Diagnostisering av herpes

Diagnose av herpes er basert på klassisk virusisolering på sensitive cellekulturer, immunofluorescens- og serologiske metoder, kolposkopisk undersøkelse og bruk av moderne molekylærbiologiske metoder (PCR, punkthybridisering), som tillater diagnostisering av hele gruppen av herpesvirus, inkludert typene HHV-6 og HHV-7.

Laboratoriediagnostiske metoder for herpesinfeksjon

De viktigste metodene som tar sikte på å isolere HSV eller oppdage viruspartikler og/eller deres komponenter	Hjelpemetoder rettet mot å oppdage antistoffer mot HSV i biologiske væsker i menneskekroppen
Isolering av HSV i sensitive celle- og dyrekulturer Direkte og immun elektronmikroskopi Direkte og indirekte varianter av IPA IFA Molekylærbiologiske metoder Lateksagglutinasjonsreaksjon	Nøytraliseringsreaksjon RSC Bestemmelse av antistoffer mot ikke-strukturelle proteiner av HSV-1,2

Det ble vist at hos 76 % av pasientene er genital herpes (GH) forårsaket av HSV-2, og hos 24 % av HSV-1. Dessuten forekom GH som en monoinfeksjon bare hos 22 % av pasientene, og i 78 % av tilfellene ble det oppdaget mikrobielle assosiasjoner. Hos 46 % av individene ble parasitocenose forårsaket av to patogener oppdaget, inkludert klamydia, i 40 % av tilfellene. Gardnerella, trichomonas og gonokokker ble sjeldnere oppdaget i utstryk.

Hos 27 % av pasientene var parasitocenosen representert av tre patogener, hos 5,2 % av fire patogener. Dessuten ble det oftest observert en kombinasjon av klamydia med gardnerella og Candida-sopp. Disse dataene underbygger behovet for en grundig bakteriologisk undersøkelse av pasienter med veksthormon (GH) for å identifisere kombinasjoner av patogene stoffer, samt en grundig studie av patogenesen til blandede infeksjoner i urogenitaltrakten, noe som vil muliggjøre differensiert kompleks behandling av herpesinfeksjon.

Materialer studert for isolering av HSV avhengig av lokalisering av herpeslesjoner

Lokalisering av lesjoner	Vesikkelinnhold	Celleskraping				CSF	Bronkial aspirat	Biopsi	Blod
		1	2	3	4
Lær	+								+
Øyne			+						+
Genitalier				+					+
Anus	+				+				+
Munn	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Lungene		+					+		+
Lever								+	+
Medfødt herpes	+	+	+				+		+

Metoder for laboratoriediagnostikk av cytomegalovirusinfeksjon

Metoder	Tid som kreves for å oppnå resultater	Notater
VIROLOGISK
Elektronmikroskopi	3 timer	Ikke veldig tilgjengelig
Virusisolering i cellekultur (VCI)	4–20 dager	Standard, sakte
Immunofluorescensfarging av tidlig AG ved bruk av monoklonale antistoffer	6 timer	Mindre spesifikk
CYTOLOGISK	2–3 timer	Mindre spesifikk
SEROLOGISK
RSC	2 dager	Standard
RGA	1 dag	Arbeidsintensiv
REV	6 timer	Enkel, spesifikk
NRIF	6 timer	Vanskelig
RIMP	6 timer	Vanskelig
ELISA (IgM, DO)	6 timer	Raskt, enkelt
Immunoblot	6 timer	Dyr
MOLEKYLÆRBIOLOGISK
MG	5–7 dager	Dyrt, arbeidskrevende
PCR	3 timer	Dyr

Metoder for diagnostikk av herpes zoster-virus

Diagnostiske metoder	Laboratorieteknikker
INDIREKTE
Utvalg	Vevskultur, kyllingembryoer, forsøksdyr, samkultur med permissive celler eller hjelpevirus
Identifisering av isolater	Nøytraliseringsreaksjon, RSC, IF, PIEF, reaksjon av isolater, utfelling, agglutinering, IF
DIREKTE
Cytologi	Utstryk: fargeimmunofluorescens
Histologi	Cellens patomorfologi
Struktur	Embryonal mikroskopi, immunoelektronmikroskopi
Bestemmelse av antigener	HVIS, PIEF, RIM, IFA
Bestemmelse av lokal antistoffproduksjon	IgM, IgG, IgA: ELISA, RIA
Molekylærbiologiske tilnærminger	Molekylær hybridisering, PCR

Laboratoriediagnostikk av infeksjon forårsaket av herpes zoster-virus

Diagnostiske problemer	Metoder	Forventede resultater
Akutt primærinfeksjon	1	Deteksjon på 2 timer
	2	Antistoffnivåene stiger sakte
	3	Tilstede 3 dager etter infeksjon
Akutt reaktivert infeksjon	1	Påvisning av UUU etter 2 timer
	2	Antistoffnivåene stiger sakte
	4	Tilstede 4 dager etter at utslettet dukker opp

1. bestemmelse av vesikler av VEGF i væske;
2. serologi: CSC, ELISA, rettet mot deteksjon
3. serologi: ELISA rettet mot å påvise IgM;
4. serologi: ELISA rettet mot å påvise IgA, IgM.

Metoder for å indikere immunresponsen mot herpes zoster-virusinfeksjon

Nærme	Metode
Påvisning av en økning i antistofftiter i det andre serumet	RSK, RTGA, RPGA, IF-nøytraliseringsreaksjon, RIM, ELISA
Påvisning av Ig G- og Ig A-klassespesifikke antistoffer i den første serumprøven	ELISA, IF, RIM, lateksagglutinasjon

Tolkning av resultatene av serologisk undersøkelse av pasienters serum for herpesvirusinfeksjoner (ELISA)

Navn på infeksjon/markør	Gjennomsnittlige terskelverdier for infeksjoner
	Resultater av analysen	Tolkning
Cytomegali Anti-CMV IgG (1–20 U/ml) Anti-CMV IgM (100–300 %)	Positiv 1–6 Positiv 6–10 Positiv >10 Negativ Positiv 100–300 Negativ <90 Tvilsom 90–100	Remisjon Forverring av sykdommen Akutt sykdomsfase Ingen infeksjon (sykdom) Akutt sykdomsfase Gjenta analysen om 2–3 uker
Herpes simplex 1,2 serotyper Anti-HSV 1/2 totalt (100–900 %)	Positiv 100–400 Positiv 400–800 Positiv >800 Negativ <100	Remisjon Forverring av sykdommen Akutt fase av sykdommen Ingen infeksjon (sykdom)

Tabellen presenterer de viktigste metodene for laboratoriediagnostikk av herpesvirusinfeksjoner, samt anbefalte biologiske materialer som undersøkes ved isolering av HSV, tatt i betraktning lokaliseringen av herpeslesjoner.

Pålitelig isolering av herpes simplex- og CMV-virus ved å infisere sensitive cellekulturer. Under virologisk undersøkelse av 26 pasienter i tilbakefallsperioden ble HSV isolert på en sensitiv Vero-cellekultur i 23 tilfeller (88,4 %). Infiserte kulturer viste et bilde av cytopatisk virkning typisk for HSV - dannelsen av flerkjernede kjempeceller eller en akkumulering av avrundede og forstørrede celler i form av klynger. I 52,1 % av tilfellene kunne fokus på cytopatisk virkning av viruset påvises allerede 16–24 timer etter infeksjon. Ved 48–72 timers inkubasjon av infiserte kulturer økte prosentandelen av materialer som forårsaker spesifikk ødeleggelse av celler til 87 %. Og bare i 13 % av tilfellene ble positive resultater påvist 96 timer etter infeksjon eller mer, eller under gjentatt passage.

Metoder for laboratoriediagnostikk av generalisert herpesinfeksjon

De viktigste metodene som tar sikte på å oppdage (isolere) herpesvirus, deres partikler og deres komponenter	Hjelpemetoder rettet mot å oppdage antistoffer mot herpesvirus i biologiske væsker, og oppdage enzymatiske endringer i blodserum
Isolering av herpesvirus på sensitive celle- og dyrekulturer Direkte og immun elektronmikroskopi Direkte og indirekte varianter av immunoperoksidasemetoden Direkte og indirekte varianter av fluorescerende antistoffmetode Varianter av fastfase enzymimmunoanalyse Varianter av molekylær (DNA-DNA) hybridiseringsmetoden Polymerasekjedereaksjon Lateksagglutinasjonsreaksjon	Nøytraliseringstest Komplementfikseringstest Lateksagglutineringstest Indirekte versjon av fluorescerende antistoffmetode Indirekte versjon av immunoperoksidasemetoden Varianter av fastfase-enzymimmunoanalyse Immunblottingmetode Radial komplementfikseringsmetode Bestemmelse av alanin- og aspartataminotransferasenivåer

Serologiske metoder brukes til å diagnostisere infeksiøs mononukleose (en infeksjon forårsaket av EBV). Paul-Bunnell-reaksjonen med røde blodceller fra vær, en diagnostisk titer på 1:28 eller høyere i en enkelt blodserumtest, eller en 4-dobling av antistoffer ved undersøkelse av parede serum. Hoff-Bauer-reaksjonen med en 4 % suspensjon av formaliserte røde blodceller fra hest brukes. Resultatet tas i betraktning etter 2 minutter; ved infeksiøs mononukleose er reaksjonen svært spesifikk.

For tiden utvikles en enzymimmunoanalyse (EIA)-metode for diagnostisering av infeksiøs mononukleose. I dette tilfellet bestemmes IgG- og IgM-antistoffer i pasientens serum ved å inkubere det med lymfoblaster infisert med EBV, etterfulgt av behandling med fluorescerende antistoffer. I den akutte perioden av sykdommen bestemmes antistoffer mot det virale kapsidantigenet i en titer på 1:160 og høyere.

Ved bruk av en rekke importerte kommersielle testsystemer kan ELISA påvise: antistoffer mot EBV-konvoluttantistoffer, antistoffer mot EBV tidlig antigen, totale antistoffer mot EBV tidlig antigen, bestemt i den akutte fasen av sykdommen både i kjernen og i cellecytoplasmaet, og begrensede antistoffer mot tidlig EBV, bestemt i den akutte fasen av sykdommen både i kjernen og i cellecytoplasmaet, begrensede antistoffer mot EBV tidlig antigen, bestemt på høyden av sykdommen kun i cellecytoplasmaet, og antistoffer mot EBV nukleært antigen. Bruken av disse testsystemene muliggjør differensialdiagnostikk av en rekke sykdommer assosiert med EBV.

Etter en positiv ELISA-test som avslører antistoffer mot EBV, utføres en bekreftende immunoblotting-reaksjon, som bestemmer tilstedeværelsen av antistoffer mot individuelle EBV-markørproteiner (p-proteiner): p23, p54, p72 (tilstedeværelsen av dette proteinet indikerer muligheten for EBV-reproduksjon), p 138. Ovennevnte laboratoriemetoder brukes også til å overvåke effektiviteten av behandlingen.

Sensitiviteten til virologiske metoder er 85–100 %, spesifisiteten er 100 %, studietiden er 2–5 dager. Den direkte immunofluorescensmetoden (DIF) med polyklonale eller monoklonale antistoffer mot HSV-1 og HSV-2 brukes ofte i praktisk arbeid. DIF-metoden er ganske enkel å reprodusere i et vanlig klinisk laboratorium, er ikke dyr, sensitiviteten er over 80 %, spesifisiteten er 90–95 %. Immunofluorescensmikroskopi avdekket tilstedeværelsen av cytoplasmatiske inneslutninger, morfologiske trekk, prosentandelen av infiserte celler i utstryk/skrap fra urinrøret, livmorhalskanalen, livmorhalsen, endetarmen.

PIF-metoden gir en idé om cellenes morfologiske egenskaper og endringer i lokaliseringen av HSV-antigener. I tillegg til direkte tegn på celleskade forårsaket av herpesvirus (påvisning av spesifikk luminescens), finnes det indirekte tegn på herpesinfeksjon i henhold til PIF-data:

• aggregering av kjernestoff, løsrivelse av karyolemmaet;
• tilstedeværelsen av såkalte "hull"-kjerner, når bare ett karyolemma gjenstår fra cellekjernen;
• tilstedeværelsen av intranukleære inneslutninger - Cowdry-legemer.

Når legen utfører PIF, mottar vedkommende ikke bare en kvalitativ, men også en kvantitativ vurdering av tilstanden til infiserte celler, som vi brukte for å vurdere effektiviteten av den antivirale behandlingen med acyklovir (AC). Dermed ble 80 pasienter med enkel genital herpes (GH) undersøkt ved hjelp av PIF-metoden i dynamikk. Det ble vist at hvis 88 % av pasientene hadde en høy prosentandel infiserte celler (50–75 % og høyere) i utstryk før behandling med acyklovir, ble det etter én kur med acyklovir oppdaget friske celler i utstryk hos 44 % av pasientene, i 31 % av tilfellene ble det observert enkeltstående infiserte celler, og hos 25 % av pasientene var det opptil 10 % infiserte celler.

Innhold av infiserte celler i utstryk (PIF-reaksjon) hos pasienter med genital herpes behandlet med acyklovir

Perioder med sykdom	Prosentandel innhold i utstryk
	Infiserte celler					Normale celler
	Mer enn 75 %	50–75 %	40–50 %	10 %	Enkeltceller i synsfeltet
Tilbakefall (før behandling)	25 %	63 %	12 %
	(20)	(50)	(10)
Remisjon (etter behandling)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Ved å bruke PIF og dot-hybridiseringsmetoden i mange år, har det blitt bemerket at resultatene av studien samsvarer i nesten 100 % av tilfellene. Det bør bemerkes at for å øke påliteligheten av herpesdiagnosen, spesielt i tilfeller av subkliniske og lavmanifesterte former for herpes, anbefales det å bruke 2-3 metoder for laboratoriediagnostikk i arbeidet, spesielt når man undersøker gravide, kvinner med en ugunstig obstetrisk historie og personer med en uspesifisert gynekologisk diagnose.

Ved PCR-diagnostikk av virus- og bakterieinfeksjoner i urogenitaltrakten er det derfor nødvendig å evaluere de positive resultatene som er oppnådd, tatt i betraktning anamnesen og tilstedeværelsen (eller fraværet) av spesifikke kliniske symptomer på sykdommen. Hvis klamydia oppdages ved hjelp av PCR, er det i dette tilfellet høy sannsynlighet for infeksjon, og behandlingsproblemene kan løses deretter. Ved påvisning av mykoplasmer (ureaplasmer), som er opportunistiske mikroorganismer, kreves det ytterligere kulturstudier for å bekrefte diagnosen, dvs. såing av materiale fra pasienten på sensitive cellekulturer. Bare hvis positive resultater oppnås i kulturanalysen, kan vi snakke om laboratoriebekreftelse av diagnosen mykoplasmose. Den samme metoden vil om nødvendig tillate å bestemme følsomheten til de isolerte mykoplasmene for ofte brukte doseringsformer (antibiotika, fluorokinoloner, etc.).

Samtidig infeksjon med flere virus av Herpesviridae-familien er mulig. Vi oppdaget ofte infeksjon hos én pasient med HSV-1-, HSV-2- og CMV-virus. Pasienter med kliniske og laboratoriemessige manifestasjoner av sekundær IDS (onkohematologiske, onkologiske, HIV-infiserte pasienter) var betydelig oftere infisert med flere herpesvirus. Det har derfor blitt vist at kliniske og immunologiske lidelser som utvikler seg ved HIV-infeksjon er ledsaget av en økning i antall herpesvirus oppdaget ved molekylær hybridisering. I dette tilfellet kan den mest prognostisk signifikante anses som den komplekse samtidige deteksjonen av HSV-1-, CMV- og HHV-6-type DNA.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]