Hematopoietiske stamceller i plommesekken

Det er åpenbart at ulike proliferative og differensierende potensialer for hematopoietiske stamceller bestemmes av særegenhetene ved deres ontogenetiske utvikling, siden selv lokaliseringen av hovedområdene for hematopoiesen endres hos mennesker under ontogenesen. Hematopoietiske stamceller i fosterets plommesekk er forpliktet til dannelsen av en utelukkende erytropoietisk cellelinje. Etter migrasjonen av primære HSC-er til leveren og milten utvides spekteret av forpliktelseslinjer i mikromiljøet til disse organene. Spesielt får hematopoietiske stamceller evnen til å generere lymfoide avstamningsceller. I prenatalperioden når hematopoietiske stamceller sonen for endelig lokalisering og fyller benmargen. Under intrauterin utvikling inneholder fosterblodet et betydelig antall hematopoietiske stamceller. For eksempel, i den 13. svangerskapsuken når HSC-nivået 18 % av det totale antallet mononukleære blodceller. Deretter observeres en gradvis reduksjon i innholdet, men selv før fødselen skiller mengden HSC-er i navlestrengsblodet seg lite fra mengden i benmargen.

I følge klassiske konsepter skjer den naturlige endringen i lokaliseringen av hematopoiesen under pattedyrs embryonale utvikling ved migrasjon og introduksjon av pluripotente hematopoietiske stamceller i et nytt mikromiljø - fra plommesekken til leveren, milten og benmargen. Siden det hematopoietiske vevet i de tidlige stadiene av embryonal utvikling inneholder et stort antall stamceller, som avtar etter hvert som fosteret modnes, anses det mest lovende for å oppnå hematopoietiske stamceller å være det hematopoietiske vevet fra den embryonale leveren, isolert fra abortert materiale ved 5-8 ukers svangerskap.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Spørsmål om opprinnelsen til hematopoietiske stamceller

Det er ingen tvil om at embryonal dannelse av erytrocytter stammer fra blodøyene i plommesekken. Differensieringspotensialet in vitro for hematopoietiske celler i plommesekken er imidlertid svært begrenset (de differensierer hovedsakelig til erytrocytter). Det bør bemerkes at transplantasjon av hematopoietiske stamceller fra plommesekken ikke er i stand til å gjenopprette hematopoiesen på lenge. Det viste seg at disse cellene ikke er forløperne til voksne HSC-er. Ekte HSC-er dukker opp tidligere, i 3.-5. uke av intrauterin utvikling, i dannelsessonen for magevev og endotel i blodårene (paraaortisk splanchnopleura, P-SP), samt i stedet for aorta, gonader og primære nyrer - i mesonefros eller den såkalte AGM-regionen. Det har blitt vist at celler i AGM-regionen er en kilde ikke bare til HSC-er, men også til endotelceller i blodårene, samt osteoklaster involvert i beinvevsdannelsesprosesser. I den 6. svangerskapsuken flyttes tidlige hematopoietiske stamceller fra AGM-regionen til leveren, som forblir fosterets viktigste hematopoietiske organ frem til fødselen.

Siden dette punktet er ekstremt viktig fra et celletransplantasjonsperspektiv, fortjener problemet med opprinnelsen til HSC-er i prosessen med menneskelig embryogenese en mer detaljert presentasjon. De klassiske ideene om at hematopoietiske stamceller hos pattedyr og fugler stammer fra en ekstraembryonal kilde er basert på studiene til Metcalf og Moore, som var de første til å bruke metoder for kloning av HSC-er og deres etterkommere isolert fra plommesekken. Resultatene av arbeidet deres tjente som grunnlag for migrasjonsteorien, ifølge hvilken HSC-er, etter å ha dukket opp i plommesekken, sekvensielt befolker de forbigående og definitive hematopoietiske organene etter hvert som det tilsvarende mikromiljøet dannes i dem. Slik ble synspunktet etablert om at genereringen av HSC-er, opprinnelig lokalisert i plommesekken, tjener som det cellulære grunnlaget for definitiv hematopoiese.

Hematopoietiske stamceller i plommesekken tilhører kategorien av de tidligste hematopoietiske stamceller. Fenotypen deres beskrives av formelen AA4.1+CD34+c-kit+. I motsetning til modne benmargs-HSC-er uttrykker de ikke Sca-1-antigener og MHC-molekyler. Det ser ut til at forekomsten av markørantigener på overflatemembranene til plommesekkens HSC-er under dyrking tilsvarer deres differensiering under embryonal utvikling med dannelsen av engasjerte hematopoietiske linjer: nivået av CD34- og Thy-1-antigenuttrykk synker, CD38- og CD45RA-uttrykk øker, og HLA-DR-molekyler dukker opp. Med påfølgende spesialisering in vitro indusert av cytokiner og vekstfaktorer, begynner uttrykket av antigener som er spesifikke for hematopoietiske stamceller i en bestemt cellelinje. Resultatene fra studien av embryonal hematopoiese hos representanter for tre klasser av virveldyr (amfibier, fugler og pattedyr), og spesielt analysen av opprinnelsen til HSC-er som er ansvarlige for definitiv hematopoiese i postnatal ontogenese, motsier imidlertid klassiske konsepter. Det er slått fast at hos representanter for alle klassene som er vurdert, dannes to uavhengige regioner der HSC-er oppstår under embryogenesen. Den ekstraembryonale "klassiske" regionen er representert av plommesekken eller dens analoger, mens den nylig identifiserte intraembryonale sonen for HSC-lokalisering inkluderer det paraaortiske mesenkymet og AGM-regionen. I dag kan det hevdes at hos amfibier og fugler stammer definitive HSC-er fra intraembryonale kilder, mens hos pattedyr og mennesker kan deltakelse av plommesekk-HSC-er i definitiv hematopoiese ennå ikke utelukkes fullstendig.

Embryonal hematopoiese i plommesekken er faktisk primær erytropoiese, som er karakterisert ved bevaring av cellekjernen i alle stadier av erytrocyttmodning og syntese av hemoglobin av føtal type. I følge de nyeste dataene slutter bølgen av primær erytropoiese i plommesekken på den 8. dagen av embryonal utvikling. Den etterfølges av en periode med akkumulering av definitive erytroide stamceller - BFU-E, som dannes utelukkende i plommesekken og først dukker opp på den 9. dagen av svangerskapet. I neste stadium av embryogenesen er definitive erytroide stamceller - CFU-E, samt (!) mastceller og CFU-GM allerede dannet. Dette er grunnlaget for synspunktet om at definitive stamceller oppstår i plommesekken, migrerer med blodet, bosetter seg i leveren og raskt starter den første fasen av intraembryonal hematopoiese. I følge disse konseptene kan plommesekken på den ene siden betraktes som stedet for primær erytropoese, og på den andre siden som den første kilden til definitive hematopoietiske stamceller i embryonal utvikling.

Det har blitt vist at kolonidannende celler med høyt proliferativt potensial kan isoleres fra plommesekken så tidlig som på den åttende dagen av svangerskapet, dvs. lenge før embryoets og plommesekkens karsystem lukkes. Dessuten danner celler med høyt proliferativt potensial hentet fra plommesekken in vitro kolonier hvis størrelse og cellulære sammensetning ikke avviker fra de tilsvarende parameterne for kulturvekst av benmargsstamceller. Samtidig, når kolonidannende celler av plommesekken med høyt proliferativt potensial retransplanteres, dannes det betydelig flere datterkolonidannende celler og multipotente stamceller enn når man bruker benmargsstamceller fra hematopoiesen.

En endelig konklusjon om rollen til hematopoietiske stamceller fra plommesekken i definitiv hematopoiesis kunne gis av resultatene fra arbeidet der forfatterne oppnådde en linje med endotelceller fra plommesekken (G166), som effektivt støttet proliferasjonen av cellene med de fenotypiske og funksjonelle egenskapene til HSC-er (AA4.1+WGA+, lav tetthet og svake adhesive egenskaper). Innholdet av sistnevnte økte mer enn 100 ganger når de ble dyrket på et materlag av C166-celler i 8 dager. Makrofager, granulocytter, megakaryocytter, blastceller og monocytter, samt B- og T-lymfocyttforløperceller ble identifisert i blandede kolonier dyrket på et underlag av C166-celler. Plommesekkceller som vokste på et underlag av endotelceller hadde evnen til å selvreprodusere seg og motsto opptil tre passasjer i forfatternes eksperimenter. Restaurering av hematopoiesen med deres hjelp hos modne mus med alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) ble ledsaget av dannelsen av alle typer leukocytter, samt T- og B-lymfocytter. Forfatterne i studiene sine brukte imidlertid plommesekkceller fra et 10 dager gammelt embryo, der de ekstra- og intraembryonale vaskulære systemene allerede er lukket, noe som ikke tillater oss å utelukke tilstedeværelsen av intraembryonale HSC-er blant plommesekkcellene.

Samtidig avslørte analysen av differensieringspotensialet til hematopoietiske celler i tidlige utviklingsstadier, isolert før foreningen av de vaskulære systemene i plommesekken og embryoet (8-8,5 dagers svangerskap), tilstedeværelsen av forløpere til T- og B-celler i plommesekken, men ikke i embryoets kropp. I in vitro-systemet, ved metoden med totrinns dyrking på et monolag av epiteliale og subepiteliale celler i tymus, differensierte mononukleære celler i plommesekken til pre-T- og modne T-lymfocytter. Under de samme dyrkingsforholdene, men på et monolag av stromale celler i leveren og benmargen, differensierte mononukleære celler i plommesekken til pre-B-celler og modne IglVT-B-lymfocytter.

Resultatene fra disse studiene indikerer muligheten for utvikling av immunsystemceller fra ekstraembryonalt vev i plommesekken, og dannelsen av primære T- og B-cellelinjer avhenger av faktorer i det stromale mikromiljøet til embryonale hematopoietiske organer.

Andre forfattere har også vist at plommesekken inneholder celler med potensial for lymfoid differensiering, og de resulterende lymfocyttene skiller seg ikke i antigene egenskaper fra de hos kjønnsmodne dyr. Det er fastslått at plommesekkcellene til et 8-9 dager gammelt embryo er i stand til å gjenopprette lymfopoiesen i atymocytthymus med fremveksten av modne CD3+CD4+- og CD3+CD8+-lymfocytter som har et dannet repertoar av T-cellereseptorer. Dermed kan thymus befolkes av celler av ekstraembryonal opprinnelse, men det er umulig å utelukke den sannsynlige migrasjonen av tidlige T-lymfocyttforløperceller fra intraembryonale lymfopoiesekilder til thymus.

Samtidig resulterer ikke transplantasjon av hematopoietiske plommesekkceller til voksne bestrålte mottakere alltid i langsiktig repopulering av utarmede hematopoietiske vevlokaliseringssoner, og in vitro plommesekkceller danner betydelig færre miltkolonier enn AGM-regionceller. I noen tilfeller er det fortsatt mulig å oppnå langsiktig (opptil 6 måneder) repopulering av hematopoietisk vev i bestrålte mottakere ved bruk av plommesekkceller fra et 9 dager gammelt embryo. Forfatterne mener at plommesekkceller med CD34+c-kit+ fenotypen ikke bare ikke skiller seg fra de fra AGM-regionen i sin evne til å repopulere utarmede hematopoietiske organer, men også gjenopprette hematopoiesen mer effektivt, siden plommesekken inneholder nesten 37 ganger flere av dem.

Det skal bemerkes at forsøkene brukte hematopoietiske plommesekkceller med markørantigener fra hematopoietiske stamceller (c-kit+ og/eller CD34+ og CD38+), som ble injisert direkte i leveren eller abdominalvenen til avkommet til hunnmus som fikk en injeksjon med busulfan på den 18. dagen av svangerskapet. Hos slike nyfødte dyr ble deres egen myelopoiese kraftig undertrykt på grunn av eliminering av hematopoietiske stamceller forårsaket av busulfan. Etter transplantasjon av hematopoietiske plommesekkstamceller ble det påvist dannede elementer som inneholdt donormarkøren - glyserofosfatdehydrogenase - i det perifere blodet til mottakerne i 11 måneder. Det ble funnet at plommesekk-HSC-er gjenoppretter innholdet av lymfoide, myeloide og erytroide avstamningsceller i blodet, tymus, milt og benmarg, og nivået av kimærisme var høyere ved intrahepatisk snarere enn intravenøs administrering av plommesekkceller. Forfatterne mener at plommesekk-HSC-er hos embryoer i tidlig stadium (opptil 10 dager) krever forhåndsinteraksjon med leverens hematopoietiske mikromiljø for å kunne fylle de hematopoietiske organene hos voksne mottakere. Det er mulig at det finnes et unikt utviklingsstadium i embryogenesen, når plommesekkceller, som først migrerer til leveren, deretter tilegner seg evnen til å fylle stroma i de hematopoietiske organene hos modne mottakere.

I denne forbindelse bør det bemerkes at kimerisme av immunsystemceller ofte observeres etter transplantasjon av benmargsceller til bestrålte modne mottakere - i blodet til sistnevnte finnes celler av donorfenotypen i ganske store mengder blant mottakerens B-, T-lymfocytter og granulocytter, noe som fortsetter i minst 6 måneder.

Hematopoietiske celler hos pattedyr oppdages først ved morfologiske metoder på den 7. dagen av embryonal utvikling og er representert av hematopoietiske øyer inne i plommesekkens kar. Imidlertid er naturlig hematopoietisk differensiering i plommesekken begrenset til primære erytrocytter som beholder kjerner og syntetiserer føtalt hemoglobin. Likevel ble det tradisjonelt antatt at plommesekken fungerer som den eneste kilden til HSC-er som migrerer til de hematopoietiske organene i det utviklende embryoet og gir definitiv hematopoiese hos voksne dyr, siden forekomsten av HSC-er i embryoets kropp sammenfaller med lukningen av de vaskulære systemene i plommesekken og embryoet. Dette synspunktet støttes av data om at plommesekkceller, når de klones in vitro, gir opphav til granulocytter og makrofager, og in vivo - til miltkolonier. I løpet av transplantasjonseksperimenter ble det deretter fastslått at de hematopoietiske cellene i plommesekken, som i selve plommesekken bare er i stand til å differensiere til primære erytrocytter, i mikromiljøet i leveren hos nyfødte og voksne SCID-mus, får den utarmede tymus- eller stromale materen evnen til å repopulere hematopoietiske organer med gjenopprettelse av alle hematopoietiske linjer, selv hos voksne mottakerdyr. I prinsippet lar dette oss klassifisere dem som ekte HSC-er - som celler som fungerer i postnatalperioden. Det antas at plommesekken, sammen med AGM-regionen, fungerer som en kilde til HSC-er for definitiv hematopoiesis hos pattedyr, men deres bidrag til utviklingen av det hematopoietiske systemet er fortsatt uklart. Den biologiske betydningen av eksistensen av to hematopoietiske organer med lignende funksjoner i tidlig pattedyrembryogenese er også uklar.

Søket etter svar på disse spørsmålene fortsetter. In vivo var det mulig å bevise tilstedeværelsen i plommesekken til 8-8,5 dager gamle embryoer av celler som gjenoppretter lymfopoiesen hos subletalt bestrålte SCID-mus med en uttalt mangel på T- og B-lymfocytter. Hematopoietiske plommesekkceller ble injisert både intraperitonealt og direkte i milt- og levervevet. Etter 16 uker ble TCR/CD34 CD4+ og CD8+ T-lymfocytter og B-220+IgM+ B-lymfocytter merket med donor MHC-antrxgener påvist hos mottakerne. Samtidig fant forfatterne ikke stamceller som var i stand til slik gjenoppretting av immunsystemet i kroppen til 8-8,5 dager gamle embryoer.

Hematopoietiske celler i plommesekken har et høyt proliferativt potensial og er i stand til langvarig selvreproduksjon in vitro. Noen forfattere identifiserer disse cellene som HSC-er basert på den langvarige (nesten 7 måneder) genereringen av erytroide stamceller, som skiller seg fra benmargsforløpere av erytroid-avstamningen ved en lengre passasjeperiode, større kolonistørrelser, økt følsomhet for vekstfaktorer og lengre proliferasjon. I tillegg dannes det også lymfoide stamceller under passende forhold for plommesekkcelledyrking in vitro.

De presenterte dataene lar oss generelt betrakte plommesekken som en kilde til HSC-er, mindre engasjert og derfor med et større proliferativt potensial enn benmargsstamceller. Til tross for at plommesekken inneholder pluripotente hematopoietiske progenitorceller som opprettholder ulike linjer med hematopoietisk differensiering in vitro over lang tid, er det eneste kriteriet for fullstendigheten av HSC-er deres evne til å langsiktig repopulere mottakerens hematopoietiske organer, hvis hematopoietiske celler er ødelagte eller genetisk defekte. Dermed er hovedspørsmålet om pluripotente hematopoietiske celler i plommesekken kan migrere og populere hematopoietiske organer, og om det er tilrådelig å revidere de kjente arbeidene som demonstrerer deres evne til å repopulere de hematopoietiske organene hos modne dyr med dannelsen av de viktigste hematopoietiske linjene. Intraembryonale kilder til definitive GSC-er ble identifisert i fugleembryoer tilbake på 1970-tallet, noe som allerede da sådde tvil om de etablerte ideene om den ekstraembryonale opprinnelsen til GSC-er, inkludert hos representanter for andre klasser av virveldyr. I løpet av de siste årene har det dukket opp publikasjoner om tilstedeværelsen av lignende intraembryonale områder som inneholder GSC-er hos pattedyr og mennesker.

Det bør igjen bemerkes at grunnleggende kunnskap på dette området er ekstremt viktig for praktisk celletransplantasjon, siden det ikke bare vil bidra til å bestemme den foretrukne kilden til HSC-er, men også til å etablere egenskapene ved samspillet mellom primære hematopoietiske celler og en genetisk fremmed organisme. Det er kjent at introduksjon av hematopoietiske stamceller fra menneskelig føtal lever i et saueembryo i organogenesestadiet fører til fødselen av kimære dyr, hvor 3 til 5 % av menneskelige hematopoietiske celler er stabilt bestemt i blod og benmarg. Samtidig endrer ikke menneskelige HSC-er karyotypen sin, og opprettholder en høy proliferasjonsrate og evnen til å differensiere. I tillegg kommer transplanterte xenogene HSC-er ikke i konflikt med immunsystemet og fagocyttene til vertsorganismen og transformeres ikke til tumorceller, noe som dannet grunnlaget for den intensive utviklingen av metoder for intrauterin korreksjon av arvelig genetisk patologi ved bruk av HSC-er eller ESC-er transfektert med mangelfulle gener.

Men på hvilket stadium av embryogenesen er det mer passende å utføre en slik korreksjon? For første gang dukker celler bestemt for hematopoiesis opp hos pattedyr umiddelbart etter implantasjon (6. svangerskapsdag), når morfologiske tegn på hematopoietisk differensiering og presumptive hematopoietiske organer fortsatt er fraværende. På dette stadiet er spredte celler i museembryoet i stand til å repopulere de hematopoietiske organene til bestrålte mottakere med dannelse av erytrocytter og lymfocytter som skiller seg fra vertscellene ved henholdsvis typen hemoglobin eller glyserofosfatisomerase, samt en ekstra kromosomal markør (Tb) av donorceller. Hos pattedyr, som hos fugler, samtidig med plommesekken, før lukking av det felles karlaget, dukker hematopoietiske celler opp direkte i embryoets kropp i den paraaortiske splanchnopleura. Hematopoietiske celler av AA4.1+ fenotypen ble isolert fra AGM-regionen og karakterisert som multipotente hematopoietiske celler som danner T- og B-lymfocytter, granulocytter, megakaryocytter og makrofager. Fenotypisk er disse multipotente stamceller svært lik HSC-ene i benmargen hos voksne dyr (CD34+c-kit+). Antallet multipotente AA4.1+ celler blant alle cellene i AGM-regionen er lite – de utgjør ikke mer enn 1/12 av dens del.

I det menneskelige embryoet er det også identifisert en intraembryonal region som inneholder HSC-er homologe med AGM-regionen hos dyr. Dessuten finnes mer enn 80 % av multipotente celler med høyt proliferativt potensial i embryoets kropp hos mennesker, selv om slike celler også finnes i plommesekken. En detaljert analyse av lokaliseringen deres viste at hundrevis av slike celler er samlet i kompakte grupper som er plassert i nærheten av endotelet i den ventrale veggen av den dorsale aorta. Fenotypisk er de CD34CD45+Lin-celler. I plommesekken, så vel som i andre hematopoietiske organer i embryoet (lever, benmarg), er slike celler derimot enkle.

Følgelig inneholder AGM-regionen i det menneskelige embryoet klynger av hematopoietiske celler som er nært forbundet med det ventrale endotelet i den dorsale aorta. Denne kontakten spores også på det immunkjemiske nivået - både cellene i de hematopoietiske klyngene og endotelcellene uttrykker den vaskulære endotelvekstfaktoren, Flt-3-liganden, deres reseptorer FLK-1 og STK-1, samt transkripsjonsfaktoren til leukemi-stamceller. I AGM-regionen er mesenkymale derivater representert av en tett streng av avrundede celler som ligger langs hele den dorsale aorta og uttrykker tenascin C - et glykoprotein av grunnsubstansen som er aktivt involvert i prosessene for intercellulær interaksjon og migrasjon.

Multipotente stamceller fra AGM-regionen gjenoppretter raskt hematopoiesen hos modne bestrålte mus etter transplantasjon og gir effektiv hematopoiesen over lang tid (opptil 8 måneder). Forfatterne fant ikke celler med slike egenskaper i plommesekken. Resultatene av denne studien bekreftes av data fra et annet arbeid, som viste at i embryoer i tidlige utviklingsstadier (10,5 dager) er AGM-regionen den eneste kilden til celler som samsvarer med definisjonen av HSC, og gjenoppretter myeloid og lymfoid hematopoiesen hos modne bestrålte mottakere.

AGM-S3-stromallinjen ble isolert fra AGM-regionen, hvis celler støtter genereringen av engasjerte progenitorceller CFU-GM, BFU-E, CFU-E og blandede kolonidannende enheter i kultur. Innholdet av sistnevnte under dyrking på et materunderlag av AGM-S3-linjeceller øker fra 10 til 80 ganger. Dermed inneholder mikromiljøet i AGM-regionen stromale baseceller som effektivt støtter hematopoiesen, slik at AGM-regionen i seg selv godt kan fungere som et embryonalt hematopoietisk organ – en kilde til definitive HSC-er, det vil si HSC-er som danner det hematopoietiske vevet til et voksent dyr.

Utvidet immunofenotyping av den cellulære sammensetningen av AGM-regionen viste at den ikke bare inneholder multipotente hematopoietiske celler, men også celler som er dedikert til myeloid og lymfoid (T- og B-lymfocytter) differensiering. Imidlertid avslørte molekylær analyse av individuelle CD34+c-kit+ celler fra AGM-regionen ved bruk av polymerasekjedereaksjon aktivering av kun beta-globin- og myeloperoksidasegener, men ikke lymfoide gener som koder for syntesen av CD34, Thy-1 og 15. Delvis aktivering av avstamningsspesifikke gener er karakteristisk for tidlige ontogenetiske stadier av genereringen av HSC-er og progenitorceller. Tatt i betraktning at antallet dedikerte progenitorceller i AGM-regionen til et 10-dagers embryo er 2-3 størrelsesordener lavere enn i leveren, kan det argumenteres for at på den 10. dagen av embryogenesen er hematopoiesen i AGM-regionen så vidt i begynnelsen, mens de hematopoietiske linjene allerede har utviklet seg i fosterets hovedhematopoietiske organ i denne perioden.

I motsetning til tidligere (9–11 dager gamle) hematopoietiske stamceller fra plommesekken og AGM-regionen, som gjenoppbygger det hematopoietiske mikromiljøet til den nyfødte, men ikke den voksne organismen, krever ikke lenger hematopoietiske progenitorceller fra den 12–17 dager gamle embryonale leveren et tidlig postnatalt mikromiljø og befolker de hematopoietiske organene til et voksent dyr ikke verre enn en nyfødt. Etter transplantasjon av embryonale lever-HSC-er hadde hematopoiesen hos bestrålte voksne mottakermus en polyklonal karakter. I tillegg ble det ved bruk av merkede kolonier vist at funksjonen til de innpodede klonene er fullstendig underlagt den klonale suksesjonen som avsløres i den voksne benmargen. Følgelig har embryonale lever-HSC-er, merket under de mest skånsomme forholdene, uten forstimulering med eksogene cytokiner, allerede de viktigste egenskapene til voksne HSC-er: de krever ikke et tidlig postembryonalt mikromiljø, går inn i en tilstand av dyp dvale etter transplantasjon, og mobiliseres til klonal dannelse sekvensielt i samsvar med den klonale suksesjonsmodellen.

Det er åpenbart nødvendig å dvele ved fenomenet klonal suksesjon mer detaljert. Erytropoiese utføres av hematopoietiske stamceller som har et høyt proliferativt potensial og evnen til å differensiere til alle linjer av forløperceller til blodceller. Ved normal intensitet av hematopoiese er de fleste hematopoietiske stamceller i en sovende tilstand og mobiliseres for proliferasjon og differensiering, og danner sekvensielt kloner som erstatter hverandre. Denne prosessen kalles klonal suksesjon. Eksperimentelle bevis på klonal suksesjon i det hematopoietiske systemet ble oppnådd i studier med HSC-er preget av retroviral genoverføring. Hos voksne dyr opprettholdes hematopoiese av mange samtidig fungerende hematopoietiske kloner, derivater av HSC-er. Basert på fenomenet klonal suksesjon er det utviklet en repopulasjonsmetode for identifisering av HSC-er. I henhold til dette prinsippet skilles det mellom langsiktige hematopoietiske stamceller (LT-HSC), som er i stand til å gjenopprette det hematopoietiske systemet gjennom hele livet, og kortsiktige HSC, som utfører denne funksjonen i en begrenset periode.

Hvis vi ser på hematopoietiske stamceller fra et repopuleringsmetodisk synspunkt, er det særegne ved hematopoietiske celler i den embryonale leveren deres evne til å lage kolonier som er betydelig større enn de som vokser fra navlestrengsblod eller benmargs-HSC-er, og dette gjelder alle typer kolonier. Dette faktum alene indikerer et høyere proliferativt potensial for hematopoietiske celler i den embryonale leveren. En unik egenskap ved hematopoietiske stamceller i den embryonale leveren er en kortere cellesyklus sammenlignet med andre kilder, noe som er av stor betydning med tanke på effektiviteten av repopulering av hematopoietiske organer under transplantasjon. Analyse av den cellulære sammensetningen av den hematopoietiske suspensjonen oppnådd fra kilder til en moden organisme indikerer at i alle stadier av ontogenesen er kjerneceller hovedsakelig representert av endelig differensierte celler, hvis antall og fenotype avhenger av den ontogenetiske alderen til giveren av hematopoietisk vev. Spesielt består suspensjoner av mononukleære celler fra benmarg og navlestrengsblod av mer enn 50 % modne celler fra lymfoidserien, mens det hematopoietiske vevet i den embryonale leveren inneholder mindre enn 10 % lymfocytter. I tillegg er cellene fra den myeloide avstamningen i den embryonale og føtale leveren hovedsakelig representert av erytroidserien, mens granulocytt-makrofagelementer dominerer i navlestrengsblod og benmarg.

Det er også viktig at den embryonale leveren inneholder et komplett sett av de tidligste hematopoietiske forløperne. Blant de sistnevnte bør erytroide, granulopoietiske, megakaryopoietiske og multilineage-kolonidannende celler bemerkes. Deres mer primitive forløpere - LTC-IC - er i stand til å proliferere og differensiere in vitro i 5 uker eller mer, og beholder også funksjonell aktivitet etter innpoding i mottakerens kropp under allogen og til og med xenogen transplantasjon til immunsviktige dyr.

Den biologiske hensiktsmessigheten av overvekten av erytroide celler i den embryonale leveren (opptil 90 % av det totale antallet hematopoietiske elementer) skyldes behovet for å forsyne det raskt økende blodvolumet til det utviklende fosteret med erytrocyttmasse. I den embryonale leveren er erytropoiesen representert av kjerneære erytroide forløpere av varierende grad av modenhet som inneholder føtalt hemoglobin (a2u7), som på grunn av sin høyere affinitet for oksygen sikrer effektiv absorpsjon av sistnevnte fra morsblod. Intensivering av erytropoiesen i den embryonale leveren er assosiert med en lokal økning i syntesen av erytropoietin (EPO). Det er verdt å merke seg at tilstedeværelsen av erytropoietin alene er tilstrekkelig for å realisere det hematopoietiske potensialet til hematopoietiske celler i den embryonale leveren, mens en kombinasjon av cytokiner og vekstfaktorer bestående av EPO, SCF, GM-CSF og IL-3 er nødvendig for forpliktelsen av benmargs- og navlestrengsblod-hstceller til erytropoiesen. Samtidig reagerer ikke tidlige hematopoietiske stamceller isolert fra den embryonale leveren, som ikke har reseptorer for EPO, på eksogent erytropoietin. For induksjon av erytropoiese i en suspensjon av mononukleære celler fra den embryonale leveren, er tilstedeværelsen av mer avanserte erytropoietin-sensitive celler med CD34+CD38+ fenotypen, som uttrykker EPO-reseptoren, nødvendig.

I litteraturen er det fortsatt ingen enighet om utviklingen av hematopoiesen i embryonalperioden. Den funksjonelle betydningen av eksistensen av ekstra- og intraembryonale kilder til hematopoietiske stamceller er ikke fastslått. Det er imidlertid ingen tvil om at leveren er det sentrale organet for hematopoiesen i menneskelig embryogenese, og i 6. til 12. svangerskapsuke fungerer den som hovedkilden til hematopoietiske stamceller som befolker milten, tymus og benmargen. GDR-er sikrer utførelsen av de tilsvarende funksjonene i pre- og postnatal utviklingsperiode.

Det skal igjen bemerkes at den embryonale leveren, sammenlignet med andre kilder, er preget av det høyeste innholdet av HSC-er. Omtrent 30 % av CD344-cellene i den embryonale leveren har CD38-fenotypen. Samtidig er antallet lymfoide progenitorceller (CD45+) i de tidlige stadiene av hematopoiesen i leveren ikke mer enn 4 %. Det har blitt fastslått at etter hvert som fosteret utvikler seg, fra 7. til 17. svangerskapsuke, øker antallet B-lymfocytter gradvis med et månedlig "trinn" på 1,1 %, mens nivået av HSC-er synker permanent.

Den funksjonelle aktiviteten til hematopoietiske stamceller avhenger også av embryonal utviklingsperiode for kilden. Studien av den kolonidannende aktiviteten til leverceller fra menneskelige embryoer ved 6–8 og 9–12 ukers svangerskap under dyrking i et halvflytende medium i nærvær av SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 og EPO viste at det totale antallet kolonier er 1,5 ganger høyere ved såing av HSC-er fra embryonal lever i tidlige utviklingsstadier. Samtidig er antallet myelopoiese-progenitorceller som CFU-GEMM i leveren ved 6–8 ukers embryogenese mer enn tre ganger høyere enn antallet ved 9–12 ukers svangerskap. Generelt var den kolonidannende aktiviteten til hematopoietiske leverceller fra embryoer i første trimester av svangerskapet betydelig høyere enn for føtale leverceller i andre trimester av svangerskapet.

Dataene ovenfor indikerer at den embryonale leveren ved begynnelsen av embryogenesen ikke bare kjennetegnes av et økt innhold av tidlige hematopoietiske stamceller, men at dens hematopoietiske celler er karakterisert av et bredere spekter av differensiering til ulike cellelinjer. Disse trekkene ved den funksjonelle aktiviteten til hematopoietiske stamceller i den embryonale leveren kan ha en viss klinisk betydning, siden deres kvalitative egenskaper lar oss forvente en uttalt terapeutisk effekt ved transplantasjon selv ved et lite antall celler oppnådd i tidlige stadier av svangerskapet.

Likevel er problemet med mengden hematopoietiske stamceller som kreves for effektiv transplantasjon fortsatt åpent og relevant. Det gjøres forsøk på å løse dette ved å bruke det høye potensialet for selvreproduksjon av hematopoietiske celler i den embryonale leveren in vitro når de stimuleres av cytokiner og vekstfaktorer. Med konstant perfusjon av tidlige embryonale lever-HSC-er i en bioreaktor er det etter 2–3 dager mulig å oppnå en mengde hematopoietiske stamceller ved produksjon som er 15 ganger høyere enn deres opprinnelige nivå. Til sammenligning bør det bemerkes at det kreves minst to uker for å oppnå en 20-dobling i produksjonen av HSC-er fra humant navlestrengsblod under de samme forholdene.

Dermed skiller den embryonale leveren seg fra andre kilder til hematopoietiske stamceller ved et høyere innhold av både engasjerte og tidlige hematopoietiske progenitorceller. I kultur med vekstfaktorer danner embryonale leverceller med CD34+CD45Ra1 CD71l0W-fenotypen 30 ganger flere kolonier enn lignende navlestrengsblodceller og 90 ganger flere enn benmargs-HSC-er. De mest uttalte forskjellene i de spesifiserte kildene er i innholdet av tidlige hematopoietiske progenitorceller som danner blandede kolonier - mengden CFU-GEMM i den embryonale leveren overstiger mengden i navlestrengsblod og benmarg med henholdsvis 60 og 250 ganger.

Det er også viktig at frem til den 18. uken med embryonal utvikling (perioden for starten av hematopoiesen i benmargen) er mer enn 60 % av levercellene involvert i implementeringen av den hematopoietiske funksjonen. Siden det menneskelige fosteret ikke har en tymus og dermed tymocytter frem til den 13. uken med utvikling, reduserer transplantasjon av hematopoietiske celler fra embryonal lever fra 6–12 ukers svangerskap risikoen for å utvikle en "graft versus host"-reaksjon betydelig og krever ikke valg av en histokompatibel donor, siden det gjør det relativt enkelt å oppnå hematopoietisk kimerisme.