Hematopoietiske stamceller

Hematopoietiske stamceller (HSC-er), i likhet med mesenkymale progenitorceller, er preget av multipotens og gir opphav til cellelinjer, hvis siste elementer danner de dannede elementene i blodet, samt en rekke spesialiserte vevsceller i immunsystemet.

Hypotesen om eksistensen av en felles forløper for alle blodceller, så vel som selve begrepet "stamcelle", tilhører A. Maksimov (1909). Potensialet for dannelse av cellemasse i HSC er enormt - benmargsstamceller produserer daglig 10 celler som utgjør de dannede elementene i perifert blod. Selve faktumet om eksistensen av hematopoietiske stamceller ble etablert i 1961 i eksperimenter på restaurering av hematopoiesen hos mus som fikk en dødelig dose radioaktiv bestråling som ødelegger benmargsstamceller. Etter transplantasjon av syngene benmargsceller til slike dødelig bestrålte dyr, ble det funnet atskilte fokus for hematopoiesen i milten til mottakerne, hvis kilde var enkeltklonogene forløperceller.

Deretter ble hematopoietiske stamcellers evne til selvvedlikehold, som sørger for hematopoiesens funksjon i ontogeneseprosessen, bevist. I embryonal utvikling kjennetegnes HSC-er av høy migrasjonsaktivitet, som er nødvendig for deres bevegelse til dannelsessonene for hematopoietiske organer. Denne egenskapen til HSC-er bevares også i ontogenesen - på grunn av deres konstante migrasjon skjer en permanent fornyelse av bassenget av immunkompetente celler. HSC-ers evne til å migrere, trenge gjennom histohematiske barrierer, implantere i vev og klonogen vekst tjente som grunnlag for transplantasjon av benmargsceller ved en rekke sykdommer assosiert med patologi i det hematopoietiske systemet.

Som alle stamcelleressurser finnes hematopoietiske stamceller i sin nisje (benmarg) i svært små mengder, noe som forårsaker visse vanskeligheter med isoleringen. Immunofenotypisk karakteriseres humane HSC-er som CD34+NK-celler som er i stand til å migrere inn i blodomløpet og fylle organene i immunsystemet eller repopulere benmargsstroma. Det bør forstås tydelig at HSC-er ikke er de mest umodne cellene i benmargen, men stammer fra forløpere, som inkluderer sovende fibroblastlignende CD34-negative celler. Det er fastslått at celler med CD34-fenotypen er i stand til å komme inn i den generelle blodomløpet, hvor de endrer fenotypen sin til CD34+, men ved revers migrering inn i benmargen, under påvirkning av mikromiljøet, blir de igjen CD34-negative stamcelleelementer. I hviletilstand reagerer ikke CD34~-celler på parakrine regulatoriske signaler fra stroma (vekstfaktorer, cytokiner). I situasjoner som krever økt intensitet av hematopoiesen, reagerer imidlertid stamceller med CD34-fenotypen på differensieringssignaler ved å danne både hematopoietiske og mesenkymale progenitorceller. Hematopoiesen skjer gjennom direkte kontakt mellom HSC-er og cellulære elementer i benmargsstroma, representert av et komplekst nettverk av makrofager, retikulære endotelceller, osteoblaster, stromale fibroblaster og ekstracellulær matriks. Den stromale basisen i benmargen er ikke bare en matrise eller et "skjelett" for hematopoietisk vev; den utfører finregulering av hematopoiesen på grunn av parakrine regulatoriske signaler fra vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner, og gir også adhesive interaksjoner som er nødvendige for dannelsen av blodceller.

Dermed er det stadig fornyende hematopoiesesystemet basert på en polypotent (fra et hematopoieseperspektiv) hematopoietisk stamcelle som er i stand til langsiktig selvvedlikehold. I prosessen med å binde seg til cellene gjennomgår HSC-er primær differensiering og danner kloner av celler som avviker i cytomorfologiske og immunofenotypiske egenskaper. Den sekvensielle dannelsen av primitive og bindende progenitorceller ender med dannelsen av morfologisk identifiserbare progenitorceller fra forskjellige hematopoietiske linjer. Resultatet av de påfølgende stadiene i den komplekse flertrinnsprosessen med hematopoiese er modning av celler og frigjøring av modne dannede elementer i det perifere blodet - erytrocytter, leukocytter, lymfocytter og trombocytter.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Kilder til hematopoietiske stamceller

Hematopoietiske stamceller regnes som den mest studerte stamcellekilden, noe som i stor grad skyldes deres kliniske bruk i benmargstransplantasjon. Ved første øyekast vet man ganske mye om disse cellene. Til en viss grad er dette sant, siden mellomliggende og modne etterkommere av HSC-er er de mest tilgjengelige cellulære elementene, som hver for seg (erytrocytter, leukocytter, lymfocytter, monocytter/makrofager og blodplater) har blitt nøye studert på alle nivåer - fra lys- til elektronmikroskopi, fra biokjemiske og immunofenotypiske egenskaper til identifisering ved PCR-analysemetoder. Overvåking av morfologiske, ultrastrukturelle, biokjemiske, immunofenotypiske, biofysiske og genomiske parametere for HSC-er har imidlertid ikke gitt svar på mange problematiske spørsmål, hvis løsning er nødvendig for utviklingen av celletransplantasjon. Mekanismene for stabilisering av hematopoietiske stamceller i en sovende tilstand, deres aktivering, inntreden i stadiet med symmetrisk eller asymmetrisk deling, og viktigst av alt, forpliktelse til dannelsen av slike funksjonelt forskjellige dannede elementer i blodet som erytrocytter, leukocytter, lymfocytter og blodplater er ennå ikke fastslått.

Tilstedeværelsen i benmargen av celler med CD34-fenotypen, som er forløpere til både mesenkymale og hematopoietiske stamceller, reiste spørsmålet om eksistensen av de tidligste forløperne for celledifferensiering til stromale og hematopoietiske avstamninger, nær CD34-negative celler. Den såkalte langtidskulturinitierende cellen (LTC-IC) ble oppnådd ved hjelp av langtidsdyrkingsmetoden. Levetiden til slike forløperceller med kolonidannende aktivitet på stromal basis av benmarg med en viss kombinasjon av vekstfaktorer overstiger 5 uker, mens levedyktigheten til dedikerte kolonidannende enheter (CFU) i kultur bare er 3 uker. For tiden anses LTC-IC å være en funksjonell analog av HSC-er, siden med et høyt repopulasjonspotensial er omtrent 20 % av LTC-IC karakterisert av CD34+CD38-fenotypen og viser en høy kapasitet for selvfornyelse. Slike celler finnes i menneskelig benmarg med en frekvens på 1:50 000. Myeloide lymfoide celler som initierer myeloisk lymfoiddannelse, som er oppnådd under langvarige (15 uker) dyrkingsforhold, bør imidlertid anses som de som kommer nærmest HSC-er. Slike celler, betegnet som LTC, er blant cellene i beinmargen i den menneskelige hjernen, finnes 10 ganger sjeldnere enn LTC-IC og danner cellelinjer av både myeloide og lymfoide hematopoietiske avstamninger.

Selv om merking av hematopoietiske stamceller med monoklonale antistoffer etterfulgt av immunofenotypisk identifikasjon er hovedmetoden for gjenkjenning og selektiv sortering av hematopoietiske celler med stampotensial, er den kliniske anvendelsen av de således isolerte HSC-ene begrenset. Blokkering av CD34-reseptoren eller andre markørantigener med antistoffer under immunpositiv sortering endrer uunngåelig egenskapene til cellen som isoleres med dens hjelp. Immunnegativ isolering av HSC-er på magnetiske kolonner anses som mer foretrukket. Imidlertid brukes i dette tilfellet vanligvis monoklonale antistoffer fiksert på en metallbærer til sortering. I tillegg, noe som er viktig, er begge metodene for HSC-isolering basert på fenotypiske snarere enn funksjonelle egenskaper. Derfor foretrekker mange forskere å bruke analyse av klonogene parametere for HSC-er, som gjør det mulig å bestemme modningsgraden og differensieringsretningen til progenitorceller ut fra størrelsen og sammensetningen av koloniene. Det er kjent at antallet celler og deres typer i kolonien avtar under forpliktelsesprosessen. Den hematopoietiske stamcellen og dens tidlige dattercelle, kalt «granulocytt-erytrocytt-monocytt-megakaryocytt-kolonidannende enhet» (CFU-GEMM), skaper store flerlinjekolonier i kultur som inneholder henholdsvis granulocytter, erytrocytter, monocytter og megakaryocytter. Granulocytt-monocytt-kolonidannende enhet (CFU-GM), som ligger nedstrøms langs forpliktelseslinjen, danner kolonier av granulocytter og makrofager, og granulocytt-kolonidannende enhet (CFU-G) danner bare en liten koloni av modne granulocytter. Den tidlige erytrocyttforløperen, den eksplosjonsdannende enheten av erytrocytter (CFU-E), er kilden til store erytrocyttkolonier, og den mer modne kolonidannende enheten av erytrocytter (CFU-E) er kilden til små erytrocyttkolonier. Generelt, når celler vokser på halvfast medium, kan celler identifiseres som danner seks typer myeloide kolonier: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E og CFU-E).

I tillegg til hematopoietiske derivater inneholder imidlertid ethvert kildemateriale for isolering av HSC-er et betydelig antall ledsagende celler. I denne forbindelse er det først og fremst nødvendig med en foreløpig rensing av transplantatet fra aktive celler i donorens immunsystem. Vanligvis brukes immunseleksjon til dette formålet, basert på uttrykk av spesifikke antigener av lymfocytter, noe som gjør det mulig å isolere og fjerne dem ved hjelp av monoklonale antistoffer. I tillegg er det utviklet en immunorosettmetode for T-lymfocytt-uttømming av benmargstransplantasjon, som er basert på dannelse av komplekser av CD4+ lymfocytter og spesifikke monoklonale antistoffer, effektivt fjernet ved hjelp av aferese. Denne metoden sikrer produksjon av renset cellemateriale med 40-60 % innhold av hematopoietiske stamceller.

En økning i antall progenitorceller på grunn av fjerning av modne dannede elementer av blodet fra leukafereseproduktet oppnås ved motstrømssentrifugering etterfulgt av filtrering (i nærvær av en chelator - trinatriumcitrat) gjennom kolonner som inneholder nylonfibre belagt med humant immunglobulin. Den sekvensielle bruken av disse to metodene sikrer fullstendig rensing av transplantatet fra blodplater, 89 % fra erytrocytter og 91 % fra leukocytter. På grunn av en betydelig reduksjon i tapet av HSC-er, kan nivået av CD34+ celler i den totale cellemassen økes til 50 %.

Evnen til de isolerte hematopoietiske stamcellene til å danne kolonier av modne blodceller i kultur brukes til funksjonell karakterisering av cellene. Analyse av de dannede koloniene gjør det mulig å identifisere og kvantifisere typene av progenitorceller, graden av deres binding og etablere retningen for deres differensiering. Klonogen aktivitet bestemmes i halvfaste medier på metylcellulose, agar, plasma eller fibringel, noe som reduserer cellenes migrasjonsaktivitet og forhindrer at de fester seg til overflaten av glass eller plast. Under optimale dyrkingsforhold utvikler kloner seg fra en enkelt celle i løpet av 7–18 dager. Hvis en klon inneholder færre enn 50 celler, identifiseres den som en enkelt klynge; hvis antallet celler overstiger 50, identifiseres den som en koloni. Antallet celler som er i stand til å danne en koloni tas i betraktning (kolonidannende enheter - CFU eller kolonidannende celler - COC). Det skal bemerkes at parametrene for CFU og COC ikke samsvarer med antallet HSC-er i cellesuspensjonen, selv om de korrelerer med det, noe som igjen understreker behovet for å bestemme den funksjonelle (kolonidannende) aktiviteten til HSC-er in vitro.

Blant benmargsceller har hematopoietiske stamceller det høyeste proliferative potensialet, noe som gjør at de danner de største koloniene i kultur. Antallet slike kolonier foreslås å indirekte bestemme antallet stamceller. Etter dannelsen av kolonier in vitro som overstiger 0,5 mm i diameter og med et celletall på mer enn 1000, testet forfatterne slike celler for resistens mot subletale doser av 5-fluorouracil og studerte deres evne til å repopulere benmargen til dødelig bestrålte dyr. I henhold til de spesifiserte parametrene var de isolerte cellene nesten umulige å skille fra HSC-er og fikk forkortelsen HPP-CFC - kolonidannende celler med høyt proliferativt potensial.

Søket etter bedre isolering av hematopoietiske stamceller fortsetter. Hematopoietiske stamceller er imidlertid morfologisk like lymfocytter og representerer et relativt homogent sett av celler med nesten runde kjerner, fint dispergert kromatin og en liten mengde svakt basofil cytoplasma. Deres nøyaktige antall er også vanskelig å bestemme. Det antas at HSC-er i menneskelig benmarg forekommer med en frekvens på 1 per 106 kjerneholdige celler.

Identifisering av hematopoietiske stamceller

For å forbedre kvaliteten på identifiseringen av hematopoietiske stamceller utføres en sekvensiell eller samtidig (på en flerkanals sorterer) studie av spekteret av membranbundne antigener, og i HSC-er bør CD34+CD38-fenotypen kombineres med fravær av lineære differensieringsmarkører, spesielt antigener fra immunkompetente celler, som CD4, overflateimmunoglobuliner og glykoforin.

Nesten alle fenotypingsskjemaer for hematopoietiske stamceller inkluderer bestemmelse av CD34-antigenet. Dette glykoproteinet med en molekylvekt på omtrent 110 kDa, som bærer flere glykosyleringssteder, uttrykkes på plasmacellemembranen etter aktivering av det tilsvarende genet lokalisert på kromosom 1. Funksjonen til CD34-molekylet er assosiert med L-selektinmediert interaksjon mellom tidlige hematopoietiske stamceller og den stromale basisen i benmargen. Det bør imidlertid huskes at tilstedeværelsen av CD34-antigenet på celleoverflaten bare tillater en foreløpig vurdering av HSC-innholdet i cellesuspensjonen, siden det også uttrykkes av andre hematopoietiske stamceller, så vel som stromale celler og endotelceller i benmargen.

Under differensieringen av hematopoietiske stamceller reduseres CD34-ekspresjonen permanent. Erytrocytter, granulocytter og monocyttiske stamceller uttrykker enten CD34-antigen svakt eller uttrykker det ikke på overflaten i det hele tatt (CD34-fenotype). CD34-antigen detekteres ikke på overflatemembranen til differensierte benmargsceller og modne blodceller.

Det skal bemerkes at i differensieringsdynamikken av hematopoietiske stamceller synker ikke bare nivået av CD34-ekspresjon, men også ekspresjonen av CD38-antigenet, et integrert membranglykoprotein med en molekylvekt på 46 kDa, som har NAD-glykohydrolase- og ADP-ribosylcyklaseaktivitet, øker gradvis, noe som tyder på at det deltar i transport og syntese av ADP-ribose. Dermed oppstår muligheten for dobbel kontroll av graden av engasjement av hematopoietiske stamceller. Populasjonen av celler med CD34+CD38+-fenotypen, som utgjør fra 90 til 99 % av CD34-positive benmargsceller, inneholder stamceller med begrenset proliferativt og differensierende potensial, mens celler med CD34+CD38-fenotypen kan gjøre krav på rollen som HSC.

Benmargcellepopulasjonen beskrevet med formelen CD34+CD38- inneholder faktisk et relativt stort antall primitive stamceller som er i stand til å differensiere i myeloid og lymfoid retning. Under forhold med langvarig dyrking av celler med CD34+CD38--fenotypen er det mulig å oppnå alle modne dannede elementer av blodet: nøytrofiler, eosinofiler, basofiler, monocytter, megakaryocytter, erytrocytter og lymfocytter.

Det har blitt etablert relativt nylig at CD34-positive celler uttrykker to markører til, AC133 og CD90 (Thy-1), som også brukes til å identifisere hematopoietiske stamceller. Thy-1-antigenet uttrykkes sammen med CD117-reseptoren (c-kit) på CD34+-celler i benmargen, navlestrengen og perifert blod. Det er et overflatefosfatidylinositolbindende glykoprotein med en molekylvekt på 25–35 kDa, som deltar i celleadhesjonsprosesser. Noen forfattere mener at Thy-1-antigenet er en markør for de mest umodne CD34-positive cellene. Selvreproduserende celler med CD34+Thy-1+-fenotypen gir opphav til langsiktige dyrkede linjer med dannelse av datterceller. Det antas at Thy-1-antigenet blokkerer regulatoriske signaler som forårsaker celledelingsstans. Til tross for at CD34+Thy1+ celler er i stand til selvreproduksjon og dannelse av langsiktige dyrkede linjer, kan ikke fenotypen deres utelukkende tilskrives HSC-er, siden innholdet av Thy-1+ i den totale massen av CD34-positive cellulære elementer er omtrent 50 %, noe som betydelig overstiger antallet hematopoietiske celler.

Mer lovende for identifisering av hematopoietiske stamceller bør være anerkjent som AC133 - en antigenmarkør for hematopoietiske progenitorceller, hvis uttrykk først ble oppdaget på embryonale leverceller. AC133 er et transmembrant glykoprotein som vises på overflaten av cellemembranen i de tidligste stadiene av HSC-modning - det er mulig at det skjer enda tidligere enn CD34-antigenet. I studiene til A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) ble det fastslått at AC133 uttrykkes av opptil 30 % av CD34-positive embryonale leverceller.

Dermed består den ideelle fenotypiske profilen til hematopoietiske stamceller, i henhold til nåværende konsepter, av en cellulær omriss, hvis konturer bør inkludere konfigurasjoner av CD34-, AC133- og Thy-1-antigenene, men det er ikke plass til de molekylære projeksjonene av CD38, HLA-DR og de lineære differensieringsmarkørene GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

En variant av det fenotypiske portrettet av HSC-er kan være kombinasjonen CD34+CD45RalowCD71low, siden egenskapene til cellene beskrevet av denne formelen ikke skiller seg fra de funksjonelle parametrene til celler med CD34+CD38-fenotypen. I tillegg kan humane HSC-er identifiseres ved de fenotypiske trekkene CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit /low - bare 30 slike celler gjenoppretter hematopoiesen fullstendig hos dødelig bestrålte mus.

Den 40 år lange perioden med intensiv forskning på HSC-er, som er i stand til både selvreproduksjon og differensiering til andre cellulære elementer, startet med analysen av de generelle fenotypiske egenskapene til benmargsceller, noe som gjorde det mulig å rettferdiggjøre bruken av benmargstransplantasjon for behandling av ulike patologier i det hematopoietiske systemet. Nye typer stamceller som ble oppdaget senere har ennå ikke blitt mye brukt i klinisk praksis. Samtidig er stamceller fra navlestrengsblod og embryonal lever i stand til å utvide omfanget av celletransplantasjon betydelig, ikke bare innen hematologi, men også innen andre områder av medisin, siden de skiller seg fra benmargs-HSC-er både i kvantitative egenskaper og kvalitative trekk.

Volumet av hematopoietisk stamcellemasse som kreves for transplantasjon, hentes vanligvis fra benmarg, perifert blod og navlestrengsblod, og embryonal lever. I tillegg kan hematopoietiske progenitorceller oppnås in vitro ved å multiplisere ESC-er med deres påfølgende rettede differensiering til hematopoietiske cellulære elementer. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) bemerker med rette betydelige forskjeller i de immunologiske egenskapene og evnen til å gjenopprette hematopoiesen hos HSC-er av ulik opprinnelse, noe som skyldes det ujevne forholdet mellom tidlige pluripotente og sent engasjerte progenitorceller som finnes i deres kilder. I tillegg er hematopoietiske stamceller hentet fra forskjellige stamkilder karakterisert ved kvantitativt og kvalitativt helt forskjellige assosiasjoner av ikke-hematopoietiske celler.

Benmarg har allerede blitt en tradisjonell kilde til hematopoietiske stamceller. Benmargcellesuspensjon utvinnes fra ilium eller sternum ved vasking under lokalbedøvelse. Suspensjonen som oppnås på denne måten er heterogen og inneholder en blanding av HSC-er, stromale celleelementer, dedikerte progenitorceller fra myeloide og lymfoide linjer, samt modne dannede elementer av blodet. Antallet celler med CD34+ og CD34+CD38 fenotypene blant mononukleære benmargsceller er henholdsvis 0,5–3,6 og 0–0,5 %. Perifert blod etter G-CSF-indusert mobilisering av HSC-er inneholder 0,4–1,6 % CD34+ og 0–0,4 % CD34+CD38.

Prosentandelen celler med immunofenotypene CD34+CD38 og CD34+ er høyere i navlestrengsblod - 0–0,6 og 1–2,6 %, og deres maksimale antall oppdages blant de hematopoietiske cellene i den embryonale leveren - henholdsvis 0,2–12,5 og 2,3–35,8 %.

Kvaliteten på det transplanterte materialet avhenger imidlertid ikke bare av antallet CD34+ celler det inneholder, men også av deres funksjonelle aktivitet, som kan vurderes ved nivået av kolonidannelse in vivo (repopulasjon av benmarg hos dødelig bestrålte dyr) og in vitro - ved kolonivekst på halvflytende medier. Det viste seg at den kolonidannende og proliferative aktiviteten til hematopoietiske stamceller med CD34+CD38 HLA-DR-fenotypen isolert fra embryonal lever, føtal benmarg og navlestrengsblod overstiger det proliferative og kolonidannende potensialet til hematopoietiske celler i benmargen og perifert blod hos en voksen betydelig. Kvantitativ og kvalitativ analyse av HSC-er av ulik opprinnelse avdekket signifikante forskjeller i både deres relative innhold i cellesuspensjonen og funksjonelle evner. Det maksimale antallet CD34+ celler (24,6 %) ble funnet i det transplanterte materialet oppnådd fra føtal benmarg. Benmargen hos en voksen inneholder 2,1 % CD34-positive cellulære elementer. Blant de mononukleære cellene i det perifere blodet til en voksen har bare 0,5 % CD34+-fenotypen, mens antallet i navlestrengsblod når 2 %. Samtidig er den kolonidannende kapasiteten til CD34+-celler i føtal benmarg 2,7 ganger høyere enn den klonale vekstkapasiteten til hematopoietiske celler i benmargen hos en voksen, og navlestrengsblodceller danner betydelig flere kolonier enn hematopoietiske elementer isolert fra det perifere blodet til voksne: henholdsvis 65,5 og 40,8 kolonier/10^5 celler.

Forskjeller i proliferativ aktivitet og kolonidannende kapasitet hos hematopoietiske stamceller er ikke bare assosiert med ulik grad av modenhet, men også med deres naturlige mikromiljø. Det er kjent at proliferasjonsintensiteten og differensieringshastigheten til stamceller bestemmes av den integrerte regulatoriske effekten av et flerkomponentsystem av vekstfaktorer og cytokiner som produseres både av stamcellene selv og av de cellulære elementene i deres matriks-stromale mikromiljø. Bruken av rensede cellepopulasjoner og serumfrie medier for celledyrking gjorde det mulig å karakterisere vekstfaktorer som har en stimulerende og hemmende effekt på stamceller på forskjellige nivåer, progenitorceller og celler som er dedikert i en eller annen lineær retning. Resultatene av studiene indikerer overbevisende at HSC-er oppnådd fra kilder med forskjellige nivåer av ontogenetisk utvikling er forskjellige både fenotypisk og funksjonelt. HSC-er i tidligere stadier av ontogenese er preget av høyt selvreproduksjonspotensial og høy proliferativ aktivitet. Slike celler kjennetegnes av lengre telomerer og gjennomgår dedikasjon til å danne alle hematopoietiske cellelinjer. Immunsystemets respons på HSC-er av embryonal opprinnelse er forsinket, siden slike celler uttrykker HLA-molekyler svakt. Det er en tydelig gradering av det relative innholdet av HSC-er, deres selvfornyelseskapasitet og antall typer forpliktelseslinjer de danner: CD34+ celler i embryonal lever > CD34+ celler i navlestrengsblod > CD34+ celler i benmarg. Det er viktig at slike forskjeller ikke bare er iboende i intra-, neo- og tidlig postanatal perioder av menneskelig utvikling, men også i hele ontogenesen - den proliferative og kolonidannende aktiviteten til HSC-er hentet fra benmarg eller perifert blod hos en voksen er omvendt proporsjonal med giverens alder.