging.

Ulempene med fluorescensmikroskopimetoden inkluderer den relativt høye kostnaden for mikroskopet og driften av det. I sentraliserte eller andre store laboratorier, der arbeidsmengden overstiger normen for tre laboratorieteknikere som jobber med tre konvensjonelle mikroskoper, er det imidlertid billigere å bruke ett fluorescensmikroskop i stedet.

Bakterioskopiske metoder har en ganske høy spesifisitet (89–100 %). Omtrent 97 % av positive resultater oppnådd med en hvilken som helst mikroskopimetode bekreftes tydelig av resultatene av såing.

Det skal bemerkes at mikroskopisk undersøkelse av et utstryk av patologisk materiale ikke tillater artsbestemmelse av de påviste syreresistente mykobakteriene. Den mikroskopiske metoden tillater kun å trekke en konklusjon om tilstedeværelsen eller fraværet av syreresistente mikroorganismer i preparatet, noe som forklares av eksistensen i naturen av et stort antall ikke-tuberkuløse syreresistente mikroorganismer som morfologisk ligner mykobakterier i tuberkulosekomplekset.

Evalueringen av mikroskopiresultater utføres i semi-kvantitative enheter.

For å kunne sammenligne resultatene fra ulike mikroskopimetoder introduseres empiriske koeffisienter. For å for eksempel sammenligne resultatene av et utstryk farget med fluorescerende fargestoffer med dataene fra en lysmikroskopistudie (1000 ganger forstørrelse), er det nødvendig å dele antallet syrefaste mykobakterier som er oppdaget ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med den tilsvarende koeffisienten: ved 250 ganger forstørrelse av mikroskopet - med 10, ved 450 ganger - med 4, ved 630 ganger - med 2.

Funksjoner ved mikroskopi ved ekstrapulmonal tuberkulose

Direkte mikroskopi utføres, samt mikroskopi av utstryk fremstilt etter anriking med påfølgende farging i henhold til Ziehl-Neelsen eller fluorescerende fargestoffer. Direkte mikroskopi av utstryk er ineffektivt på grunn av den lave konsentrasjonen av mykobakterier i materialet, og derfor er det mer rasjonelt å bruke anrikningsmetoder. Sentrifugering er det mest effektive. Hvis det biologiske materialet er viskøst, brukes sentrifugering med samtidig homogenisering og flytendegjøring av materialet, som utføres ved hjelp av høyhastighetssentrifuger med en sentrifugeringskraft på 3000 g og hypoklorittløsninger. Andre anrikningsmetoder, som mikroflotasjon, brukes ikke for tiden på grunn av dannelsen av biologisk farlige aerosoler.

[ 37 ]

Kulturmetode for diagnostisering av tuberkulose

Såmetoden, eller dyrkningsmetoden, er mer sensitiv enn smearmikroskopi og har en rekke fordeler i forhold til sistnevnte. Den tillater påvisning av flere dusin levedyktige mykobakterier i materialet som undersøkes, og har høy diagnostisk verdi. Dette er spesielt viktig når man undersøker materiale fra nylig diagnostiserte eller behandlede pasienter som skiller ut et lite antall mykobakterier.

Sammenlignet med mikroskopi, tillater kulturforskning å øke antallet påviste tuberkulosepasienter med mer enn 15–25 %, samt å verifisere tuberkulose på tidligere stadier, når sykdommen fortsatt er lett behandlingsbar. En svært viktig fordel med kulturforskning anses å være muligheten til å oppnå en patogenkultur, som kan identifiseres og studeres i forhold til medikamentfølsomhet, virulens og andre biologiske egenskaper.

Ulempene med dyrkingsmetoder inkluderer varigheten (ventetiden for materialer når 10 uker), høyere kostnader og kompleksiteten ved behandling av diagnostisk materiale.

Prinsipper for behandling av diagnostisk materiale før såing

Konvensjonelle mikrobiologiske metoder kan ikke brukes til å utføre tuberkulosetester. Dette skyldes at tuberkulosemykobakterier vokser svært sakte, og de fleste kliniske prøver inneholder hurtigvoksende pyogene og forråtnelsesbakterier og sopp. Deres raske vekst på næringsrike medier forstyrrer utviklingen av mykobakterier og tillater ikke isolering av tuberkulosepatogenet, så det diagnostiske materialet må forbehandles før såing. I tillegg er mykobakterier som frigjøres fra pasientens luftveier vanligvis omgitt av en stor mengde slim, noe som gjør det vanskelig å konsentrere dem. I denne forbindelse må de flytendegjøres og dekontamineres før såing av sputum og annet lignende materiale.

Alle vaskemidler og dekontamineringsmidler har en mer eller mindre uttalt toksisk effekt på mykobakterier. Som et resultat av behandling kan opptil 90 % av mykobakteriene dø. For å bevare en tilstrekkelig andel av mykobakteriepopulasjonen er det nødvendig å bruke skånsomme behandlingsmetoder som på den ene siden undertrykker hurtigvoksende pyogene og putrefaktive mikroorganismer, og på den andre siden bevarer levedyktigheten til mykobakteriene som er tilstede i materialet maksimalt.

Avhengig av materialet, dets homogenitet og forurensningsnivå, brukes ulike dekontamineringsmidler til behandling før såing: for sputum - 4 % natriumhydroksidløsning, 10 % trinatriumfosfatløsninger, benzalkoniumklorid trinatriumfosfat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cystein-natriumhydroksid) med en endelig NaOH-konsentrasjon på 1 %, for urin og andre flytende materialer - 3 % svovelsyreløsning, for forurensede prøver, fettholdige materialer - oksalsyreløsning opptil 5 %. I tillegg brukes enzymer og overflateaktive stoffer (vaskemidler) i noen tilfeller. Bruk av Tween og noen andre vaskemidler er ledsaget av mindre død av mykobakterielle celler (40–50 % overlever). De kan imidlertid bare brukes til flytende materialer. NALC-NaOH, produsert i sett, er den mest brukte i verden. Denne metoden tillater isolering av mer enn 85 % av mykobakteriecellepopulasjonen. Dekontaminering av vevsholdige faste materialer er vanskeligere, siden det er vanskelig å gjette graden av dispersjon av materialet under homogenisering. For eksempel er prosessering av lymfeknutebiopsier ofte ledsaget av en økt frekvens av kontaminering med fremmedflora. I dette tilfellet kan 1 % etonium brukes.

Ikke-homogent materiale homogeniseres ved hjelp av glasskuler i nærvær av dekontamineringsmidler. Flytende materialer forhåndssentrifugeres, og kun sedimentet behandles.

Teknikk for såing og inkubasjon

Etter forbehandling sentrifugeres materialet, noe som utfeller mykobakteriene og øker innholdet av dem i sedimentet ("sedimentanrikning"). Det resulterende sedimentet nøytraliseres og inokuleres på overflaten av tette næringsmedier eller reagensrør med flytende (halvflytende) medier. Utstryk for mikroskopisk undersøkelse fremstilles fra det gjenværende sedimentet. Såteknikken må forhindre krysskontaminering av det diagnostiske materialet.

For pålitelig klinisk tolkning av resultatene av mikrobiologisk forskning må følgende regel overholdes: mikroskopiske og kulturelle studier må utføres parallelt fra samme prøve av diagnostisk materiale.

De inokulerte rørene plasseres i en termostat ved 37 ^° C i 2 dager i horisontal posisjon. Dette sikrer en jevnere absorpsjon av materialet i næringsmediet. Etter 2 dager flyttes rørene til vertikal posisjon og forsegles hermetisk med gummi- eller silikonpropper for å forhindre at det inokulerte mediet tørker ut.

Avlingene oppbevares i en termostat på 37 ^° C i 10–12 uker med regelmessig ukentlig inspeksjon. Følgende parametere registreres ved hver kontrollinspeksjon:

• periode med visuelt observerbar vekst fra sådagen;
• vekstrate (antall CFU);
• forurensning av kulturen med fremmed mikrobiell flora eller sopp (slike reagensrør fjernes);
• ingen synlig vekst. Rørene blir stående i termostaten til neste inspeksjon.

Næringsmedier

Ulike næringsmedier brukes til å dyrke mykobakterier: faste, halvflytende, flytende. Imidlertid har ingen av de kjente næringsmediene egenskaper som sikrer vekst av alle mykobakterielle celler. I denne forbindelse, for å forbedre effektiviteten, anbefales det å bruke 2-3 næringsmedier med ulik sammensetning samtidig.

Som standardmedium for primærisolering av tuberkulosepatogenet og bestemmelse av dets medikamentfølsomhet anbefaler WHO Lowenstein-Jensen-medium. Dette er et tett eggmedium hvor mykobakterievekst oppnås på den 20.–25. dagen etter såing av bakterioskopisk positivt materiale. Såing av bakterioskopisk negativt materiale krever en lengre inkubasjonsperiode (opptil 10–12 uker).

I vårt land har Finn-II-eggmediet, foreslått av ER Finn, blitt utbredt. Det skiller seg ut ved at det i stedet for L-asparagin bruker natriumglutamat, som utløser andre veier for syntesen av aminosyrer i mykobakterier. Vekst oppstår på dette mediet noe tidligere, og hyppigheten av mykobakterieisolering er 6–8 % høyere enn på Lowenstein-Jensen-mediet.

For å øke effektiviteten av bakteriologisk diagnostikk av ekstrapulmonal tuberkulose, anbefales det å inkludere modifisert Finn-II-medium i næringsmediekomplekset. For å akselerere veksten tilsettes i tillegg 0,05 % natriumtioglykolat i Finn-II-næringsmediet, noe som reduserer oksygenkonsentrasjonen. For å beskytte enzymsystemene til mykobakterier mot giftige produkter fra lipidperoksidasjon, tilsettes antioksidanten α-tokoferolacetat i Finn-II-næringsmediet i en konsentrasjon på 0,001 μg/ml. Det diagnostiske materialet sås ved hjelp av standardmetoden.

I anti-tuberkuloselaboratorier i Russland brukes også andre modifikasjoner av tette næringsmedier: næringsmediet "Novaya" foreslått av GG Mordovsky, næringsmediene A-6 og A-9 utviklet av VA Anikin, etc.

På grunn av det faktum at det oppstår skade på ulike metabolske systemer i den mikrobielle cellen under cellegiftbehandling, mister en del av den mykobakterielle populasjonen evnen til å utvikle seg normalt på konvensjonelle næringsmedier og trenger osmotisk balanserte (halvflytende eller flytende) næringsmedier.

Evaluering og registrering av resultatene av diagnostisk materialkultur

Noen stammer og typer mykobakterier vokser sakte, vekst kan forekomme selv innen den 90. dagen. Antallet slike kulturer er lite, men dette tvinger såkornene til å holdes i en termostat i 2,5–3 måneder.

Virulente kulturer av Mycobacterium tuberculosis vokser vanligvis på faste eggmedier som R-formede kolonier av varierende størrelse og utseende. Koloniene er tørre, rynkete, elfenbensfargede og lett pigmenterte. På andre medier kan Mycobacterium tuberculosis-kolonier være fuktigere. Etter en cellegiftkur eller under behandling kan glatte kolonier med fuktig vekst (S-former) isoleres.

Ved isolering av kulturer brukes et sett med spesielle studier for å skille tuberkulosemykobakterier fra ikke-tuberkuløse mykobakterier og syrefaste saprofytter.

Et positivt svar gis etter en obligatorisk mikroskopisk undersøkelse av et utstryk fra de dyrkede koloniene farget i henhold til Ziehl-Neelsen. Ved mykobakterievekst finnes knallrøde staver i utstrykene, som ligger enkeltvis eller i grupper, og danner klynger i form av filt eller fletter. I unge kulturer, spesielt de som er isolert fra pasienter behandlet med cellegift over lengre tid, kjennetegnes mykobakterier av uttalt polymorfisme, helt opp til tilstedeværelsen av korte, nesten kokkoide eller langstrakte varianter som ligner soppmycel, sammen med stavformede former.

Intensiteten av mykobakteriell vekst angis i henhold til følgende skjema: (+) - 1–20 CFU i et reagensrør (lav bakteriell utskillelse); (++) - 20–100 CFU i et reagensrør (moderat bakteriell utskillelse); (+++) - >100 CFU i et reagensrør (rikelig bakteriell utskillelse). Ved laboratoriediagnostikk av tuberkulose er det ikke nok å gi et svar som indikerer om mykobakterier er blitt påvist med en bestemt metode eller ikke. Det er også nødvendig å ha en detaljert oversikt over volumet og arten av mykobakteriepopulasjonen, dens sammensetning og egenskaper. Det er disse dataene som lar en tolke prosessens tilstand korrekt, planlegge taktikk og raskt justere behandlingen.

I de senere år har agarbaserte næringsmedier med ulike veksttilsetninger og bruk av en spesiell gassblanding blitt foreslått for å akselerere veksten av mykobakterier. For å oppnå vekst av mykobakterier på disse mediene, skapes en atmosfære med et økt innhold av karbondioksid (4-7 %) under dyrking. For dette formålet brukes spesielle CO2-inkubatorer _. Imidlertid har automatiserte mykobakteriedyrkingssystemer fått den største utviklingen: MGIT-BACTEC-960 og MB/Bact.

Et slikt system er MGIT-systemet (mycobacteria growth indicating tube), som er en høyteknologisk utvikling og er utviklet for akselerert bakteriologisk diagnostikk av tuberkulose og bestemmelse av mykobakteriers følsomhet for førstelinjemedisiner og noen andrelinjemedisiner. MGIT er utviklet for bruk som en del av VASTEC-960-enheten. Mikroorganismer dyrkes i spesielle reagensrør med et flytende næringsmedium basert på et modifisert Middlebrook-7H9-medium. For å stimulere veksten av mykobakterier og undertrykke veksten av fremmed mikroflora brukes MGIT Growth Supplement og en blanding av PANTA-antibakterielle legemidler.

Mikroorganismevekst registreres optisk. Det er basert på fluorescens, som oppstår når mykobakterier forbruker oksygen under veksten. Et oksygenavhengig fluorokromfargestoff finnes i bunnen av et spesielt reagensrør og er dekket med et lag med silikon. Reproduksjon av mykobakterier fører til en reduksjon i mengden oksygen i reagensrøret og en reduksjon i konsentrasjonen, noe som forårsaker en økning i fluorescens, som blir synlig når reagensrøret bestråles med ultrafiolett lys og registreres automatisk av fotosensorer innebygd i VASTES-960-enheten. Luminescensintensiteten registreres i vekstenheter (GU). Vekstdata legges automatisk inn i en datamaskin, hvor de kan lagres. Datamaskinanalyse av vekstkurver kan gi informasjon om tilstedeværelsen av ulike grupper av mykobakterier, inkludert ikke-tuberkuløse, og bidrar også til å evaluere vekstegenskapene til mykobakterier.

Som et resultat av innføringen av slike systemer har tiden for mykobakterievekst blitt betydelig redusert, med et gjennomsnitt på 11 dager på VASTEC-960 og 19 dager på MB/Bact mot 33 dager på et standard tett næringsmedium. Det bør bemerkes at disse systemene krever høyt kvalifisert personell. Såing av materiale på flytende medier er nødvendigvis ledsaget av såing på Lowenstein-Jensen-medium, som fungerer som en backup i tilfeller der tuberkulosemykobakterier ikke vokser på andre medier.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Bestemmelse av mykobakteriers medikamentfølsomhet

Bestemmelse av mykobakteriers spektrum og grad av følsomhet for tuberkulosemedisiner er av stor klinisk betydning, så vel som for den epidemiologiske vurderingen av spredningen av medikamentresistent tuberkulose. I tillegg lar overvåking av medikamentresistens oss vurdere effektiviteten av tuberkuloseprogrammet som helhet, og er en integrert indikator på arbeidet til alle komponenter i tuberkulosetiltakene.

Hyppighet og tidspunkt for testing av legemiddelfølsomhet:

• før behandlingsstart, én gang for å bestemme behandlingsstrategi og taktikk:
• Når man isolerer kulturer fra ulike materialer fra en pasient (sputum, BAL, urin, ekssudater, cerebrospinalvæske osv.), undersøkes alle isolerte stammer:
• på slutten av den intensive behandlingsfasen i fravær av klinisk og radiologisk dynamikk:
• hvis det er nødvendig å endre behandlingsregimet i tilfelle:
  • fravær av negativitet i sputum;
  • re-kultur etter negativ sputumprøve;
  • en kraftig økning i mengden AFB i et utstryk etter en initial reduksjon. Det er velkjent at stammer av Mycobacterium tuberculosis med ulik legemiddelfølsomhet isoleres fra materiale fra en pasient med tuberkulose. Stammenes følsomhet for antituberkulosemedisiner kan variere i legemiddelspekteret, graden, hyppigheten og hastigheten på resistensutviklingen.

Graden av medikamentresistens for Mycobacterium tuberculosis bestemmes i samsvar med etablerte kriterier, som er fokusert på den kliniske betydningen av resistens og avhenger av legemidlets antituberkuloseaktivitet, dets farmakokinetikk, konsentrasjon i lesjonen, maksimal terapeutisk dose, etc.

Bestemmelse av mykobakteriers medikamentfølsomhet utføres for tiden ved hjelp av mikrobiologiske metoder:

• absolutte konsentrasjoner (fortynningsmetode på faste eller flytende næringsmedier),
• proporsjoner,
• motstandskoeffisient.

Vanligvis manifesterer resistens seg i form av visuelt observert vekst av kolonier av mykobakterier tuberkulose, men det finnes metoder som induserer vekst i de tidlige stadiene av mykobakteriell celledeling i form av fargereaksjoner. Disse metodene reduserer testtiden fra 3–4 til 2 uker.

Den absolutte konsentrasjonsmetoden anbefalt av WHOs kjemoterapikomité har blitt utbredt i Russland som en enhetlig metode. Fra et metodologisk synspunkt er det den enkleste, men krever høy standardisering og presisjon i laboratorieprosedyrer. Legemiddelfølsomhetstesten består av et sett med reagensrør med et næringsmedium modifisert med anti-tuberkulosemedisiner. Settet består av 2–3 reagensrør med forskjellige konsentrasjoner av hvert av legemidlene som brukes, ett kontrollreagensrør med et medium uten legemiddel, og ett reagensrør som inneholder 1000 μg/ml natriumsalisylat eller 500 μg/ml paranitrobenzosyre for å detektere veksten av ikke-tuberkuløse mykobakterier.

For å lage et sett med medier med preparater, bruk et modifisert Lowenstein-Jensen-medium (uten stivelse), som helles i kolber. Et visst volum av den tilsvarende fortynningen av anti-tuberkulosemedisinen tilsettes til hver av kolbene. Innholdet i kolbene blandes grundig, helles i reagensrør og koaguleres i en skrå posisjon i 40 minutter ved en temperatur på 85 °C. Det anbefales å koagulere mediet i en elektrisk koagulator med automatisk temperaturkontroll. Medium med anti-tuberkulosemedisiner

1. rad kan oppbevares i kjøleskap ved 2–4 °C i 1 måned, med legemidler fra 2. rad – ikke mer enn 2 uker. Oppbevaring av medier med legemidler ved romtemperatur er uakseptabelt. Ved tilberedning av løsninger av antituberkulosemedisiner tas deres aktivitet i betraktning, og konsentrasjonen beregnes med justering for molekylvekten til den uspesifikke delen av legemidlet, renhet osv. For å bestemme legemiddelfølsomheten brukes kun kjemisk rene stoffer.

Prinsippet for metoden er å bestemme konsentrasjonen av et antituberkulosemiddel som hemmer veksten av en betydelig del av mykobakteriepopulasjonen. Når den utføres riktig, har denne metoden god pålitelighet.

Før testen utføres, er det nødvendig å forsikre seg om at den isolerte kulturen av Mycobacterium tuberculosis ikke inneholder fremmed mikroflora. En homogen suspensjon som inneholder 500 millioner mikrobielle legemer i 1 ml (optisk turbiditetsstandard 5 enheter) fremstilles fra kulturen av mykobakterier i en 0,9 % natriumkloridløsning. Den resulterende suspensjonen fortynnes med 0,9 % natriumkloridløsning (1:10), og 0,2 ml av suspensjonen tilsettes hvert reagensrør i næringsmediesettet. De inokulerte reagensrørene plasseres i en termostat ved 37 °C og holdes horisontalt i 2–3 dager, slik at den skrå overflaten av næringsmediet inokuleres jevnt med suspensjonen av Mycobacterium tuberculosis. Deretter flyttes reagensrørene til en vertikal posisjon og inkuberes i 3–4 uker. Resultatene registreres etter 3–4 uker.

Siden tiden det tar å isolere patogenet fra klinisk materiale på næringsmedier er minst 1–1,5 måneder, kan resultatene av bestemmelse av legemiddelfølsomhet ved bruk av denne metoden oppnås tidligst 2–2,5 måneder etter såing av materialet. Dette er en av de største ulempene med metoden.

Resultatene av mykobakteriell legemiddelresistenstesting tolkes basert på visse kriterier. På fast medium anses en kultur som følsom for konsentrasjonen av legemidlet i mediet hvis antallet mykobakterielle kolonier dyrket på et gitt reagensrør med legemidlet ikke overstiger 20 med rikelig vekst på et kontrollreagensrør uten legemidler. Bare hvis det er mer enn 20 kolonier, anses kulturen som resistent mot en gitt konsentrasjon. I praksis, når vekstresultater i reagensrør nær 20 CFU oppnås, er det nødvendig å varsle klinisk enhet om at følsomheten eller resistensen i dette tilfellet er grenseverdi, siden dette noen ganger kan forklare den uklare dynamikken i kliniske indikatorer.

For ulike preparater etableres en viss konsentrasjon der reproduksjon av en kritisk andel av mykobakteriepopulasjonen observeres. Disse konsentrasjonene kalles "kritiske". Størrelsen på veksten av mykobakteriepopulasjonen på et næringsmedium med preparatet i en kritisk konsentrasjon brukes som et kriterium for stabilitet.

I innenlandsk ftisiologipraksis er de ikke begrenset til å bestemme kun kritiske konsentrasjoner når de bestemmer medikamentresistens. Dette skyldes det faktum at en utvidet definisjon av nivået av medikamentresistens hos patogenet lar klinikeren formulere cellegifttaktikker mer korrekt, ved å bruke kunnskap om den potenserende effekten av medikamentkombinasjoner, for å forutse kryssresistens eller å bruke mer effektive legemidler fra den brukte gruppen av antituberkulosemedisiner.

Den absolutte konsentrasjonsmetoden er den enkleste, men også den mest følsomme for feil som gjøres i implementeringen. Mer pålitelig, spesielt når man bestemmer følsomhet for andrelinjemedisiner, og utbredt utenfor Russland er proporsjonsmetoden. Den tar hensyn til manglene ved den absolutte konsentrasjonsmetoden, men den er mer arbeidskrevende å implementere.

Metoden er svært lik den absolutte konsentrasjonsmetoden. Tilberedning av reagensrør med legemidler er den samme som i den absolutte konsentrasjonsmetoden. Imidlertid reduseres frødosen av tuberculosis mycobacterium-suspensjonen med 10 ganger, noe som eliminerer hyppigheten av spontan resistens hos noen tuberculosis mycobacterium-stammer mot legemidler som etambutol, protionamid og kapreomycin. Som kontroller brukes 2 eller 3 rør med en frødose lik den i reagensrørene, suksessivt fortynnet 10 og 100 ganger. Kriteriet for resistens er andelen visuelt observert vekst av tuberculosis mycobacterium. For førstelinjemedisiner er kriteriet for resistens en overvekst på 1 % av den opprinnelige populasjonen, for andrelinjemedisiner en vekst på 1 eller mer enn 10 % av den opprinnelige populasjonen, avhengig av den valgte kritiske konsentrasjonen.

I 1997 justerte WHO og Den internasjonale unionen mot tuberkuloses arbeidsgruppe for påvisning av resistens mot tuberkulosemedisiner disse kriteriene og foreslo å anse mykobakterier som vokser på det tette Lowenstein-Jensen-eggmediet i følgende konsentrasjoner som resistente:

• dihydrostreptomycin - 4 μg/ml;
• isoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

I 2001 ble det foreslått kritiske konsentrasjoner for følgende andrelinjemedisiner (for en kritisk andel på 1 %):

• kapreomycin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamycin - 30 μg/ml;
• viomycin - 30 μg/ml;
• cykloserin - 40 mcg/ml;
• aminosalisylsyre - 0,5 mcg/ml;
• ofloksacin - 2 mcg/ml.

Vekstresultatene vurderes etter 4 uker som foreløpige og etter 6 ukers dyrking som endelige.

For å bestemme legemiddelfølsomhet for pyrazinamid, som er mye brukt i moderne tuberkulosekjemoterapi, er den anbefalte kritiske konsentrasjonen 200 μg/ml. Det finnes imidlertid fortsatt ingen generelt akseptert metode for å bestemme legemiddelresistens mot dette legemidlet på faste næringsmedier, siden dets antibakterielle aktivitet bare manifesterer seg i et surt miljø (pH <6), som er teknisk vanskelig å opprettholde. I tillegg er mange kliniske kulturer av Mycobacterium tuberculosis motvillige til å dyrke på eggmedier med et surt miljø.

For å vurdere kvaliteten på resultatene av bestemmelsen av mykobakteriers medikamentfølsomhet, anbefales det å kontrollere hver nye batch av Lowenstein-Jensen-medium ved parallell bestemmelse av følsomheten til standard museumsstammen H37Rv. I tillegg er det visse mikrobiologiske kriterier som må oppfylles slik at metodene gir et godt reproduserbart og korrekt tolket resultat. Disse inkluderer levedyktigheten til tuberkulosemykobakteriekulturen, reglene for å oppnå en homogen suspensjon og suspensjon, reglene for valg av tuberkulosemykobakteriekulturer og representativiteten til den valgte bakteriemassen. Påliteligheten av å bestemme medikamentresistens avtar med ekstremt dårlig bakterieutskillelse.

Nylig har metoden for å bestemme medikamentfølsomhet ved bruk av automatiserte systemer blitt anerkjent som lovende. De mest avanserte på dette området er utviklingen basert på VASTEC MGIT-960. I dette tilfellet bestemmes medikamentfølsomheten til tuberkulosemykobakterier basert på en modifisert proporsjonsmetode. Under bestemmelsen sammenlignes vekstraten til tuberkulosemykobakterier i kontrollrøret og i rør med medikamenter. For å bestemme følsomheten for streptomycin, isoniazid, rifampicin og etambutol brukes berikende tilsetningsstoffer og antibiotika som er inkludert i SIRE-settet. For å bestemme følsomheten for pyrazinamid brukes PZA-settet. Under testen inokuleres reagensrør med medikamenter med en suspensjon av tuberkulosemykobakterier, samt kontrollrør med en 100-ganger fortynning av suspensjonen for alle medikamenter, med unntak av pyrazinamid, hvor suspensjonsfortynningen er 10 ganger. Kriteriet for stabilitet er mykobakterievekstindikatoren på 100 GU når veksten i kontrollrøret når 400 GU (se «Kulturelle metoder for isolering av mykobakterier»). Resultatene registreres og tolkes automatisk og angis av det angitte eller valgte programmet.

Sluttkonsentrasjonene i reagensrøret med flytende næringsmedium brukes som kritiske konsentrasjoner. For tiden er kritiske konsentrasjoner utviklet for både førstelinjemedisiner og noen andrelinjemedisiner. Det skal bemerkes at bestemmelsen av følsomheten til tuberkulosemykobakterier for cykloserin og aminosalisylsyre kun utføres på eggnæringsmedier.

En detaljert protokoll for arbeid med det beskrevne systemet muliggjør testing av medikamentfølsomhet både på en isolert kultur (med et tett næringsmedium) og ved bruk av primærvekst av mykobakterier i et MGIT-reagensrør. Det siste alternativet reduserer tiden som kreves for å gjennomføre kulturstudier betydelig, slik at fullstendige resultater av kulturen av tuberkulosemykobakterier (inkludert informasjon om medikamentfølsomhet) kan oppnås innen 3 uker etter innsamling av materialet, mens den tradisjonelle metoden først kan gi dette innen den tredje måneden. Rettidige resultater, når pasienten er i den intensive behandlingsfasen, kan kompensere for de relativt høye kostnadene ved studiene.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Differensiering av mykobakterier

Siden næringsmediene som brukes ikke er strengt selektive, anses påfølgende differensiering av de isolerte mykobakteriene som obligatorisk. Behovet for differensiering av mykobakterier skyldes en rekke trekk ved patologiske prosesser forårsaket av representanter for slekten: ulikt forløp og utfall av tuberkulose og mykobakteriose, tilstedeværelsen av naturlig medikamentresistens mot noen antituberkulosemedisiner.

Det erkjent at den primære identifiseringen av mykobakterier i M. tuberculosis-komplekset fra ikke-tuberkuløse mykobakterier utføres i henhold til følgende egenskaper: veksthastighet på tette næringsmedier, pigmentdannelse, kolonimorfologi, tilstedeværelse av syreresistens og temperaturoptimum for vekst.

Dessverre finnes det ingen enkelt laboratoriemetode som pålitelig kan skille mykobakterier av M. tuberculosis-komplekset fra andre syrefaste mykobakterier. Imidlertid tillater en kombinasjon av de ovenfor beskrevne tegnene med resultatene av en rekke biokjemiske tester gitt nedenfor identifisering av mykobakterier av M. tuberculosis-komplekset med en sannsynlighet på opptil 95 %.

For å skille mykobakterier av M. tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii og andre) fra saktevoksende ikke-tuberkuløse mykobakterier, brukes grunnleggende biokjemiske tester for å oppdage tilstedeværelsen av følgende tegn:

• evne til å produsere nikotinsyre (niacintest):
• nitratreduktaseaktivitet;
• termostabil katalase;
• vekst på et medium med natriumsalisylat (1 mg/ml).

Som en tilleggstest kan også veksttester på et medium som inneholder 500 μg/ml para-nitrobenzosyre eller 5 % natriumklorid brukes.

Mange bakteriologiske laboratorier identifiserer disse mikroorganismene bare på komplekst nivå, noe som skyldes laboratorienes begrensede kapasitet og spesialistenes metodologiske kapasitet.

I de fleste tilfeller i praksis er følgende tester tilstrekkelige for å differensiere M. tuberculosis og M. bovis: niacin, nitratreduktase, pyrazinamidase og vekstregistrering på et medium som inneholder 2 μg/ml tiofen-2-karboksylsyrehydrazid. Det tas hensyn til at mykobakterier i M. tuberculosis-komplekset er karakterisert av følgende sett med trekk:

• langsom vekst (mer enn 3 uker);
• veksttemperatur innenfor 35-37 ^o C;
• fravær av pigmentering (elfenbensfarge);
• uttalt syrefast farging;
• positiv niacintest;
• positiv nitratreduktasetest;
• fravær av termostabil katalase (68 ^° C).
• mangel på vekst på Lowenstein-Jensen-medium som inneholder:
  • 1000 µg/ml natriumsalisylsyre,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzosyre,
  • 5 % natriumklorid:
• vekst i nærvær av 1–5 μg/ml tiofen-2-karboksylsyre.

Relevansen av differensiering av isolerte mykobakterier vil øke betydelig med økende hyppighet av registrering av HIV/AIDS-tilfeller assosiert med tuberkulose eller mykobakteriose. For øyeblikket er det ingen absolutt sikkerhet for om praktiske regionale laboratorier er klare til å utføre denne arbeidsmengden korrekt.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Immunologisk diagnostikk av tuberkulose

Det finnes en rekke universelle fenomener, preparater og immunologiske tester som opprinnelig ble oppdaget spesifikt i tuberkulose eller i modellen for immunrespons mot mykobakterier. Disse inkluderer BCG og tuberkulin, et fenomen som hud-DST (tuberkulintester - Pirquet- og Mantoux-reaksjoner), reaksjonen på subkutan administrering av tuberkulin til sensibiliserte dyr (Koch-fenomenet). Noen av de første antistoffene i infeksjonssykdommer ble også oppdaget i tuberkulose. Jo dypere forståelsen av mekanismene for antituberkuloseimmunitet og deres genetiske kontroll er, desto bredere kan selvfølgelig bruken av immunologiske metoder og preparater som påvirker immuniteten være for å løse praktiske problemer innen ftisiologi.

Det viktigste og mest komplekse praktiske problemet for tiden anses å være påvisning av tuberkulose i prosessen med massescreening av befolkningen. Til tross for en rekke rapporter om "suksesser" (på begrenset materiale), finnes det imidlertid ingen immunologisk metode (reproduserbar i "hvilke hender") eller legemiddel som er egnet for disse formålene.

Immunologiske metoder, spesielt serologiske studier (bestemmelse av antigener, antistoffer) og tuberkulinprovokasjonstester, er mye brukt i klinisk praksis.

Serologiske metoder, som bestemmer antigener og antistoffer i forskjellige miljøer i kroppen, er på førsteplass blant immunologiske studier som brukes i differensialdiagnostikk.

Spesifisiteten ved bestemmelsen av antistoffer mot mykobakterier tuberkulose avhenger av antigenene som brukes i immunanalysen. Et betydelig antall antigener har blitt foreslått, hvorav det første er tuberkulin PPD:

• PPD og andre komplekse preparater fra kulturvæske;
• ultralyd desintegreringsmiddel;
• Triton-ekstrakt og andre komplekse celleveggpreparater;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• navlestrengsfaktor (trehalose-6,6-di-mykolat);
• fenoliske og andre glykolipider;
• lipopolysakkarider;
• fibronektinbindende antigen;
• proteiner (oftest rekombinante); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA, etc.

Som et resultat av mange års forskning fra russiske og utenlandske forskere, ble de viktigste mønstrene for antistoffdannelse og effektiviteten av serologisk diagnostikk av tuberkulose identifisert: jo mer komplekst antigenet er, desto høyere er sensitiviteten og desto lavere er testenes spesifisitet. Spesifisiteten varierer i forskjellige land avhengig av befolkningens infeksjon med M. tuberculosis og ikke-tuberkuløse mykobakterier, BCG-vaksinasjon, etc. Hos barn er informativiteten til serodiagnostikk lavere enn hos voksne. Ved primær tuberkulose (oftere hos barn) er bestemmelsen av IgM mer informativ; ved sekundær tuberkulose - IgG. Hos HIV-infiserte personer er informativiteten til serodiagnostikk i bestemmelsen av antistoffer redusert. Effektiviteten av antistoffbestemmelse avhenger av en rekke "kliniske momenter": prosessens aktivitet (tilstedeværelse eller fravær av "isolering" av mykobakterier, tilstedeværelse av forråtnelseshulrom, graden av infiltrasjon), forekomsten av prosessen, varigheten av forløpet.

Sensitiviteten til enzymimmunoassay-metoden (EIA) er omtrent 70 %. Studiens utilstrekkelige effektivitet skyldes dens lave spesifisitet. Tidligere ble mulighetene for å bruke serologisk screening i høyrisikogrupper vurdert, spesielt blant personer med posttuberkuloseforandringer i lungene.

For å øke spesifisiteten til ELISA søkes det etter mer spesifikke antigener, inkludert de som er oppnådd ved genteknologi: ESAT-6, etc. (se ovenfor). Bruk av strengt spesifikke antigener (38 kDa, ESAT) øker spesifisiteten, men reduserer analysens sensitivitet betydelig. Sammen med ELISA (eksperimentelle laboratorietestsystemer, som Pathozyme ELISA-kit), tilbys også immunokromatografiske kit med lateral filtrering (Mycodot), samt andre lignende tester (membranpunktanalyse) med visuell vurdering av testresultatet. Ved utførelse av disse testene tar analysen 10–30 minutter; de krever ikke spesialutstyr, de krever visuell vurdering av resultatene, noe som er forbundet med en viss subjektivitet. Disse metodene har omtrent samme sensitivitets- og spesifisitetsegenskaper (henholdsvis 70 % og 90–93 %) som tradisjonell ELISA.

Bruken av immunanalysemetoder har en viss verdi som en tilleggsmetode som tas i betraktning i komplekset av metoder som brukes i differensialdiagnosen av tuberkulose, spesielt i diagnostisering av dens ekstrapulmonale former. ELISA-metoden er mest effektiv i diagnostisering av tuberkuløs meningitt ved undersøkelse av cerebrospinalvæsken. I dette tilfellet er analysens sensitivitet 80–85 %, og spesifisiteten er 97–98 %. Det finnes informasjon om effektiviteten av å bestemme antistoffer mot Mycobacterium tuberculosis i tårevæske i diagnostiseringen av tuberkuløs uveitt.

Induksjon av gammainterferonsyntese in vitro

Gamma-interferon (IFN-γ) er en faktor for spesifikk immunbeskyttelse, oppnådd ved å aktivere enzymsystemene til makrofager. Induksjon av IFN-γ-syntese av sensibiliserte T-lymfocytter er forårsaket av deres interaksjon med mykobakterielle antigener.

Både tuberkulin PPD og spesifikke antigener oppnådd ved genteknologi brukes som antigener, spesielt ESAT-6-antigenet (tidlig utskilt antigen med en molekylvekt på 6 kDa) og CFP-10 (kulturfiltratprotein, 10 kDa). Genmodifiserte eller rekombinante antigener er fraværende i cellene i BCG-vaksinen og andre mykobakterier. Ved bruk av tuberkulin er resultatene av IFN-γ-induksjonstesten sammenlignbare med resultatene av tuberkulinhudtesten (direkte korrelasjon). Ved bruk av genmodifiserte antigener er testresultatene mer spesifikke og avhenger ikke av tidligere BCG-vaksinasjon. Ved undersøkelse av vaksinerte individer som ikke har hatt kontakt med tuberkuloseinfeksjon, er testens spesifisitet 99 %. Testens sensitivitet blant tuberkulosepasienter varierer fra 81 til 89 %.

Tester og diagnostikk er utviklet basert på korttidsdyrking av fullblodsceller eller mononukleære celler isolert fra blod med tuberkulose-mykobakterieantigener in vitro, etterfulgt av bestemmelse av IFN-γ-konsentrasjonen eller telling av antall T-lymfocytter som syntetiserer IFN-γ. Konsentrasjonen av interferon syntetisert i et reagensrør bestemmes ved ELISA ved bruk av monoklonale antistoffer som binder IFN-γ. Deretter bestemmes konsentrasjonen i reagensrøret eller platebrønnene ved bruk av kalibrering av standard IFN-γ.

I Elispot-testen telles antallet T-celler som syntetiserer IFN-γ på overflaten av en skål dekket med antistoffer mot IFN-γ.

Utviklerne av in vitro-testen for IFN-γ-induksjon, som er godkjent av det amerikanske mat- og legemiddeltilsynet (FDA), hevder at testen ikke kan skille latent tuberkuloseinfeksjon fra aktiv tuberkulose. I regioner med høy infeksjonsrate har testen derfor ingen direkte diagnostisk verdi. I vårt land kan den imidlertid brukes til å skille tuberkuloseinfeksjon hos barn fra postvaksinasjonsallergi, samt til å vurdere nivået av spesifikk immunitet under behandling.

For tiden er et innenlandsk testsystem for å bestemme induksjon av IFN-γ-syntese av spesifikke tuberkuloseantigener in vitro under utforskning.

Immunstatus og forløp av tuberkulose, immunkorreksjon

Under behandlingen av tuberkulose forekommer endringer i antigenemi og immunsystemets tilstand hos mennesker.

Dataene om endringer i ekssudater og vev er i stor grad motstridende. Det eneste som kan bemerkes med full begrunnelse er at tuberkuløse granulomer som regel inneholder et betydelig antall aktiverte T-lymfocytter.

Det er fornuftig å dvele ved to punkter til som er nødvendige for å forstå rollen til immunologiske mekanismer i behandlingen av tuberkulose hos mennesker:

• AIDS-pasienter har en spesielt høy forekomst av å utvikle multippel medikamentresistens;
• Ved multippel medikamentresistens (og i fravær av HIV-infeksjon) er immunforstyrrelser (primært T-celleimmunitet) spesielt betydningsfulle.

Ved tuberkulose brukes ulike metoder for immunkorreksjon mye: først og fremst er dette legemidler som hovedsakelig virker på T-celleimmunitet og det mononukleære fagocyttsystemet (thymushormoner, isofon, likopid, polyoksidonium, etc.), samt hele (svekkede) mykobakterier og deres komponenter.

Molekylærbiologisk diagnostikk av tuberkulose

Molekylærbiologiske metoder i diagnostikk av infeksjonssykdommer omfatter hovedsakelig metoder basert på manipulering av genomisk materiale fra bakterielle og virale patogener for å identifisere spesifikt genetisk materiale - DNA-seksjoner med en nukleotidsekvens spesifikk for en gitt art eller stamme av patogen, for å analysere spesifikke DNA-sekvenser i gener som bestemmer patogenets følsomhet for visse legemidler, samt for å analysere den funksjonelle aktiviteten til visse gener hos patogenet. Molekylærbiologiske metoder har blitt utbredt i vitenskapelig forskning og praktisk anvendelse i diagnostikk og overvåking av ulike bakterielle og virale infeksjoner etter oppdagelsen av polymerasekjedereaksjonen i 1985 av Carrie Mullis (nobelprisvinner 1989).

Prinsipper og egenskaper ved polymerasekjedereaksjonsmetoden

PCR muliggjør amplifisering (multiplikasjon) av en nukleotidsekvens (et fragment av patogen-DNA) i et reagensrør millioner av ganger i løpet av noen få timer. Utførelsen av reaksjonen i nærvær av enkeltstående DNA-kjeder bestemmer analysens usedvanlig høye følsomhet.

Nukleotidsekvensen til visse deler av DNA-kjeden bestemmer mikroorganismens genetiske unikhet, noe som forklarer den høye spesifisiteten til PCR.

Betydningen av denne metoden for påvisning og studier av egenskapene til Mycobacterium tuberculosis skyldes de biologiske egenskapene til mikroorganismen, som har svært langsom vekst: doblingstiden for DNA-et til Mycobacterium tuberculosis under dyrking er 12–24 timer.

Prinsippet for PCR-metoden er amplifisering - multippel, millioner av ganger multiplikasjon av seksjoner av en spesifikk DNA-sekvens i et reagensrørsmikrovolum med syklisk repetisjon av de følgende tre reaksjonstrinn, som hver foregår i et annet temperaturregime:

• Fase I - denaturering av dobbelttrådet DNA ved oppvarming med divergens av kjedene;
• Fase II - komplementær binding (hybridisering) av primere (primende oligonukleotider) med endeseksjonene av kjedene til et strengt spesifikt DNA-fragment valgt for amplifisering;
• Fase III – fullføring av DNA-fragmentkjeden ved bruk av termostabil DNA-polymerase.

For amplifisering må reagensrøret inneholde molekyler av matriks-DNA. Fire typer deoksynukleosidtrifosfater (nukleotider) som inneholder de tilsvarende nitrogenholdige basene: adenin (A), tymin (T), guanin (G), cytosin (C); kunstig syntetiserte primingoligonukleotider (primere) bestående av 18–20 basepar; et termostabilt enzym, DNA-polymerase, med et temperaturoptimum på 68–72 ^° C, og magnesiumioner.

Spesifisiteten til PCR avhenger av valget av DNA-fragment. I samsvar med dette syntetiseres flankerende primeroligonukleotider. Spesifisiteten til hybridisering og fullføring av DNA-kjeden bestemmes av prinsippet om komplementaritet mellom følgende par av nitrogenholdige baser: adenin-tymin, guanin-cytosin.

For å bestemme genomet til tuberkulosekompleksmykobakteriene er det mest effektive amplifiseringsmålet i de fleste testsystemer IS6110 DNA-fragmentet, som i de fleste tuberkulosemykobakteriestammer har et betydelig antall (10–20) repetisjoner i genomet, noe som i tillegg til spesifisitet sikrer høy sensitivitet i analysen. Samtidig er det beskrevet tuberkulosemykobakteriestammer med et lite antall repetisjoner eller fravær av IS6110-fragmentet.

Ekstraksjon av DNA-molekyler fra en biologisk prøve

For å utføre PCR må DNA-molekylene til patogenet isoleres fra det biologiske materialet i et minimalt volum, med en minimal mengde uspesifikt DNA og forskjellige hemmere av enzymet - DNA-polymerase.

Prøvepreparering må utføres under forhold som forhindrer krysskontaminering av prøvene som studeres med isolerte DNA-molekyler. Dette krever forhåndsbehandling av rommet med ultrafiolett lys, gulv og arbeidsflater på bord og apparater - med klorholdige løsninger. Det er også nødvendig å bruke rene hansker, engangsreagensrør og spisser for automatiske pipetter.

For å isolere DNA fra Mycobacterium tuberculosis fra kliniske prøver (cerebrospinalvæske, bronkial lavage) som ikke inneholder et stort antall leukocytter, cellulært avfall eller salter, er det tilstrekkelig å sentrifugere prøven ved 3–4000 omdreininger per minutt, tilsette 20–30 µl av en 2 % løsning av Triton X-100 til sedimentet og varme opp ved 90 ^° C i 30 minutter.

Tilberedning av sputumprøver krever effektiv flytendegjøring, vanligvis ved bruk av 4 % natriumhydroksid og N-acetyl-L-cystein (NALC) med 50–80 mg per prøve, avhengig av prøvens viskositet. NALC-løsningen bør tilberedes ex tempore, eller NALC-pulver kan tilsettes tørt direkte til prøven. Etter flytendegjøring bør prøvene sentrifugeres i 15 minutter ved 3500–4000 o/min (3000 g) i 50 ml skrukorkrør, dvs. under de samme forholdene som anbefales for tilberedning av sputum før kultur.

For å utvinne DNA fra sediment brukes oftest en metode basert på bruk av en 5-6 molar løsning av guanidinisotiocyanat som lyseringsreagens og mikroporøse silisiumoksidpartikler ("diatoméjord") som sorberer DNA-molekyler. Uspesifikke stoffer, inkludert mulige inhibitorer, vaskes deretter i en 2,5 molar løsning av guanidinisotiocyanat og en etanoloppløsning, hvoretter DNA-molekylene desorberes i vann, og disse prøvene brukes til å utføre PCR. For å forenkle teknologien for DNA-utvinning erstattes ofte "diatoméjord" av magnetiske mikropartikler belagt med silisiumoksid. I dette tilfellet brukes et spesielt magnetisk stativ for mikrorør for å utfelle partiklene i stedet for sentrifugering.

En original metode for immunomagnetisk separasjon av mykobakterier med påfølgende ekstraksjon av patogen-DNA er utviklet i Russland. For immunomagnetisk separasjon av tuberkulosemykobakterier brukes ferropartikler på 3–5 μm i størrelse, belagt med silisiumoksid, hvortil polyklonale (kanin) antistoffer mot tuberkulosemykobakterier er festet ved hjelp av en kjemisk binding. Sputumprøver nøytraliseres etter alkalisk lysis med en sur Tris-HCl-løsning og inkuberes med et immunomagnetisk sorbent. Deretter samles immunferropartiklene opp ved hjelp av en magnetisk stang med utskiftbar spiss, overføres til et mikrorør og utfelles. 20–30 μl av en 2 % Triton X-100-løsning tilsettes og varmes opp i 30 minutter ved 90 ^° C. Supernatanten brukes som DNA-matrise for PCR-analyse.

Et vanskelig problem er utvinning av tuberkulose-mykobakterie-DNA fra biopsiprøver. For biopsilyse brukes enzymet proteinase K i en sluttkonsentrasjon på 200–500 mg/l ved en temperatur på 56 ^° C over natten. Deretter ekstraheres det ved hjelp av en av de kjente metodene. Overskudd av uspesifikt DNA i PCR-analyse av biopsiprøver forårsaker ofte hemming av reaksjonen, noe som krever gjentatt DNA-utvinning.

Metoder for resultatdeteksjon

Etter at reaksjonen er fullført, identifiseres de amplifiserte fragmentene av patogen-DNA ved hjelp av ulike metoder.

Gelelektroforesemetoden er velkjent. I dette tilfellet identifiseres det oppnådde DNA-fragmentet ved hjelp av en positiv kontroll som inneholder det ønskede spesifikke DNA-fragmentet, eller ved hjelp av en på forhånd kjent størrelse (antall nukleotidpar) på fragmentet, som bestemmes ved hjelp av en standard molekylær markør.

I nærvær av et spesifikt fargestoff - etidiumbromid, som er inkludert i dobbeltstrenget DNA, avsløres det syntetiserte DNA-fragmentet som et bånd som lyser under påvirkning av ultrafiolett lys.

Størrelsen på DNA-fragmentet, bestemt ved elektroforese basert på tilbakelagt avstand fra starten, må tilsvare en kjent molekylvektmarkør eller positiv kontroll.

Andre metoder for å bestemme PCR-resultater er basert på hybridisering av enkelttrådete PCR-produkter med et komplementært oligonukleotid – en DNA-probe merket med biotin, etterfulgt av deteksjon ved hjelp av en enzymatisk reaksjon ved for eksempel å binde et streptavidin-alkalisk fosfatase-konjugat til biotin.

Basert på denne typen deteksjon er det laget PCR-analysatorer der deteksjonen av PCR-resultater utføres automatisk som et resultat av å lese den optiske tettheten i prøver etter at den enzymatiske reaksjonen har skjedd.

Ulempene med disse metodene inkluderer muligheten for intralaboratoriekontaminering med ganske korte fragmenter av DNA-molekyler. Når disse molekylene kommer inn i nylig testede prøver, blir de en matrise for PCR og fører til falskt positive resultater.

I denne forbindelse, for å forhindre falskt positive resultater, innføres det strenge regler for å separere og isolere rom: for DNA-ekstraksjon fra biologiske prøver; rom for deteksjon av resultater (elektroforese) fra den rene sonen. Disse rommene representerer en sone med sannsynlig forurensning. En annen isolert sone er et rent rom for å introdusere DNA-prøvene som studeres i reagensrør med reaksjonsblandingen for PCR. Og til slutt antas det at hovedenheten - DNA-forsterkeren - skal tas ut til et separat, muligens kontorrom.

For å forhindre kontaminering av produkter fra tidligere reaksjoner – amplikoner – inneholder noen PCR-testsystemer deoksynukleosid uridin i stedet for deoksynukleosid tymidin, som bygges opp i den tilsvarende posisjonen under in vitro-kjedesyntese, dvs. at den nitrogenholdige basen tymin som finnes i nativt DNA erstattes av uracil. Uracil-DNA-glykosylase tilsatt reaksjonsblandingen av det analyserte materialet ødelegger bare kontaminerende fragmenter med deoksyuridin, men ikke det native analyserte DNAet som inneholder deoksytymidin. Etterfølgende oppvarming ved 94 ^° C inaktiverer dette enzymet og forstyrrer ikke amplifiseringen i PCR.

Det finnes et testsystem basert på isotermisk amplifisering av rRNA, hvor revers transkripsjon og syntese av DNA-molekyler først utføres, som igjen danner matrisen for påfølgende syntese av RNA-molekyler. RNA-amplikoner detekteres ved hjelp av en akridinfarget DNA-probe under hybridisering i en reaksjonsrørløsning. Denne metoden har, i tillegg til høy følsomhet, fordelen av å utføre analysen i ett rør, noe som forhindrer kontaminering. Ifølge forfatterne når følsomheten til denne metoden i respiratoriske prøver 90 % med en spesifisitet på 99–100 %.

Nye deteksjonsmetoder implementeres i sanntids-PCR. Disse metodene skiller seg hovedsakelig ved at PCR og deteksjon av resultatene utføres samtidig i ett lukket reagensrør. Dette forenkler ikke bare analysemetoden teknologisk, men forhindrer også kontaminering av laboratorielokaler og prøver med produkter fra tidligere PCR.

I sanntids-PCR detekteres resultater ved fluorescens som oppstår fra hybridisering av en fluorogen DNA-probe med et spesifikt DNA-fragment amplifisert under PCR. Strukturen til fluorogene DNA-prober er konstruert på en slik måte at den fluorescerende markøren frigjøres som et resultat av en enzymatisk reaksjon eller distanserer seg fra fluorescensslukkingsmolekylet bare ved spesifikk hybridisering med det ønskede DNA-molekylet amplifisert under PCR. Etter hvert som antallet molekyler hybridisert med proben øker, er økningen i fluorescens til et detekterbart nivå proporsjonal med antallet molekyler av det amplifiserte produktet. Siden antallet DNA-fragmentmolekyler dobles i løpet av hver PCR-syklus, er syklusantallet som fluorescens detekteres og øker fra omvendt proporsjonal med antallet DNA-molekyler i den opprinnelige prøven. Hvis flere forskjellige kjente konsentrasjoner av molekyler av det tilsvarende fragmentet av tuberculosis mycobacterium DNA introduseres i reaksjonen som en kalibrator, kan antallet DNA-genomer i materialet som studeres beregnes ved hjelp av et dataprogram.

Hver standardprøve dupliseres. Det kvantitative kriteriet er minimum antall PCR-sykluser som kreves for at detekterbar fluorescens skal starte og vokse. Abscisseaksen er antall sykluser; ordinataksen er fluorescensverdien. DNA-konsentrasjoner er omvendt proporsjonale med antall sykluser som kreves for at fluorescens skal oppstå. Vinduene i høyre kolonne (21-32) viser syklustallene for de tilsvarende konsentrasjonene. Forskjellene mellom 10-ganger konsentrasjoner av DNA-fragmenter 10 ² - 10 ⁶ ml er 3,2-3,4 sykluser. For to pasienter var konsentrasjonene av IS6110-fragmenter omtrent 10 ³ /ml og 10 ⁴ /ml. Når man tar hensyn til antall repetisjoner (6-20) av de analyserte fragmentene i genomet til Mycobacterium tuberculosis, er antallet Mycobacterium tuberculosis i de kliniske prøvene henholdsvis omtrent 100 og 1000 celler.

Anvendelse av PCR i diagnostisering av tuberkulose

PCR-metoden brukes i størst grad for rask diagnose av tuberkulose - påvisning av Mycobacterium tuberculosis i kliniske prøver: sputum, bronkialvask, pleuraekssudat, urin, cerebrospinalvæske, osteolysepunksjoner, aspirater fra kvinnelige kjønnsorganer og ulike biopsier. I en studie i Holland med omtrent 500 prøver av sputum og bronkialvask fra 340 pasienter med en bekreftet diagnose av lungetuberkulose, ble den komparative sensitiviteten til PCR-, kultur- og smearmikroskopimetodene studert. Analysens sensitivitet var henholdsvis 92,6, 88,9 og 52,4 %. Spesifisiteten til alle metodene var omtrent 99 %.

Det ble gjort en sammenligning av effektiviteten av påvisning av Mycobacterium tuberculosis ved bruk av smearmikroskopi, såing på Lowenstein-Jensen-medium, VASTES-testsystemet og PCR-analyse. PCR viste en sensitivitet på 74,4 %, mikroskopi - 33,8 %, såing på fast medium - 48,9 % og VASTES - 55,8 %. Gjennomsnittlig deteksjonstid for såing på Lowenstein-Jensen-medium er 24 dager. VASTES - 13 dager, PCR - 1 dag.

Potensialet for å bruke PCR som en sensitiv og rask metode for å overvåke effektiviteten av tuberkulosebehandling diskuteres også.

Påvisning av Mycobacterium tuberculosis-DNA ved PCR-metoden med effektiv cellegift bestemmes over en lengre tidsperiode – i gjennomsnitt 1,7 måneder sammenlignet med bakteriell utskillelse bestemt ved fluorescensmikroskopi, og 2,5 måneder sammenlignet med bakteriologisk undersøkelse.

Diagnose av ekstrapulmonale former for tuberkulose

PCR er spesielt viktig som en sensitiv metode for ekstrapulmonale former, siden det er nettopp i disse formene at kliniske og radiologiske metoder og tradisjonelle bakteriologiske metoder for å bestemme Mycobacterium tuberculosis i diagnostiske materialer er ineffektive.

Ved undersøkelse av urinprøver var resultatene av PCR-analysen positive hos 16 av 17 pasienter med aktiv tuberkulose i urinveiene og negative hos 4 pasienter med inaktiv nyretuberkulose og 39 pasienter med ikke-tuberkuløse sykdommer i urinveiene.

Effektiviteten av PCR-analyse i studien av benmargsaspirater hos pasienter med feber av ukjent genese med mistanke om tuberkuløs sykdomsart ble demonstrert. For diagnostisering av tuberkuløs lymfadenitt hos barn ble 102 punkteringsaspirater og biopsiprøver fra 67 barn med mistanke om tuberkuløs lymfadenitt studert. Positive resultater ble oppnådd: ved sanntids-PCR - 71,6 %, fluorescensmikroskopi - 46,3 %, kulturstudie - 41,8 %. I studien av 50 lymfeknutebiopsier hos pasienter med katteklorsykdom var alle resultatene negative. Dermed ble 100 % spesifisitet av PCR-analysen demonstrert. I samme arbeid ble muligheten for å påvise M. avium vist i punkteringsbiopsi av lymfeknuter.

Diagnostisering av kvinnelig genital tuberkulose ved infertilitet er kjent for å være et av de vanskeligste diagnostiske problemene. Positive resultater ble oppnådd i PCR-studier av endometriebiopsier, endometrieaspirater og Douglas-posevæskeprøver hos 14 (56 %) av 25 pasienter undersøkt laparoskopisk med mistenkt tuberkulose. Smearmikroskopi og kulturstudier ga henholdsvis 1 og 2 positive resultater. Disse tilfellene var også PCR-positive. De fleste PCR-positive resultatene var i tilfeller med karakteristiske trekk ved tuberkulose ifølge histologisk undersøkelse; et mindre antall var i tilfeller med mistenkt tuberkulose ifølge laparoskopi. Kun ett positivt PCR-resultat ble oppnådd i mangel av laparoskopiske data for tuberkulose.

Ved diagnostisering av ekstrapulmonale former for tuberkulose har klinikere ofte spørsmål om muligheten for å identifisere patogenet når de undersøker blodprøver ved hjelp av PCR-metoden. Litteraturdata indikerer at deteksjon av Mycobacterium tuberculosis-DNA fra blodprøver er mulig ved avanserte former for HIV-infeksjon. Mycobacterium tuberculosis-DNA ble kun påvist ved generalisert tuberkulose i ulike organer hos pasienter med transplantert nyre og immunsuppresjon.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Artsidentifikasjon av mykobakterier

PCR-metoden kan være ganske effektiv for rask identifisering av mykobakterier i tuberkulosekomplekset og noen typer ikke-tuberkuløse mykobakterier etter å ha oppnådd primærvekst. I dette tilfellet kan bruk av PCR spare 7–10 dager som kreves for påfølgende kulturidentifisering av et positivt resultat. PCR-studien er teknisk sett veldig enkel, siden den ikke krever kompleks prøvepreparering av klinisk materiale for å oppnå høy sensitivitet. Ved undersøkelse av 80 positive kulturer i et slikt testsystem (MB BacT. fra Organon), var alle positive PCR-analyseresultater strengt spesifikke og ble utført innen 1 dag. For å identifisere andre typer mykobakterier når de oppnås i kultur, hybridiseres patogen-DNA med spesifikke DNA-prober merket med akridin, og stammene detekteres ved forekomst av kjemiluminescens ved bruk av et kjemiluminometer eller på nitrocellulosestrimler med visuell vurdering etter hybridisering. Dette settet identifiserer et begrenset antall arter: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii og M. gordonae.

A. Telenti et al. utviklet også en relativt enkel og rimelig metode for artsidentifikasjon av klinisk viktige mykobakterier basert på PCR og påfølgende behandling med to restriksjonsenzymer (enzymer som har evnen til å kutte et DNA-molekyl på bestemte punkter). I dette tilfellet amplifiseres et DNA-fragment som koder for et varmesjokkprotein (65 kDa), hvoretter DNA-fragmentet oppnådd i PCR, 439 nukleotidpar i størrelse, behandles separat med to enzymer - Bste II og Нае III. Deretter, ved hjelp av agarosegelelektroforese, analyseres de to oppnådde produktene, og størrelsene deres (antall nukleotidpar) bestemmes ved hjelp av et sett med standard DNA-fragmenter (molekylære DNA-markører) fra 100 til 1000 nukleotidpar i lengde. I hver av de definerte artene (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) finnes 2 eller 3 DNA-fragmenter av forskjellige størrelser for hvert restriksjonsenzym. Kombinasjonen av de resulterende DNA-fragmentene av forskjellige størrelser gjør det mulig å differensiere disse artene fra hverandre.

En teknologi for biologiske DNA-mikroarrayer er under utvikling som vil bidra til å identifisere mer enn 100 arter av mykobakterier i én enkelt studie.

Artsidentifikasjon kan også utføres ved hjelp av PCR-amplifisering av den variable regionen av 16S rRNA etterfulgt av sekvensering av amplikonene i sammenligning med den tilsvarende primærstrukturen, noe som tillater identifisering av mer enn 40 arter av mykobakterier.

PCR kan også brukes til å identifisere arter innenfor tuberculosis mycobacterium-komplekset, inkludert differensiering mellom M. bovis og M. bovis BCG. Dette gjøres ved å analysere tilstedeværelsen eller fraværet av visse gener i de genomiske regionene RD1, RD9 og RD10. RD1 er fraværende i M. bovis BCG, men er tilstede i virulente arter, inkludert M. bovis.

Bestemmelse av medikamentfølsomhet for Mycobacterium tuberculosis ved bruk av PCR

Oppgavene til molekylærgenetiske metoder for å bestemme medikamentfølsomhet eller resistens hos Mycobacterium tuberculosis er redusert til å identifisere mutasjoner i visse nukleotidsekvenser av kjente gener. Hovedmetodene er basert enten på direkte avlesning (sekvensering) av disse sekvensene etter amplifisering, eller på hybridisering av biotinmerkede DNA-fragmenter amplifisert under PCR med DNA-prober. Begge alternativene innebærer å identifisere substitusjoner i nukleotidsekvenser som, når DNA-prober brukes, fører til fravær eller ufullstendig hybridisering på en nitrocellulosemembran ved bruk av et enzymkonjugat (streptavidin-alkalisk fosfatase) - LIPA-Rif-TB-metoden.

Metoden for å måle fluorescens i lokalt fikserte DNA-prober på mikroregioner komplementære til kjente mutasjoner i PCR-amplifiserte genregioner som er ansvarlige for medikamentfølsomhet eller resistens kalles mikrobiochipsmetoden. Den grunnleggende algoritmen for å utføre denne studien er som følger. Etter at DNA er isolert fra en klinisk prøve eller mykobakteriell kultur, må PCR utføres for å amplifisere de tilsvarende fragmentene av groB-genet som er ansvarlig for medikamentfølsomhet for rifampicin, eller katG- og inhA-genene som koder for mykobakterielle proteiner som er ansvarlige for følsomhet for isoniazid. PCR-resultatene vurderes ved hjelp av agarosegelelektroforese, som bekrefter mottak av de tilsvarende DNA-fragmentene av ønsket lengde. Deretter utføres en andre runde med PCR for å introdusere en fluorescerende markør i DNA-et. PCR-resultatene bekreftes igjen ved gelelektroforese. Etter dette utføres hybridisering (inkubasjon over natten) med påfølgende vasking av det oppnådde materialet på en biochip, som er et stort antall korte DNA-kjeder (prober) festet på en liten glassplate, komplementære til nukleotidsekvensene til den medikamentfølsomme typen tuberkulosemykobakterier på punktene for mulige mutasjoner, samt til mutantsekvenser som er ansvarlige for medikamentresistens. Plasseringen av DNA-probene på platen er strengt definert, og fluorescensnivået som observeres under hybridisering for å bestemme resultatet ved hjelp av en spesiell avlesningsenhet etableres. I denne forbindelse bestemmes analyseresultatene ved hjelp av et spesielt dataprogram.

I de senere år har alternative metoder for å bestemme medikamentfølsomheten til Mycobacterium tuberculosis blitt utviklet basert på sanntids-PCR-teknologi, noe som gjør at disse studiene kan utføres i en lukket reagensrørsmodus.

Figur 13-13 viser resultatet av analysen av kliniske kulturer av Mycobacterium tuberculosis for å bestemme medikamentresistens mot rifampicin ved bruk av sanntids-PCR: 218 - kontrollprøve (følsom for rifampicin); 93 - positiv kontroll for Ser-Trp TCG-TGG-mutasjonen; 4482 - positiv kontroll for Ser-Leu TCG-TTG-mutasjonen; 162-322 - eksperimentelle prøver. Resultatet av beregning av kinetiske amplifiseringskurver for 4 kanaler: kanal 1: 393 - positiv kontroll for Ser-Trp TCG-TGG-mutasjonen; kanal 2: 4482 - positiv kontroll for Ser-Leu TCG-TTG-mutasjonen; 162, 163, 172, 295 - eksperimentelle prøver; kanal 4: kinetiske amplifiseringskurver for alle prøver som deltar i eksperimentet. Positiv kontroll av amplifiseringsreaksjonen. Konklusjoner: Analysen avdekket følgende mutasjoner som bestemmer resistens mot rifampicin: i prøvene 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Det samme prinsippet ble brukt for å bestemme medikamentresistens mot isoniazid av katG- og inhA-genene, som bestemmer de hyppigste mutasjonene.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Stammeidentifikasjon av Mycobacterium tuberculosis

Den mest studerte metoden for stammeidentifikasjon av Mycobacterium tuberculosis er en teknologi kalt restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP), som er basert på fragmentering (restriksjon) av Mycobacterium tuberculosis-DNA av enzymet Pvu II og påfølgende hybridisering av de oppnådde fragmentene med visse spesifikke sekvenser på DNA-et til dets repetisjonselement IS6110. Intraspesifikk variasjon oppnås på grunn av det forskjellige antallet IS6110-repetisjoner og deres plassering på DNA-et, samt variasjonen i avstander mellom visse angrepspunkter for restriksjonsenzymet (restriksjonssteder) og IS6110-elementet. Denne teknologien er svært kompleks og arbeidskrevende. Etter behandling av DNA-et isolert fra tuberculosis-mycobacterium-kulturen med restriksjonsenzym, utføres gelelektroforese, deretter overføres DNA-fragmenter av forskjellige lengder til en nitrocellulosemembran, hybridiseres med fragmenter av IS6110-elementet, og resultatene detekteres ved hjelp av en enzymatisk reaksjon. Det resulterende spesifikke båndmønsteret karakteriserer DNA-et til en spesifikk tuberculosis-mycobacterium-stamme. Datamaskinanalyse avslører identiteten eller slektskapet mellom stammene. Til tross for at RFLP-metoden er den mest diskriminerende, dvs. den avslører det største antallet forskjeller i de analyserte stammene, er den ineffektiv med et lite antall (mindre enn 5) IS6110-repetisjoner, observert i noen stammer. Figur 13-14 viser resultatene av RFLP-typing av stammene.

Et alternativ kan være spoligotypingmetoden – analyse av polymorfismen til spacer-DNA-sekvenser – mellom direkte repetisjoner av DR-regionen. Ved spoligotyping av stammer utføres PCR med primere som begrenser DR-regionen, hvoretter fragmenter av ulik lengde dannes, som hybridiserer med variable mellomliggende DNA-regioner. Analyse av spacer-sekvenser av DR-regionen virker, ifølge forskere, enklere, mer produktiv og egnet for primær screening av stammer og foreløpig epidemiologisk analyse, samt for å studere klinisk materiale direkte.

En mer effektiv og teknologisk tilgjengelig metode er åpenbart VNTR (forkortelse av engelske ord), eller metoden for å bestemme det variable antallet eksakte tandemrepetisjoner i DNA-et til Mycobacterium tuberculosis. Denne metoden er kun basert på bruk av PCR og krever ikke ytterligere manipulasjoner. Siden antallet tandemrepetisjoner i forskjellige stammer og i forskjellige loci er forskjellig, bestemmes og analyseres fragmenter av forskjellige størrelser på det resulterende elektroforegrammet av PCR-produkter. Ifølge forskere oppnås en større grad av skille mellom stammer ved hjelp av VNTR enn med RFLP-metoden.

De siste årene har det blitt viet mye oppmerksomhet til spredningen av stammer av Mycobacterium tuberculosis av W-Beijing-familien (noen ganger kalt Beijing-stammen), som i stor grad er medikamentresistente.

Grunnleggende krav til kvaliteten på molekylærbiologisk forskning

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

De viktigste regulatoriske dokumentene for gjennomføring av PCR

Forskrifter fra Helsedepartementet i Den russiske føderasjon: Nr. 45 av 7.02.2000; Nr. 109 av 21.03.2003; Nr. 64 av 21.02.2000. Retningslinjer: 1.3.1888-04 "Organisering av arbeid under PCR-undersøkelse av materiale infisert med patogene biologiske agenser i III-IV patogenitetsgrupper"; 1.3.1794-03 "Organisering av arbeid under PCR-undersøkelse av materiale infisert med mikroorganismer i I-II patogenitetsgrupper". 2003; 3.5.5.1034-01 "Desinfeksjon av testmateriale infisert med bakterier i patogenitetsgruppene I-IV ved arbeid med PCR-metoden", 2001. Vedlegg 11 til instruksjonene om enhetlige metoder for mikrobiologisk forskning i påvisning, diagnose og behandling av tuberkulose.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personale

Molekylærbiologiske studier kan utføres av kliniske laboratoriediagnostiker, bakteriologer, virologer, klinisk diagnostiske laboratoriebiologer, samt spesialister med videregående medisinsk utdanning som har gjennomgått spesialisering og videreutdanning på etablert måte.

Arrangering av laboratorielokaler

Følgende laboratoriefasiliteter er nødvendige:

• Prøvebehandlingsområde - et laboratorium tilpasset arbeid med smittestoffer i patogenitetsgruppene III-IV, i samsvar med metodologiske retningslinjer 13.1888-04.
• Området for å tilberede PCR-reaksjonsblandinger er et laboratorierom som gir beskyttelse mot intern laboratoriekontaminering – et «rent» område.
• • Hvis elektroforese eller hybridisering brukes til å analysere PCR-produkter, må laboratorierommet der de amplifiserte DNA-fragmentene ekstraheres fra amplifiseringsrøret og dermed kan komme inn i miljøet, i samsvar med kravene til PCR-laboratorier (metodologiske retningslinjer 1.3.1794-03, metodologiske retningslinjer 1.3.1888-04) være fullstendig isolert fra rommene spesifisert i de foregående avsnittene. Bevegelse av personell, utstyr, materialer og gjenstander fra elektroforeseområdet til prøvebehandlingsområdet og det «rene» området, samt luftoverføring gjennom ventilasjonssystemet eller som følge av trekk, må utelukkes. Dette området er ikke nødvendig for fluorimetrisk deteksjon av PCR-produkter.
• Rommet for dokumentasjon og behandling av resultater er utstyrt med datamaskiner og nødvendig kontorutstyr. Dette rommet kan inneholde utstyr som sikrer deteksjon av PCR-produkter uten å åpne røret. - fluorescerende PCR-detektorer og termiske syklere for sanntids-PCR.

Sanitære og epidemiologiske krav for primærbehandling av sputum ligner på de standard mikrobiologiske kravene for arbeid med Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Komplett sett med laboratorieutstyr for PCR-diagnostikk

Laboratoriesettet inneholder utstyr til følgende rom.

• Prøveforberedelsesrom, inneholder følgende utstyr: laminærstrømningshette av beskyttelsesklasse II "SP-1.2": faststofftermostat med oppvarmet lokk for Eppendorf-reagensrør; mikrosentrifuge ved 13 000 o/min; sentrifuge ("Vortex"); kjøleskap med temperaturområde fra -20 ^° C til +10 ^° C; pipetter med variabelt volum i "Proline"-serien; pumpe med fangelkolbe OM-1; pipettestativ; arbeidsstasjonstativ 200x0,5 ml; arbeidsstasjonstativ 50x1,5 ml; stativer for oppbevaring av reagensrør 80x1,5 ml;
• Rom for tilberedning av reaksjonsblanding: PCR-boks med beskyttelseskammer ("Laminar-C. 110 cm); sentrifuge "Vortex"; pipetter med variabelt volum i "Proline"-serien; pipettestativ; arbeidsstasjonsstativ 200x0,2 ml; stativer for oppbevaring av reagensrør 80x1,5 ml; kjøleskap med temperaturområde fra -20 ^° C til +10 ^° C;
• Elektroforeserom: horisontalt elektroforesekammer; strømkilde; transilluminator;
• DNA-forsterker eller nukleinsyreanalysator (sanntids-PCR) med datamaskin og programvare; kan plasseres i ethvert tilgjengelig rom. Hvis sanntids-PCR-teknologi brukes, er det ikke nødvendig med et elektroforeserom.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Ekstern kvalitetskontroll

For å sikre at de oppnår objektivt pålitelige resultater, må laboratoriene delta i et system for ekstern vurdering av kvaliteten på laboratorieforskningen.

Deltakerne i kvalitetskontrollsystemet mottar: 12 ampuller med frysetørkede suspensjoner av bakterieceller, hvorav to inneholder E. coli, 3 ampuller med tuberkulosemykobakterier (avirulent stamme) i en konsentrasjon på 10 ² /ml; 3 ampuller med celler av en lignende stamme i en konsentrasjon på 10 ⁴ /ml; 2 ampuller hver med ikke-tuberkuløse mykobakterier M. avium-intracellulare og M. kansasii i en konsentrasjon på 10 ⁵ /ml.

Testene som sendes ut for ekstern kvalitetsvurdering forhåndstestes i to uavhengige laboratorier med lang erfaring på dette feltet.

[ 85 ], [ 86 ]