Begrensninger, farer og komplikasjoner av celletransplantasjon

Plast-regenerativ medisin er basert på den innsikt i klinikken og toti- egenskaper pluripotente embryonale stamceller og forløperceller, slik at in vitro og in vivo for å skape en forutbestemt cellelinjer repopulerende skadet vev og organer i en human pasient.

Den reelle muligheten for å bruke stamceller fra embryo og stamceller av definitive vev (de såkalte voksne stamceller) av et menneske til terapeutiske formål, er ikke lenger i tvil. Eksperter ved de nasjonale og medisinske akademiene i USA (USA) anbefaler imidlertid at egenskapene til stamceller i eksperimenter studeres mer detaljert på tilstrekkelige biologiske modeller og objektivt vurdere alle konsekvensene av transplantasjon, og bare deretter bruke stamceller i klinikken.

Det er fastslått at stamceller er en del av vevsderivatet av alle tre embryonale brosjyrer. Stamceller er funnet i netthinnen, hornhinne, hud, epidermis, benmarg og perifert blod, i karene, massen av tannen, nyre, epitelet av fordøyelseskanalen, bukspyttkjertelen og leveren. Ved hjelp av moderne metoder er det bevist at stamceller er lokalisert i voksen hjerne og ryggmargen. Disse sensasjonelle data tiltrukket spesiell oppmerksomhet fra forskere og media, siden hjernens nevroner fungerte som et klassisk eksempel på en statisk cellepopulasjon som ikke gjenoppretter. Både tidlig og sent perioder med ontogenese grunn av nevrale stamceller i mennesker og dyr hjerne generert nevroner, astrocytter og oligodendrocytter (Stamceller: vitenskapelige fremskritt og fremtidige forsknings retninger Nat Inst, Helse USA ..).

Under normale forhold, oppstår imidlertid ikke plasticiteten av stamceller av endelig vev. For å realisere plastpotensialet til stamceller av endelig vev, må de isoleres og dyrkes deretter i medier med cytokiner (LIF, EGF, FGF). Dessuten overlevde stamcellederivater vellykket bare når de transplantertes i kroppen av et dyr med deprimert immunsystem (y-bestråling, cytostatika, busulfan, etc.). Hittil har det ikke vært overbevisende bevis på stamcelleplasticitet hos dyr som ikke har blitt bestrålt eller på annen måte utsatt for dyp immunosuppresjon.

Under slike omstendigheter er farlige potens PGC-er manifestert i hovedsak i deres ektopisk transplantasjon område - subkutan injeksjon ESK immunsvikt mus på injeksjonsstedet dannede teratokarsinom. Videre, under human embryonal utvikling frekvens av kromosomfeil enn i embryogenesen i dyr. På blastocyststadiet bare 20-25% av humane embryoer er sammensatt av celler med en normal karyotype, og i de aller fleste tidlige humane embryoer som oppnås etter befruktning in vitro kromosomal mosaicism detektert kaotiske og meget hyppige numeriske og strukturelle avvik.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Fordelaktig effekt av stamceller

Foreløpige resultater av kliniske studier bekrefter den gunstige effekten av stamceller på pasienten, men så langt er det ingen informasjon om de langsiktige konsekvensene av celletransplantasjon. I litteraturen, først dominert av rapporter om positive resultatene av transplantasjon av marg fragmenter av embryoene i Parkinsons sykdom, men deretter begynte å dukke opp de data som nekter effektive terapeutiske virkninger av embryonale eller føtale neuralt vev transplantert inn i hjernen til pasienter.

I midten av XX-tallet restaurering av hematopoiesis først ble oppdaget i letalt bestrålte dyr etter intravenøs transfusjon av benmargceller, og i 1969 American forskeren D. Thomas utføres den første benmargstransplantasjon menneske. Mangel på kunnskap om mekanismene for immunologisk uforenlighet benmarg donor og mottaker mens forårsaket høy dødelighet på grunn av hyppig neprizhivleniya pode og utvikling reaksjon "transplantat versus vert". Oppdagelsen av hovedhistokompatibilitetskomplekset, som er sammensatt av human leukocytt antigen (HbA), og forbedring av fremgangsmåter for å skrive det mulig å vesentlig øke overlevelsesgraden etter benmargstransplantasjon, noe som førte til omfattende denne metoden for behandling i onkologi og Hematology. Etter et tiår ble den første transplantasjonen av hematopoietiske stamceller (HSC) oppnådd fra perifert blod ved hjelp av leukaferese utført. I 1988 i Frankrike for behandling av barn med fanconi anemi som en kilde for HSCs det ble først brukt navlestrengsblod, og på slutten av 2000 i pressen begynte å vise seg om evnen til HSCs til å differensiere i celler av forskjellige vevstyper som potensielt utvider omfanget av deres kliniske anvendelse. Imidlertid viste det seg at materialet for transplantasjon, sammen med GSK, inneholder en betydelig mengde ikke-hemopoietiske celler, som er forskjellige i natur og egenskaper. I forbindelse med dette utvikles metoder for rensing av transplantatet og kriteriene for vurdering av dets cellulære renhet. Spesielt brukes positiv immunoseksjon av CD34 + -celler, som gjør det mulig å isolere HSC ved hjelp av monoklonale antistoffer.

[8], [9], [10], [11], [12]

Komplikasjoner av stamcelle terapi

Komplikasjoner av benmargstransplantasjon er oftest hematologiske og er forbundet med en langvarig periode med iatrogen pankytopeni. De vanligste infeksjonene er anemi, anemi og blødninger. I denne forbindelse er det ekstremt viktig å velge den optimale modusen for prøvetaking, bearbeiding og lagring av beinmarg for maksimal bevaring av stamceller, noe som vil sikre rask og stabil gjenoppretting av hematopoiesis. Ved karakterisering av en transplantasjon er det for tiden akseptert å evaluere følgende parametere: antall mononukleære og / eller kjernefysiske celler, kolonidannende enheter og innholdet av SB34-positive celler. Dessverre gir disse indikatorene bare et indirekte estimat av stamcelletransplantasjonsbefolkningens reelle hematopoietiske evne. For i dag er det absolutt presise parametere for å bestemme transplantatets tilstrekkelighet for langsiktig gjenoppretting av hemopoiesis hos pasienter selv i autolog benmargstransplantasjon. Utviklingen av felles kriterier er ekstremt vanskelig på grunn av mangel på stive prosessstandarder, kryopreservering og graftesting. I tillegg er det nødvendig å ta hensyn til ulike faktorer som påvirker parametrene for vellykket utvinning av hematopoiesis hos hver enkelt pasient. I autolog benmargstransplantasjon de viktigste av disse er det antall av tidligere behandlingsregimer, spesielt regimet, en periode av sykdommen, som er produsert i benmargen innsamlingen søknad kolonistimulerende faktorer i fasen etter transplantasjonen. I tillegg bør det ikke glemmes at kjemoterapi som foregår av fostertransplantasjon, kan ha en negativ effekt på benmargestamceller.

Forekomsten av alvorlige toksiske komplikasjoner øker betydelig med allogen benmargstransplantasjon. I denne forbindelse er statistiske data om transplantasjon av allogent benmarg i thalassemi av interesse. I rapporter fra European Bone Marrow Transplantation Group ble rundt 800 beinmargstransplantasjoner registrert hos pasienter med stor thalassemi. Allogen transplantasjon i talassemi i de fleste tilfeller utført fra HLA-identisk søsken, som er forbundet med alvorlige komplikasjoner og høyere mortalitet i transplantasjon av stamcelle materiale relatert delvis kompatible eller matchet-relaterte donorer. For å minimere risikoen for alvorlige infeksiøse komplikasjoner, pasienter er plassert i isolerte aseptisk eske med laminær strømning, er lav eller abacterial diett. For bakteriell dekontaminering av tarmen per os foreskriver ikke-reseptive former for antibiotika, antifungale stoffer. For å hindre intravenøs amfotericin B. Forebygging av system-infeksjoner faste amikacin og ceftazidim, som utpeker den dagen før transplantasjonen, mens behandlingen fortsetter til ut pasienter. Alle blodpreparater før bestråling bestråles i en dose på 30 Gy. Parenteral ernæring under transplantasjon er en forutsetning og begynner umiddelbart ved å begrense inntaket av mat naturlig.

Et antall av komplikasjoner forbundet med høye toksisitet av immunosuppressive legemidler, som ofte forårsaker kvalme, brekninger og mukositt, nyreskade, og interstitiell lungebetennelse. En av de mest alvorlige komplikasjonene ved kjemoterapi er veno-okklusiv sykdom i leveren, noe som fører til døden i den tidlige posttransplantasjonsperioden. Blant de risikofaktorer for venøs trombose av portalen system av leveren bør bemerkes pasientens alder, nærvær av hepatitt og leverfibrose, og holder immunsuppressiv behandling etter benmargstransplantasjon. Veno-okklusiv sykdom er spesielt farlig i thalassemia, som er ledsaget av hemosiderose i leveren, hepatitt og fibrose - hyppige satellitter av transfusjonsterapi. Venøs trombose i portalen systemet i leveren utvikles i løpet av 1-2 uker etter transplantasjonen, og er kjennetegnet ved en hurtig økning i blod bilirubin og transaminaser, progressiv hepatomegali, ascites, encefalopati, og smerte i den øvre del av magen. Histologisk obduksjon materialet som er angitt i endotelial skade, subendoteliale blødning, lesjoner tsentrolobulyarnyh hepatocytter, trombotiske obstruksjon hepatiske venuler og den sentrale vene. Hos pasienter med thalassemi er tilfeller av dødelig hjertestans forbundet med toksiske effekter av cytostatika blitt beskrevet.

Som forberedelse til transplantasjon forårsaker cyklofosfamid og busulfan ofte giftig hemorragisk blærebetennelse med patologiske forandringer i uropiteliale celler. Bruken av cyklosporin A i beinmargstransplantasjon følger ofte med effekter av nefro- og nevrotoksisitet, hypertensjonssyndrom, væskeretensjon i kroppen og cytolyse av hepatocytter. Brudd på seksuell og reproduktiv funksjon observeres oftere hos kvinner. Hos små barn etter transplantasjon lider pubertetsutvikling vanligvis ikke, men hos eldre barn kan patologien til utvikling av kjønnslemmen være svært alvorlig - opp til sterilitet. Komplikasjoner direkte relatert til selve transplantasjonen inkluderer avvisning av allogene benmargsceller, inkompatibilitet i ABO-systemet, akutte og kroniske former for "graft versus host" reaksjonen.

I pasienten etter transplantasjonen ABO-uforenlig benmarg idioagglutinin type "vert mot donor ABO" produsert i 330-605 dager etter transplantasjon, noe som kan føre til forlenget hemolyse og en sterk økning i behovet for blodtransfusjon. Nevnte komplikasjon forhindres ved transfusjon av erytrocytter grupper bare 0. Etter transplantasjon i et antall pasienter autoimmun nøytropeni, trombocytopeni, pancytopeni, eller, for den korreksjon som skal utføres splenektomi.

I 35-40% av mottakere av akutt reaksjon "transplantat versus vert" utvikles i løpet av 100 dager etter transplantering av allogene hemoglobin-identisk benmarg. Graden av hudlesjoner, lever og tarmer varierer fra utslett, hyperbilirubinemi, diaré og mild mot huden avskalling, intestinal obstruksjon, og akutt leversvikt. Pasienter med thalassemia frekvens akutt reaksjon "graft versus host" I utstrekning etter benmargstransplantasjon er 75%, II og i større grad - 11 til 53%. Kronisk reaksjon "transplantat versus vert" som en systemisk multi syndrom utvikles vanligvis i løpet av 100-500 dager etter transplantasjon av allogen benmargs i 30-50% av pasientene. Hud, munn, lever, øyne, spiserør og øvre luftveier påvirkes. Skille begrenset form av kroniske reaksjon "transplantat versus vert" når den berørte huden og / eller lever, og utbredt, generaliserte hudlesjoner ved kombinasjon med kronisk hepatitt aggressiv, øyesykdommer, spyttkjertler eller et annet organ. Dødsårsaken er ofte de smittsomme komplikasjonene som skyldes alvorlig immunsvikt. I thalassemi kronisk mild form for reaksjons "graft versus host" ble funnet i 12%, moderat - 3% og alvorlige - har 0,9% av mottakere av HLA-kompatibel allogen benmarg. En alvorlig komplikasjon i beinmargstransplantasjon er transplantasjonsavvisning, som utvikler 50-130 dager etter operasjonen. Avvisningsfrekvensen avhenger av kondisjoneringsmodusen. Spesielt pasienter med thalassemia behandlet i løpet av fremstillingen av metotreksat, er avvisning av benmargs pode observert i 26% av tilfellene, kombinasjoner av metotreksat med cyklosporin A - 9%, og ved tilordning av bare cyklosporin A - 8% av tilfellene (Haziyev etc. ., 1995).

Infeksiøse komplikasjoner etter transplantasjon av benmarg forårsaket av virus, bakterier og sopp. Deres utvikling er forbundet med dyp neutropeni, som induseres under kjemoterapi kondisjonering, cytostatika vinne mukosale barrierer og reaksjons "transplantat versus vert". Avhengig av tid på utvikling, er det tre faser av infeksjon. I den første fase (fremkallende i den første måneden etter transplantasjon) er dominert av skade på slimhinnebarriere og nøytropeni, ofte ledsaget av virusinfeksjoner (herpes, Epstein-Barr-virus, cytomegalovirus, Varicella zoster), så vel som infeksjoner forårsaket av grampolozhi - inflammatoriske og Gram-negative bakterier, Candida sopp , aspergillomer. I den tidlige perioden etter transplantasjonen (andre og tredje måneder etter transplantasjonen) er den mest alvorlige cytomegalovirus-infeksjon, som ofte fører til død av pasientene i den andre fasen av infeksjonen. Thalassemi cytomegalovirus-infeksjon etter transplantasjon av benmarg forekommer i 1,7 til 4,4% av mottakerne. Den tredje fase er observert i slutten av perioden etter transplantasjon (tre måneder etter operasjon), og er karakterisert ved alvorlig kombinert immunsvikt. Denne perioden er ofte funnet infeksjoner forårsaket av Varicella zoster, Streptococcus, Pneumocystis Carini, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, og hepatotrope virus. Thalassemi dødelighet hos pasienter etter benmargstransplantasjon er assosiert med bakterier og sopp sepsis, idiopatisk interstitiell lungebetennelse og cytomegalovirus, akutt lungesviktsyndrom, akutt hjertesvikt, hjertetamponade, hjerneblødning, venookklyuzionnoy leversykdommer og akutt reaksjon "transplantat versus vert".

For tiden er det gjort visse framskritt i utviklingsmetoder for isolering fra benmargen til en ren populasjon av stammehemopoietiske celler. Teknikken for å oppnå føtalblod fra navlestrengen har blitt forbedret, og metoder har blitt utviklet for å isolere bloddannende celler fra ledningsblod. I den vitenskapelige pressen er det rapporter om at når de dyrkes i medier med cytokiner, er hematopoietiske stamceller i stand til å formere seg. Ved bruk av spesialdesignede bioreaktorer for utvidelse av HSC, økes biomassen av stammehemopoietiske celler isolert fra beinmarg, perifert eller leddblod betydelig. Muligheten for HSC-utvidelse er et viktig skritt i den kliniske utviklingen av celletransplantasjon.

Imidlertid, før reproduksjon av HSC in vitro, er det nødvendig å isolere en homogen populasjon av hematopoietiske stamceller. Dette oppnås vanligvis ved hjelp av markører, slik at for selektivt å markere HSC monoklonale antistoffer kovalent bundet til magnetiske eller fluorescerende markør, og velge dem med en passende celle-sorterer. Samtidig er problemet med fenotypiske egenskaper av hematopoietiske stamceller ikke endelig løst. A. Petrenko., V. Hryschenko (2003) som kandidater for GSK-behandlede celler, som er til stede på overflaten av CD34, AC133 og etyl-antigener, og ingen CD38, HLA-DR og andre markører for differensiering (celler med fenotype CD34 + Liir). Ved lineære differensieringsmarkører (avstamning, Lin) og består av glykoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Ansett som lovende for transplantasjon av celler med fenotype CD34 + CD45RalüW CD71low, samt CD34 + Thyl + CD38low / c-kit / lav.

Problemet med antall HSC som er tilstrekkelig for effektiv transplantasjon forblir et problem. For tiden er kilden til stammebloddannende celler benmarg, perifert og leddblod, så vel som den embryonale leveren. Utvidelse av stammehemopoietiske celler oppnås ved å dyrke dem i nærvær av endotelcellytter og hematopoietiske vekstfaktorer. I forskjellige protokoller brukes myeloproteiner, SCF, erytropoietin, insulinlignende vekstfaktorer, kortikosteroider og østrogener til å inducere proliferasjon av HSC. Når kombinasjoner av cytokiner brukes in vitro, kan en signifikant økning i HSC-basseng oppnås med en topp av frigjøringen ved slutten av den andre dyrkningsweekend.

Tradisjonelt brukes HSC-ledningsblod hovedsakelig i hemoblastoser. Imidlertid er den minimale dose av hematopoetiske celler, som er nødvendige for en vellykket transplantering av ledningen blod celler er 3,7 x 10 ⁷ celler med kjerne per 1 kg kroppsvekt av mottageren. Ved å bruke en mindre mengde HSC øker risikoen for graftfeil og tilbakefall av sykdommen betydelig. Derfor er transplantasjon av bloddannende celler av navlestrengsblod hovedsakelig brukt til behandling av hemoblastose hos barn.

Dessverre er det fortsatt ingen standard blank, og standardiserte protokoller klinisk bruk av ledningen blod hematopoetiske celler. Følgelig seg stamceller fra navlestrengsblod er ikke juridisk anerkjent som en kilde av hematopoetiske stamceller for transplantasjon. I tillegg er det ingen etiske eller juridiske regler for aktiviteter og organisering av bredden av umbilical krovb som er tilgjengelig i utlandet. I mellomtiden, for sikkerheten til transplantasjon av navlestrengsblod, alle prøvene bør overvåkes nøye. Før blodprøvetaking ved begynnelsen av den gravide kvinnen må innhente samtykke til det. Hver gravid må undersøkes på en vogn av HBsAg, antistoffer mot hepatitt C-virus, HIV, og syfilis. Hver prøve av ledningen blod må testes på standard Antallet nukleerte celler og CD34 + kolonidannende evne. Videre HbA utført skrive, blodtype ABO og medlemskap i Rh-faktor. Testprosedyrer er nødvendig for dyrking på bakteriologisk sterilitet, serologiske tester for HIV-1 og HIV-2-infeksjon, HBsAg, hepatitt C-virus, cytomegalovirus-infeksjon, ntly ntly-1 og II, syfilis, toksoplasmose. I tillegg til deteksjon av cytomegalovirus og HIV-polymerase kjedereaksjon utføres. Det synes hensiktsmessig å utfylle analyse av protokoller testing navlestreng blod HSCs å identifisere slike genetiske sykdommer som thalassemia og sigdcelleanemi, adenosindeaminase mangel, agammaglobulinemia Bruton, sykdom Harlera og punter.

Ved neste stadium av forberedelse til transplantasjon oppstår spørsmålet om bevaring av GSK. Den farligste for cellers levedyktighet når de forberedes, er frysing og opptining. Når de hemopoietiske cellene fryses, kan en betydelig del av dem bli ødelagt på grunn av krystalldannelse. For å redusere andelen av celledød, brukes spesielle stoffer - kryobeskyttende midler. Som en kryobeskyttende middel brukes DMSO vanligvis ved en sluttkonsentrasjon på 10%. For DMSO er imidlertid denne konsentrasjon preget av en direkte cytotoksisk effekt, som manifesterer seg selv under forhold med minimal eksponering. Redusert cytotoksisk virkning som oppnås ved å opprettholde en stiv null temperatureksponering modus og regulering samsvar bearbeiding materiale under og etter tining (hastighet av alle manipulasjoner å anvende flere vaskeprosedyrer). Ikke bruk en DMSO-konsentrasjon på mindre enn 5%, siden i dette tilfellet oppstår massedød av hematopoietiske celler i frysepunktet.

Tilstedeværelsen av røde blodlegemer urenheter i suspensjonsblandingen GSK skaper faren for å utvikle en inkompatibilitetsreaksjon for erytrocytantigener. På samme tid, med fjerning av erytrocytter, øker tapet av hematopoietiske celler betydelig. I forbindelse med dette ble det foreslått en prosedyre for unfractionated isolasjon av GSK. I dette tilfelle, for å beskytte de kjerneinneholdende cellene fra de skadelige virkningene av lave temperaturer ved hjelp av 10% DMSO-løsning og avkjøling ved en konstant hastighet (HS / min) til -80 ° C, hvoretter celle-suspensjonen ble frosset i flytende nitrogen. Det antas at med denne kryopreserveringsmetoden finner en delvis lys av erytrocytene sted, derfor trenger blodprøver ikke fraksjonering. Før transplantasjonen opptyses cellesuspensjonen, vaskes fri for hemoglobin og DMSO i en oppløsning av humant albumin eller serum. Bevaring av hematopoetiske progenitorceller ved å bruke denne metoden er faktisk høyere enn etter ledningen blod fraksjonering, men faren for komplikasjoner på grunn av transfusjon av ABO-uforenlig transfusjoner av erytrocytt lagret.

Etableringen av et system av banker for lagring av HSC testet og HSC prøver kunne løse de ovennevnte problemene. Men for dette er det nødvendig å utvikle etiske og juridiske normer, som fremdeles bare blir diskutert. Før etableringen av et banktjenester, er det nødvendig å vedta en rekke bestemmelser og dokumenter om standardisering av prosedyrer for prøvetaking, fraksjonering, testing og typing og kryokonservering av GCW. En obligatorisk betingelse for effektiv drift av GSK-banker er organisering av en databas for sammenhenger med registrene til World Mediation Donor Association (WMDA) og USAs National Donor Medullary Programme (NMDP).

I tillegg er det nødvendig å optimalisere og standardisere metodene for HSC-ekspansjon in vitro, hovedsakelig hematopoietiske ledningsblodceller. Reproduksjon av HSC-blodblod er nødvendig for å øke antall potensielle mottakere som er kompatible med HLA-systemet. På grunn av små mengder ledningsblod er mengden HSC inneholdt i det som regel ikke i stand til å gi benmargrepopulering hos voksne pasienter. Samtidig, for å utføre ikke-relaterte transplantasjoner, er det nødvendig å ha tilgang til tilstrekkelig antall typiske GSK-prøver (fra 10.000 til 1.500.000 per 1 mottaker).

Transplantasjon av stammehemopoietiske celler eliminerer ikke komplikasjoner som følger med benmargstransplantasjon. Analysen viser at ved transplantasjon av stamceller fra navlestrengsblod utvikles alvorlige former for den akutte "graft-versus-host" -reaksjonen hos 23%, kronisk hos 25% av mottakere. I onkohematologiske pasienter observeres tilbakefall av akutt leukemi innen det første året etter transplantasjon av HSC-ledningsblod i 26% av tilfellene.

I de senere år har metodene for transplantasjon av perifere hematopoietiske stamceller utviklet seg intensivt. Innholdet av HSC i det perifere blodet er så lite (det er 1 GSK per 100 000 blodceller), at deres isolasjon uten spesielle preparater ikke gir mening. Derfor er giveren tidligere gitt et kurs av medikamentstimulering av frigjøring av hematopoietiske benmargceller i blodet. Til dette formål blir slike langt ufarlige legemidler som cyklofosfamid og granulocytkolonistimulerende faktor anvendt. Men selv etter prosedyren for mobilisering av HSC i perifert blod, overstiger innholdet av CD34 + celler i det ikke 1,6%.

For å mobilisere HSC i klinikken, er C-CEC mer vanlig, som er preget av relativt god toleranse, med unntak av det nesten regelmessige utseendet av smerter i beinene. Det skal bemerkes at bruken av moderne blodseparatorer gjør det mulig for oss å effektivt isolere stamforløperne for hematopoiesis. Under forhold med normal hematopoiesis må imidlertid minst 6 prosedyrer utføres for å oppnå et tilstrekkelig antall hematopoietiske stamceller, som er sammenlignbare med den repopulative kapasiteten til benmargeslamningen. Ved hver slik prosedyre prosesserer separatoren 10-12 liter blod, noe som kan forårsake trombocytopeni og leukopeni. Separasjonsprosedyren omfatter administrasjon av et antikoagulant (natriumsitrat) til giveren, som imidlertid ikke utelukker kontaktaktivering av blodplater under ekstrakorporeal sentrifugering. Disse faktorene skaper forhold for utvikling av infeksiøse og hemorragiske komplikasjoner. En annen ulempe ved fremgangsmåten ligger i den betydelige variabiliteten i mobiliseringsresponsen, som krever overvåkning av innholdet av HSC i perifere blodgivere som er nødvendig for å bestemme deres maksimalnivå.

Autolog transplantasjon av HSC, i motsetning til allogen, utelukker helt utviklingen av avvisningsreaksjonen. Imidlertid er en betydelig ulempe ved autolog transplantasjon av hematopoietiske stamceller, noe som begrenser rekke indikasjoner for opptreden, er det stor sannsynlighet for reinfusjon celle leukemiske klon med en transplantasjon. I tillegg øker mangelen på en immunfremmende "graft-versus-tumor"-effekt betydelig frekvensen av tilbakefall av ondartet blodsykdom. Derfor er den eneste måten radikal fjerning av klonal blodkreft neoplastisk og gjenopprette normal polyklonale hematopoiesis i myelodysplastisk syndrom er intensiv kjemoterapi med allogen HSC transplantasjon.

Men selv i dette tilfellet er behandling for de fleste hemoblastoser rettet mot å øke pasientens overlevelsestid og forbedre livskvaliteten. Ifølge flere store studier oppnås langvarig sykdomsfri overlevelse etter HSC allotransplantasjon hos 40% av onkemologiske pasienter. Ved bruk av stamceller av HbA-kompatibel søsken observeres de beste resultatene hos unge pasienter med en kort sykdomshistorie, antall blastceller opptil 10% og gunstige cytogenetika. Dessverre forblir dødeligheten forbundet med prosedyren for HSC allotransplantasjon hos pasienter med myelodysplastiske sykdommer høye (i de fleste rapporter - ca. 40%). Resultatene av det tiårige arbeidet i det nasjonale legemargasseprogrammet (510 pasienter, medianalder - 38 år) indikerer at sykdomsfri overlevelse i to år er 29%, med en relativt lav sannsynlighet for tilbakefall (14%). Dødeligheten som følge av prosedyren for GSC-allotransplantasjon fra en ikke-relatert giver er imidlertid ekstremt høy og når 54% over en toårsperiode. Liknende resultater ble oppnådd i den europeiske studien (118 pasienter, median alder 24 år, 2 års tilbakeslagsfri overlevelse 28%, tilbakefall 35%, dødelighet 58%).

Ved utførelse av intensive kjemoterapibehandlinger med etterfølgende gjenoppretting av hematopoiesis av allogene hemopoietiske celler, oppstår ofte ofte immunohematologiske og transfusjonskomplikasjoner. På mange måter er de relatert til det faktum at blodgrupper i mennesker er arvet uavhengig av MHC-molekyler. Derfor, selv om giveren og mottakeren er kompatible med de viktigste HLA-antigenene, kan deres erytrocytter ha en annen fenotype. Belegg "stor" uforlikelighet når preexist i mottakerantistoffet til antigener av donor røde blodceller, og "liten" når giver antistoffer mot antigener fra røde blodceller hos mottakeren. Det er tilfeller av en kombinasjon av "store" og "små" inkompatibiliteter.

Resultatene av den sammenlignende analyse av den kliniske effekten av benmarg og hematopoetiske stamceller fra navlestrengblod allotransplantater i hematologiske maligniteter indikerer at barn allotransplantasjon GSK ledningen blod betydelig redusert risiko for reaksjon "graft versus host", men det er en lengre periode med utvinning av neutrofil og blodplate en høyere frekvens av 100-dages dødelighet etter transplantasjonen.

Studien av årsakene til tidlig dødelighet gjorde det mulig å klargjøre kontraindikasjonene til den allogene transplantasjonen av GSK, blant hvilke de viktigste er:

• Tilstedeværelse i mottaker eller donor av positive tester for cytomegalovirusinfeksjon (uten å utføre forebyggende behandling);
• akutt strålingssykdom;
• tilstedeværelse eller til og med mistanke om tilstedeværelsen av en mykotisk infeksjon hos pasienten (uten systemisk tidlig profylakse med soppdrepende midler);
• hemoblastoser, hvor pasienter fikk langvarig behandling med cytostatika (på grunn av høy sannsynlighet for plutselig hjertestans og multippel organsvikt);
• transplantasjon fra HLA-ikke-identiske donorer (uten forebygging av den akutte "transplantasjon mot verten" -reaksjon av cyklosporin A);
• kronisk viral hepatitt C (på grunn av høy risiko for å utvikle veno-okklusiv sykdom i leveren).

Dermed kan HSCs transplantasjon føre til alvorlige komplikasjoner som ofte fører til døden. I den tidlige (opp til 100 dager etter transplantasjonen) periode disse inkluderer infeksiøse komplikasjoner, akutt reaksjon "graft versus host", avstøtning av transplanterte organer (neprizhivlenie HSC donor), venookklyuzionnaya leversykdom, så vel som på grunn av regimet toksisitet, vevsskade, for at det høyt karakteristiske frekvensen av remodeling (hud, vaskulært endotel, tarm epitel). Komplikasjoner ved slutten av perioden etter transplantasjonen inkluderer kroniske reaksjon av "transplantat versus vert" gjentakelse av den underliggende sykdom, vekstretardasjon hos barn, svekket reproduktiv funksjon og tyreoidale øyesykdommer.

Nylig, i forbindelse med utseendet på publikasjoner om benmargscelleres plastlighet, har det oppstått ideen om å bruke GSK for behandling av hjerteinfarkt og andre sykdommer. Selv om noen eksperimenter på dyr også støtter denne muligheten, må konklusjonene om plasticiteten til beinmargceller bekreftes. Denne tilstanden bør tas i betraktning av de forskerne som tror at de transplanterte cellene i det humane beinmarg lett forvandles til celler i skjelettmuskulatur, myokard eller CNS. Hypotesen om at GSK er en naturlig cellulær kilde til regenerering av disse organene krever alvorlige bevis.

Spesielt publiserte de første resultatene av en åpen randomisert studie Belenkova V. (2003), som har som formål - å studere effekten av C-SIS (dvs. Mobilisering av autologe blod HSCs) på kliniske, hemodynamisk og neurohumoral status av pasienter med moderat til alvorlig kronisk hjertesvikt, så vel som dens sikkerhetsvurdering med standardbehandling (ACE-hemmere, beta-blokkere, diuretika, hjerteglykosider). Den første utgivelsen av resultatene av forskningen programmets forfattere oppmerksom på at den eneste argument i favør av O-CBP er resultatene av behandlingen av en pasient som under behandling med dette stoffet funnet udiskutabel forbedring i alle kliniske og hemodynamiske parametre. Imidlertid har teorien om HSCs mobilisering inn i blodet, etterfulgt av regenerering av myokard i post-infarkt sone ikke blitt bekreftet - selv hos pasienter med en positiv klinisk dynamikk av stress ekkokardiografi med dobutamin ikke avsløre fremveksten av levedyktig myocardium i arret områder av feltet.

Det bør bemerkes at det foreliggende datapunkt for å anbefale en erstatning celleterapi for den omfattende innføring i hverdagen klinisk praksis, er det ikke nok. Et godt utformet og kvalitative resultater fra kliniske studier for å bestemme effektiviteten av de forskjellige muligheter for regenerativ celleterapi, utvikling av indikasjoner og kontraindikasjoner mot den, så vel som retningslinjer for den kombinerte bruk av regenerativ og plast terapi og konvensjonell kirurgisk eller konservativ behandling. Så langt kan ikke svar på spørsmålet om hva slags en befolkning på benmargceller (blodkreft stamceller eller stromal) gi opphav til nerveceller og cardiomyocytes, og er ikke klart hvilke betingelser bidrar til dette in vivo.

Arbeid i disse områdene utføres i mange land. I sammendraget av symposium på akutt leversvikt US National Institutes of Health blant lovende fremgangsmåter for behandling, sammen med levertransplantasjon, transplantat-merket xenon eller allogene hepatocytter og in vitro bioreaktorer forbindelse med levercellene. Det er direkte bevis på at bare utenlandske, funksjonelt aktive hepatocytter kan gi effektiv støtte til leveren til mottakeren. For klinisk bruk av isolerte hepatocytter er det nødvendig å opprette en cellebank, som vil redusere tiden mellom frigjøring av celler og deres bruk. Den mest akseptable for å opprette en bank med isolerte hepatocytter er cryopreserveringen av leverceller i flytende nitrogen. Ved bruk av slike celler i klinikken hos pasienter med akutt og kronisk leverinsuffisiens ble det vist en ganske høy terapeutisk effekt.

Til tross for de optimistiske og oppmuntrende resultatene av anvendelsen av levercelletransplantasjon i forsøket og klinikken, er det mange problemer fremdeles langt fra løsningen. Disse inkluderer den begrensede mengden av egnede organer for å oppnå isolerte hepatocytter utilstrekkelig effektive metoder for separasjon, mangel på standardiserte metoder for konservering av leverceller uklar forståelse av mekanismene for regulering av veksten og proliferasjonen av de transplanterte celler, mangel på tilstrekkelig metoder innpoding evaluering eller avvisning av allogene hepatocytter. Dette bør også omfatte tilstedeværelse av transplantasjonsimmunitet ved hjelp av allogene eller xenogene celler, men mindre enn i orthotopic levertransplantasjon, men krever påføring av immunsuppressive midler, innkapsle isolerte hepatocytter eller spesielle prosesseringsenzymer. Transplantasjon av hepatocytter fører ofte til en immunkonflikt mellom mottakeren og giveren som en avvisningsreaksjon, som krever bruk av cytostatika. En løsning på dette problemet er å bruke mikroporøse polymermateriale for å isolere levercellene, noe som vil øke deres overlevelse, ettersom kapselmembranen beskytter effektivt hepatocyttene, til tross for vertsimmuniseringen.

Men i akutt leversvikt slik hepatocytt transplantasjon ikke har noen virkning på grunn av den relativt lange tid som er nødvendig for innpoding av leverceller i det nye miljøet med adgang til en trinn optimal funksjon. En potensiell begrensning er utskillelsen av galle ektopisk transplantasjon av isolerte hepatocytter, og ved anvendelse av bioreaktorer vesentlig fysiologisk barrieren fungerer art uoverensstemmelse mellom humane proteiner og proteiner som produserer xenogeniske hepatocytter.

I litteraturen er det rapportert at den lokale transplantasjon av stromale benmargsstamceller letter effektiv korrigering av bendefekter, og ben restaurering i dette tilfelle er mer intensiv enn i spontan reparativ regenerering. I flere prekliniske studier i dyremodeller har overbevisende demonstrert muligheten for å bruke transplantasjoner av stromale benmargsceller i ortopedi, selv om for å optimalisere disse fremgangsmåter, selv i de enkleste tilfeller er ytterligere arbeid som er nødvendig. Spesielt er de optimale forholdene for ekspansjon av osteogene stromaceller ex vivo ennå ikke funnet, strukturen og sammensetningen av deres ideelle bærer (matriks) forblir ubearbeidet. Minimumsantal celler som kreves for gjenvinning av bulkben er ikke bestemt.

Det viste seg at stamceller oppviser transgermalnuyu plastisitet - evnen til å differensiere i celletyper som fenotypisk er relatert til den opprinnelige cellelinjen. Under optimale forhold polyklonale stamcellelinje kultur av stromale benmargs-celler opprettholdt in vitro i mer enn 50 divisjoner, som gjør det mulig å motta milliarder av stromale celler fra 1 ml av benmargs. Imidlertid populasjonen av stamceller som er kjennetegnet ved heterogenitet, som manifesterer seg som variasjoner i kolonistørrelsene, forskjellige hastigheter på formasjonen og morfologisk mangfold av celletyper - fra fibroblast-lignende spindel-formet til store flate celler. I løpet av 3 uker med dyrking stromale stamceller observert fenotypisk heterogenitet: en kolonidannende korn med benvev, mens andre - klynger av adipocytter, og andre, mer sjeldne, danner øyene i brusk.

For behandling av degenerative sykdommer i sentralnervesystemet ble transplantasjon av embryonalt nervevev først brukt. I de senere år i stedet for den føtalt hjerne vevstransplantat stål cellulære elementer neurosfærer avledet fra nervestamceller (.Poltavtseva, 2001). Neurospheres inneholder engasjerte nerveprekursorer og nevrologi - dette gir håp om gjenoppretting av tapte hjernefunksjoner etter transplantasjonen. Etter transplantasjon av celler til neurosfærer dispergert rotte striatal hjerne apparatet merket deres proliferasjon og differensiering i dopaminerge nevroner, noe som eliminerer motor asymmetri i rotter med eksperimentell gemiparkinsonizmom. Imidlertid utviklet svulstceller i noen tilfeller fra neurosfærenes celler, noe som førte til dyrs død (Bjorklund, 2002).

Klinikken omhyggelig studium av to grupper av pasienter som verken pasienter eller legene visste ser på dem (dobbel-blind), at en gruppe av pasienter transplantert embryonale vev med nerveceller som produserer dopamin, en andre gruppe av pasienter som har en falsk trinn, ble det uventede resultat . Pasienter som ble transplantert embryonale nevrale vev, følte ikke noe bedre enn pasientene i kontrollgruppen. Videre 5 av 33 pasienter etter 2 år etter transplantasjon av embryonale nevrale vev utviklet vedvarende dyskinesi, som hadde ingen kontrollpasienter gruppe (Stamceller: vitenskapelige utvikling og fremtidige forsknings retninger Nat Inst, Helse USA ...). En av de uløste problemene med kliniske studier med hjernenervestamceller er analysen av reelle muligheter og begrensninger i deres derivater transplantasjon for korrigering av CNS-lidelser. Det er mulig at langvarig anfallsaktivitet indusert neyronogenez i hippocampus, som fører til de strukturelle og funksjonelle endringer kan være en faktor i den gradvise utvikling av epilepsi. Denne konklusjonen er særlig bemerkelsesverdig, da den peker til de mulige negative effekter av genereringen av nye nerveceller i voksen hjerne, og dannelsen av avvikende synaptiske forbindelser.

Vi må ikke glemme at det i dyrkningsmedier med cytokiner (mitogener) være tilnærmet lik egenskapene til stamceller som i tumorceller, slik de forekommer i nærheten av forandringer i reguleringen av cellesykluser, å bestemme evnen til å dele seg i det uendelige. Det er tåpelig å transplantere mennesker med tidlige derivater av embryonale stamceller, siden i dette tilfellet er trusselen om utvikling av ondartede neoplasmer veldig stor. Det er mye tryggere å bruke sine mer engasjerte avkom, det vil si forløperceller av differensierte linjer. Imidlertid er det foreløpig ikke utarbeidet en pålitelig teknikk for å oppnå stabile humane cellelinjer som er forskjellig i riktig retning.

Bruken av molekylærbiologi teknologier for korreksjon av arvelig patologi og menneskelige sykdommer ved hjelp av stamcelle modifikasjon er av stor interesse for praktisk medisin. Egenskaper av genomet av stamceller muliggjør utvikling av unike transplantasjonsordninger med sikte på å korrigere genetiske sykdommer. Men i denne retningen er det også en rekke begrensninger som må overvinnes før den praktiske anvendelsen av genetisk prosjektering av stamceller begynner. Først og fremst er det nødvendig å optimere prosessen med stamcellemetommodifisering ex vivo. Det er kjent at en langvarig (3-4 uker) proliferasjon av stamceller reduserer transfeksjonen, slik at flere sykluser av transfeksjon er nødvendige for å oppnå et høyt nivå av deres genetiske modifikasjon. Hovedproblemet er imidlertid relatert til varigheten av uttrykket av det terapeutiske genet. Inntil nå, i ingen av studiene, var perioden for effektivt uttrykk etter transplantasjon av de modifiserte celler ikke over fire måneder. I 100% tilfeller over tid reduseres ekspresjonen av transfekterte gener på grunn av inaktivering av promotorer og / eller død av celler med et modifisert genom.

Et viktig problem er kostnaden ved bruk av mobilteknologi i medisin. For eksempel er det anslåtte årlige finansieringsbehovet for bare medisinske utgifter til en benmargstransplantasjonsavdeling, designet for å utføre 50 transplantasjoner per år, om lag 900.000 dollar.

Utviklingen av mobilteknologi i klinisk medisin er en kompleks og flertrinns prosess som involverer konstruktivt samarbeid mellom tverrfaglige vitenskapelige og kliniske sentre og det internasjonale samfunn. Samtidig blir spesiell oppmerksomhet til den vitenskapelige organisasjonen av forskning innen celleterapi. De viktigste av disse er utvikling av protokoller for kliniske studier, overvåking av kliniske data, dannelse av et nasjonalt forskningsregister, integrering i internasjonale programmer for multicenter kliniske studier og innføring av resultater i klinisk praksis.

Avsluttende innføring i celletransplantasjon problemer, vil jeg gjerne uttrykke håp om at felles innsats fra ledende eksperter i Ukraina fra ulike fagområder vil sikre betydelig fremgang i eksperimentelle og kliniske studier, og vil tillate i de kommende årene for å finne effektive måter å hjelpe alvorlig syke mennesker som trenger organtransplantasjoner , vev og celler.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]