Hematopoietiske stamceller

Hematopoetiske stamceller (HSCs) som mesenchymale stamceller som er kjennetegnet ved multipotency og gir opphav til cellelinjer, endelige elementer som danner blodceller og noen spesialiserte vev celler i immunsystemet.

Hypotesen om at det foreligger en felles stamfar av alle blodceller, såvel som uttrykket "stamcelle", som eies av A. Maximov (1909) Potensialet dannelse av cellemasse fra GSK stort -. Benmarg stamceller produsere den 10. Dagen cellene som utgjør blodlegemene i det perifere selv. Eksistensen av hematopoetiske stamceller ble etablert i 1961 i forsøk på gjenoppretting av hematopoesen i mus som mottok en dødelig dose av stråling som ødelegger benmargsstamceller. Pos dvs. Transplantasjon av syngene benmargcellene som er letalt bestrålte dyr ble detektert atskilte foci av hematopoese i milten hos mottakere som har kilde - enkelt klonogene progenitorceller.

Derpå ble evnen til hematopoietiske stamceller til selvhjelp demonstrert, noe som gir funksjonen til hematopoiesis under ontogenese. I prosessen med embryonisk utvikling karakteriseres HSCs av høy migreringsaktivitet, som er nødvendig for deres migrering til steder i hematopoietiske organer. Denne egenskapen til HSCs beholdes også i ontogenese - på grunn av deres konstante migrasjon, finner en permanent fornyelse av bassenget av immunokompetente celler sted. Evnen av GSK migrasjon, penetrering gjennom blod-vev-barrierer, implantasjon i vev-vekst og klonogen ga grunnlag for benmargstransplantasjon celler i en rekke sykdommer forbundet med forstyrrelser i det hemopoetiske system.

Som alle stamcelle ressurser, hematopoetiske stamceller er til stede i en nisje (benmarg) i meget små mengder, noe som fører til visse vanskeligheter i sin tildeling. Immunophenotypic humane HSCs er karakterisert som CD34 + NK-celler er i stand til å migrere inn i blodet og kolon organer av immunsystemet eller for å repopulere benmargen stroma. Det er nødvendig å forstå at GSK er ikke de mest umodne benmargceller, og er avledet fra forløpere som inkluderer dormantnye fibroblast SB34-negative celler. Det ble funnet at cellene med fenotypen av CD34 er i stand til å gå inn i blodbanen, hvor endrer deres fenotype i CD34 +, men returvandringen i benmargen under påvirkning av mikromiljøet igjen bli CD34-negative stammen celleelementer. I hvile ~ CD34-cellene ikke svare på parakrine regulatoriske signaler stroma (vekstfaktorer, cytokiner). Imidlertid, i situasjoner som krever forsterkning intensitets hematopoetiske stamceller med fenotypen CD34 svare på differensieringssignaler danne både hematopoietiske og mesenkymale progenitorceller. Hematopoiesis utføres ved direkte kontakt med GSK-cellulære elementer av benmargstroma presentert et komplekst nettverk av makrofager, retikulære endoteliale celler, osteoblaster, stromale fibroblaster og ekstracellulær matriks. Stromale benmargs rammeverk - ikke bare en matrise eller "skjelett" for hematopoietisk vev, bærer det finregulering av hematopoesen grunn av parakrine regulerende signaler av vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner, og gir også adhesive interaksjoner som er nødvendige for dannelsen av blodceller.

Dermed er grunnlaget for det stadig oppdaterte hemopoiesis-systemet en hemopoietisk stamcelle, som er i stand til langvarig selvvedlikehold. Under prosessen med å begå, gjennomgår HSCs primær differensiering og danner kloner av celler som avviger i deres cytomorfologiske og immunfenotypiske egenskaper. Den påfølgende dannelse av primitive og engasjerte stamceller blir fullført ved dannelsen av morfologisk identifiserbare forfedceller av forskjellige hematopoietiske linjer. Resultatet av den etterfølgende trinn komplisert flertrinnsprosess er modningen av hematopoetiske celler og modne utbytte til perifert blod dannede elementer - erytrocytter, leukocytter, lymfocytter og blodplater.

[1], [2], [3], [4], [5]

Kilder til hematopoietiske stamceller

Blodkreft stamceller er ansett som den mest studerte stammen kilde, som i stor grad skyldes deres bruk i klinikken av benmargstransplantasjon. Ved første øyekast er det mye kjent om disse cellene. Til en viss grad dette er sant, fordi de mellomliggende og modne etterkommere GSK - den mest rimelige cellulære elementer, som hver for seg (erytrocytter, leukocytter, lymfocytter, monocytter / makrofager og blodplater) er grundig studert ved alle nivåer - fra lys og elektronmikroskopi, av biokjemiske og immunofenotype egenskaper før identifisering ved PCR analyse. Imidlertid overvåkingen utføres ved morfologiske, ultra, biokjemiske, immunophenotypic, og biofysiske parametre av genomisk GSK har ikke gitt svar på mange problemstillinger, og er nødvendig for utvikling av celletransplantasjon og løsningen av dette. Det er fortsatt ikke etablert stabiliseringsmekanismer GSK i sovende tilstand, de er aktivert, entre scenen av symmetrisk eller asymmetrisk divisjon, og aller viktigst - av forpliktelse til utdanning som funksjonelt forskjellige blodlegemer, erytrocytter, leukocytter, lymfocytter, og blodplater.

Nærværet i benmargceller med fenotypen av CD34, som er aner på både mesenchymale og hematopoetiske stamceller har reist spørsmål om eksistensen av den første i nærheten av CD34-negative celler i stamcelledifferensiering og hematopoetisk stromal linje. Langvarig dyrking metode ble oppnådd ved den såkalte langtidskultur "initiere 'celler (langtidskultur-initierende celle - LTC-IC). Levetiden for slike progenitor celler i kolonidannende aktivitet av stromale benmargs basert på en kombinasjon av vekstfaktorer er mer enn 5 uker, mens levedyktigheten av engasjerte kolonidannende enheter (CFU) i kulturen av bare 3 uker. Det antas for tiden at den LTC-IC - funksjonell analog GCW som repopulyatsionnom på et høyt potensial på omtrent 20% LTC-IC er kjennetegnet ved en fenotype CD34 + CD38- og utviser en høy evne til selvfornyelse. Slike celler som finnes i human benmarg med frekvensen til 1:50 000. Imidlertid skal man være klar limfoidoinitsiiruyuschie-myeloide celler nærmest HSC som oppnås under betingelser for langvarig (15 uker) fra kulturen. Slike celler betegnes som LTC, blant humane benmargceller er funnet i 10 ganger mindre enn den LTC-IC, og er utformet som et myeloide cellelinjer og lymfoide hemopoietisk stilk.

Selv om det hematopoetiske stamceller merking med monoklonale antistoffer, etterfulgt av identifikasjon av immunophenotypic er den viktigste metoden for å identifisere og selektiv sortering av hematopoetiske stamceller med den potensielle kliniske anvendelse av dedikerte GSK således begrenset. Blokkering av CD34-reseptor-antistoffer eller andre markerings antigener i løpet av sortering av immunpositive uvegerlig endrer egenskapene celler isolert med den. Mer foretrukket er den immuno-negative sekresjon av HSC på magnetiske kolonner. Imidlertid brukes i dette tilfelle som monoklonale antistoffer fastgjort på en metallbærer for sortering. I tillegg er det viktig at begge metoder for isolering av HSC er basert på fenotypisk, og ikke på funksjonelle egenskaper. Derfor er det mange forskere foretrekker å bruke analyse av klonogene parametre GSK, noe som gjør at størrelsen og sammensetningen av koloniene for å bestemme den grad av modenhet og retning av differensiering av progenitorceller. Det er kjent at i prosessen med å begå antall celler og antallet av deres typer i kolonien minker. Stamcelle og dets dattercelle tidlig, kalt "granulocytt-erytrocytt monocytt-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya enhet" (SFU-GEMM), skape en kultur multilinear store kolonier som inneholder, henholdsvis, granulocytter, erytrocytter, monocytter og megakaryocytter. Som ligger under linjen granulocyt-forpliktelse avstamning monotsitokolonieobrazuyuschaya enhet (SFU-GM) genererer kolonier av granulocytter og makrofager, og granulocytiske kolonidannende enheter (SFU-G) - bare små kolonier av modne granulocytter. Tidlig erytrocytt forgjenger - burstoobrazuyuschaya enhet av røde blodlegemer (SFU-E) - er en kilde for stor og mer moden røde blodceller kolonidannende enhet (SFU-E) - små røde blodcellekolonier. I den generelle befolkning, og veksten av celler i halvfaste medier kan identifisere celler som danner seks typer av myeloid-kolonier: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E og E-SFU).

Imidlertid inneholder i tillegg til hematopoietiske derivater et hvilket som helst kildemateriale for separasjonen av HSC et signifikant antall samtidige celler. I denne sammenheng er en forutgående rensing av transplantasjonen først og fremst av de aktive cellene i immunsystemet til donoren nødvendig. Vanligvis brukes immunoseksjon basert på lymfocyttuttrykk av spesifikke antigener for dette, noe som gjør det mulig å isolere og fjerne dem ved bruk av monoklonale antistoffer. I tillegg er en teknikk immunorozetochnaya T-lymfocytt-utarmet benmargstransplantasjon, som er basert på dannelse av komplekser av CD4 + lymfocytter og spesifikke monoklonale antistoffer fjernes effektivt ved hjelp av aferese. Denne teknikken gir et renset cellemateriale med 40-60% hematopoietiske stamceller.

Økning av antall stamceller som på grunn av fjerning av modne blodceller fra et leukaferese produkt oppnås ved motstrømssentrifugering etterfulgt av filtrering (i nærvær av chelator - trinatriumcitrat) gjennom en kolonne inneholdende nylonfibre belagt med human immunoglobulin. Den sekvensielle anvendelse av disse to teknikkene gir den fullstendige rensing av transplantatet fra blodplater med 89% - av erytrocytter og med 91% - fra leukocytter. På grunn av den betydelige reduksjon i tap GSK nivået av CD34 + celler i total cellemasse kan økes til 50%.

For funksjonelle egenskaper hos isolerte hematopoietiske stamceller, brukes deres evne til å lage kolonier av modne blodelementer i kultur. Analyse av de dannede koloniene gjør det mulig å identifisere og kvantifisere typen av stamceller, graden av deres forpliktelse og å etablere retningen for deres differensiering. Klonogen aktivitet bestemmes i halvfast medium på metylcellulose, agar, plasma eller fibrin gel, noe som reduserer migreringsaktiviteten til celler som forhindrer at de festes til overflaten av glass eller plast. Under optimale kulturforhold utvikler kloner fra en enkelt celle innen 7-18 dager. Hvis det er mindre enn 50 celler i klonen, identifiseres det som en enkelt klynge, hvis antall celler overstiger 50 - som en koloni. Antallet celler som er i stand til å danne en koloni (kolonidannende enheter - CFU eller kolonidannende celler - COCer) tas i betraktning. Det skal bemerkes at parametrene og CFU COC ikke svarer til antallet av HSC i cellesuspensjonen, selv om det er korrelert med det igjen understreker behovet for å identifisere den funksjonelle (kolonidannende) aktivitet av HSCs in vitro.

Blant benmargen hematopoetiske stamceller har høyest proliferative potensial, for derved å danne den største i kulturen i kolonistørrelse. I henhold til antall kolonier tilbys indirekte bestemme antall stamceller. Etter dannelsen av kolonier in vitro overstiger 0,5 mm i diameter, og med det antall celler 1000, har forfatterne undersøkt stabiliteten av disse celler til subletale doser av 5-fluorouracil og undersøkt deres evne til å repopulere benmargen letalt bestrålte dyr. For disse parametrene isolerte celler nesten ikke kan skjelnes fra GSK og mottatte en forkortet symbol for HPP-CFC - kolonidannende celler med høy proliferativ potensial.

Søket etter muligheten for et mer kvalitativt utvalg av hematopoietiske stamceller fortsetter. Imidlertid hematopoetiske stamceller er morfologisk like lymfocytter og er forholdsvis ensartet samling av celler med nesten runde kjerner, kromatin og partikler slabobazofilnoy liten mengde av cytoplasma. Det nøyaktige nummeret er også vanskelig å bestemme. Det antas at GSK i beinmarg av en person opptrer med en frekvens på 1 per 106 kjerneholdige celler.

Identifikasjon av hematopoietiske stamceller

For å forbedre identifikasjon av hematopoetiske stamceller blir utført sekvensielt eller samtidig (på en flerkanals sorbitan tere) forskning membrannosvyazannyh spektrum av antigener, i hvilken GSK fenotype CD34 + CD38 bør kombineres med mangel på differensieringsmarkører lineær, spesielt antigener av immunkompetente celler slik som CD4, og overflate immunoglobuliner glykoforin.

Nesten alle ordninger av fenotyping av hematopoietiske stamceller inkluderer bestemmelsen av CD34 antigen. Dette glykoprotein med en molekylvekt på omtrent 110 kDa, som bærer flere glykosyleringsseter uttrykt på plasmacellemembran etter aktivering av gen lokalisert på kromosom 1.. Funksjonen til CD34-molekylet er assosiert med L-selektin-mediert interaksjon av tidlige hematopoietiske forløperceller med benmargstromalbase. Imidlertid bør man huske på at tilstedeværelsen av CD34 antigen på celleoverflaten kan bare foreta en foreløpig vurdering av innholdet av GSK i cellesuspensjonen, slik det uttrykkes, og andre hematopoetiske progenitorceller og stromale benmargsceller og endotelceller.

Under differensiering av hematopoietiske stamceller blir CD34-ekspresjonen permanent redusert. Erytrocyt, granulocytt og monocyttforbundne stamceller enten svak uttrykker CD34 antigen, eller det er i det hele tatt fraværende på deres overflate (fenotype CD34). På overflatemembranen av differensierte celler i beinmarg og modne blodceller blir CD34 antigen ikke detektert.

Det bør bemerkes at i dynamikken i differensieringen av hematopoetiske stamceller som ikke bare reduserer ekspresjonsnivået av CD34, men parallelt gradvis økt ekspresjon av CD38 antigen - integral membran glykoprotein med molekylvekt på 46 kDa som har NAD-glikogidrolaznoy og ADP-ribosyl cyklase-aktivitet, noe som antyder dets involvering i transport og syntese av ADP-ribose. Dermed er det mulig å dobbeltsjekke graden av forpliktelse av blodkreft stamceller. Populasjon av celler med fenotype CD34 + CD38 +, fra 90 til 99% CD34-positive benmargceller omfatter progenitorcellene med begrenset proliferativ potensial og differensiering, mens man med fenotypen CD34 + CD38 celler kan kreve rollen GSK.

Faktisk populasjonen av benmargceller, er beskrevet ved formel CD34 + CD38-, inneholder et forholdsvis stort antall av primitive stamceller som er i stand til å differensiere til myeloide og lymfoide linjer. I sammenheng med langsiktig kultivering med fenotype av CD34 + CD38- celler klarer å få alle de modne blodceller: nøytrofile, eosinofile, basofile, monocytter, megakaryocytes, erytrocytter og lymfocytter.

Relativt nylig uttrykker CD34-positive celler to merkere - AC133 og CD90 (Thy-1), som også brukes til å identifisere hematopoietiske stamceller. Thy-1-antigenet er co-uttrykt med CD117-reseptoren (c-kit) på CD34 + -celler av benmarg, navlestreng og perifert blod. Dette er et overflatefosfatidylinositolbindende glykoprotein med en molekylvekt på 25-35 kDa, som deltar i celleadhesjonsprosesser. Noen forfattere tror at Thy-1 antigenet er markøren for de mest umodne CD34-positive cellene. Selvreproducerende celler med fenotypen CD34 + Thy-1 + gir opphav til langkultiverte linjer med dannelsen av datterceller. Det foreslås at Thy-1-antigenet blokkerer de regulatoriske signaler som forårsaker at celledistribusjonen stopper. Til tross for det faktum at CD34 + Tu1 + celler er i stand til selvfornyelse og etablering av langsiktige dyrkede linjer, kan deres fenotype ikke er knyttet utelukkende til HSC, som Thy-1 + innholdet i den totale vekt av de CD34-positive celleelementer er omtrent 50%, langt overstiger den antall hematopoietiske celler.

Mer lovende for identifisering av hematopoietiske stamceller er AC133, en antigenmarkør for hematopoiesis forløperceller, hvor ekspresjonen først ble påvist på embryonale leverceller. AC133 er et transmembran glykoprotein som vises på overflaten av cellemembranen i de tidligste stadier av GSK modning - det er mulig at enda tidligere enn antigenet CD34. I studier av A. Petrenko og V. Grishchenko (2003) ble det funnet at AC133 uttrykker opptil 30% av CD34-positive celler i den embryonale leveren.

Således er den ideelle fenotypiske profilen av hematopoetiske stamceller etter dagens begreper, idet summen av cellen disposisjon i de kretser som må være tilstede for CD34-antigenene konfigurasjon, AC133 og Thy-1, men det er ikke plass for molekylær spring CD38, HLA-DR og markører lineær differensiering GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Variasjonen av fenotypisk portrett av HSC kan være en kombinasjon av CD34 + CD45RalowCD71low, siden egenskapene til cellene beskrevet ved denne formel ikke adskiller seg fra de funksjonelle parametrene til celler med fenotypen CD34 + CD38. I tillegg kan menneskelig GSK identifiseres ved fenotypiske tegn på CD34 + Thy-1 + CD38Iow / 'c-kit / low - bare 30 av disse cellene gjenoppretter helt hematopoiesis hos letisk bestrålte mus.

Fra analysen av den generelle fenotypiske egenskapene til benmargceller faktisk startet 40 år med intensiv forskning GSK samtidig i stand til både selvfornyelse og differensiering til andre cellulære elementer, slik at for å rettferdiggjøre bruken av benmargstransplantasjon for å behandle forskjellige patologier i hemopoetiske system. Nylig oppdaget nye typer stamceller har ennå ikke blitt mye brukt i klinisk praksis. Imidlertid, stamceller fra navlestreng (ledningen) blod og fosterlever i betydelig grad kan utvide celletransplantasjon ikke bare i hematologi, men også i andre områder av medisinen, som er forskjellige fra HSC benmarg som en kvantitativ ytelse og kvalitetsegenskaper.

Volumet av stammehematopoietisk cellemasse som kreves for transplantasjon, oppnås vanligvis fra benmargen, perifert og leddblod, og også fra den embryonale leveren. I tillegg kan hematopoietiske stamceller bli oppnådd in vitro ved forplantning av ESC, etterfulgt av deres retningsdifferensiering i hematopoietiske celleelementer. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) med rette påpeke vesentlige forskjeller immunologiske egenskaper og evnen til å gjenopprette hematopoiesis GSK forskjellig opprinnelse, på grunn av ulik-forhold som finnes i deres kilder til pluripotente tidlige og senere utsatte progenitorceller. I tillegg har hematopoietiske stamceller avledet fra forskjellige stamkilder helt forskjellige sammensetninger av ikke-hemopoietiske celler kvantitativt og kvalitativt.

En tradisjonell kilde til hematopoietiske stamceller er benmarg. En suspensjon av benmargceller er oppnådd fra bukbenet eller brystbenet ved utvasking under lokalbedøvelse. Suspensjonen som er oppnådd på denne måten er heterogen og inneholder en blanding av HSC, stromalcelleelementer, forpliktede stamceller fra myeloid- og lymfoidlinjer, samt modne blodelementer. Antall celler med fenotypene CD34 + og CD34 + CD38 blant benmarg-mononukleære celler er henholdsvis 0,5 til 3,6 og 0 til 0,5%. Perifert blod etter G-CSF-indusert mobilisering av HSC inneholder 0,4-1,6% av CD34 + og 0-0,4% av CD34 + CD38.

En høyere prosentandel av cellene med CD34 + CD38 immunfenotypen og CD34 + navlestrengsblod - og 0 til 0,6 OD-2,6%, og deres maksimale antallet blir detektert blant hematopoetiske føtale leverceller - og 2,3 0,2-12,5 -35,8%, henholdsvis.

Imidlertid er kvaliteten av transplantatmaterialet avhenger ikke bare av den mengde som inneholdes deri av CD34 + celler, men også på deres funksjonelle aktivitet, som kan bli estimert ved graden av kolonidannelse in vivo (marg repopulasjon i letalt bestrålte dyr) og in vitro - av vekst av kolonier på halvfaste medier . Det ble funnet at den kolonidannende og proliferativ aktivitet av hemopoietiske forløperceller med fenotypen CD34 + CD38 HLA-DR, isolert fra fosterlever, føtal benmarg og ledningen blod, og i stor grad overskrider den proliferative kapasiteten til hematopoetiske kolonidannende celler i benmarg og perifert blod fra en voksen. Kvantitativ og kvalitativ analyse av GSK forskjellig opprinnelse viste signifikante forskjeller av deres relative innhold i cellesuspensjonen, og funksjonalitet. Det maksimale antall CD34 + celler (24,6%) ble observert i pode-materialer som stammer fra føtal benmarg. Benmarg av et voksent menneske inneholder 2,1% av CD34-positive celleelementer. Blant de mononukleære celler fra humant perifert blod voksen bare 0,5% har en fenotype CD34 +, mens ledningen blod deres mengde når 2%. Således kolonidannende evne av CD34 + -celler på føtalt benmarg etter den 2,7 ganger overstiger kapasiteten til klonal vekst av hematopoietiske benmarg fra voksne humane celler og ledningen blodceller form vesentlig større kolonier enn hematopoietiske elementer som er isolert fra perifert blod fra voksne: 65,5 til 40 og , Henholdsvis 8 kolonier / 105 celler.

Forskjeller i proliferativ aktivitet og kolonidannende evne til hematopoietiske stamceller er ikke bare forbundet med forskjellige grad av modenhet, men også med deres naturlige mikromiljø. Det er kjent at intensiteten av proliferasjon og differensiering av stamceller hastighet som er bestemt ved hjelp av integralet regulerende påvirkning av flerkomponentsystem av vekstfaktorer og cytokiner som produseres av både stamcellene og cellulære elementer av matrise-stromal mikromiljøet. Ved hjelp av de rensede cellepopulasjoner og serumfritt medium med henblikk på cellekulturen å gi karakteriserte vekstfaktorer som har en stimulerende og hemmende virkninger på stamceller av forskjellige nivåer, progenitor-celler og celler av begått i en bestemt lineær retning. Resultatene fra de utførte studier vitner overbevisende om at GSK, hentet fra kilder med ulike nivåer av ontogenetisk utvikling, varierer både fenotypisk og funksjonelt. For GSK, bor i tidligere stadier av ontogeni, preget av et stort potensial for selvgjengivelse og høy proliferativ aktivitet. Slike celler utmerker seg med en lengre telomerlengde og blir utsatt for dannelse av alle hematopoietiske cellelinjer. Reaksjonen av immunsystemet til HSC-embryonisk opprinnelse er forsinket, siden slike celler mildt uttrykker HLA-molekyler. Det er en klar gradering av det relative innhold av HSCs og deres evne til å fornye seg selv og antallet av linjer de danner typer satsing: CD34 + celler fra fosterlever> CD34 + celler fra navlestrengsblod> CD34 + celler fra benmargen. Det er viktig at slike forskjeller er ikke unik for intra- og neo postanatalnomu tidlig periode av menneskelig utvikling, men også i hele ontogeny - proliferativ og kolonidannende aktivitet av HSCs avledet fra benmarg eller perifert blod fra en voksen, omvendt proporsjonal med alder av donor.