Begrensninger, farer og komplikasjoner ved celletransplantasjon

Regenerativ plastisk medisin er basert på klinisk implementering av de toti- og pluripotente egenskapene til embryonale og progenitorstamceller, som tillater in vitro og in vivo etablering av spesifiserte cellelinjer som repopulerer skadet vev og organer hos en syk person.

Den reelle muligheten for å bruke embryonale stamceller og stamceller fra definitive vev (de såkalte «voksne» stamcellene) fra mennesker til terapeutiske formål er ikke lenger i tvil. Eksperter fra National and Medical Academies of the USA (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) og National Institute of Health of the USA (Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA) anbefaler imidlertid en mer detaljert studie av stamcellers egenskaper i eksperimenter på adekvate biologiske modeller og en objektiv vurdering av alle konsekvensene av transplantasjon, og først deretter bruk av stamceller i klinikken.

Det er fastslått at stamceller er en del av vevsderivatene til alle tre kimlagene. Stamceller finnes i netthinnen, hornhinnen, hudens epidermis, benmargen og perifert blod, i blodårer, tannpulpa, nyrer, mage-tarm-epitel, bukspyttkjertelen og leveren. Ved hjelp av moderne metoder er det bevist at nevrale stamceller er lokalisert i hjernen og ryggmargen til en voksen. Disse sensasjonelle dataene vakte spesiell oppmerksomhet fra forskere og media, siden nevroner i hjernen fungerte som et klassisk eksempel på en statisk cellepopulasjon som ikke gjenopprettes. Både i de tidlige og sene periodene av ontogenesen dannes nevroner, astrocytter og oligodendrocytter i hjernen til dyr og mennesker på grunn av nevrale stamceller (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Under normale forhold manifesterer imidlertid ikke stamceller fra definitive vev seg plastisk. For å realisere det plastiske potensialet til stamceller fra definitive vev, må de isoleres og deretter dyrkes i medier med cytokiner (LIF, EGF, FGF). Dessuten endobler stamcellederivater kun med hell når de transplanteres inn i kroppen til et dyr med et svekket immunforsvar (γ-bestråling, cytostatika, busulfan, etc.). Til dags dato er det ikke oppnådd overbevisende bevis for implementering av stamcelleplastisitet hos dyr som ikke har blitt utsatt for stråling eller andre effekter som forårsaker dyp immunsuppresjon.

Under slike forhold manifesterer det farlige potensialet til ESC-er seg først og fremst under transplantasjon til ektopiske områder - under subkutan injeksjon av ESC-er i immunsviktige mus dannes teratokarsinomer på injeksjonsstedet. I tillegg er hyppigheten av kromosomavvik høyere under utviklingen av det menneskelige embryoet enn ved embryogenese hos dyr. I blastocyststadiet består bare 20–25 % av menneskelige embryoer av celler med normal karyotype, og det overveldende flertallet av tidlige menneskelige embryoer oppnådd etter in vitro-fertilisering viser kaotisk kromosomal mosaikk og støter ofte på numeriske og strukturelle avvik.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Gunstige effekter av stamceller

Foreløpige resultater fra kliniske studier bekrefter den gunstige effekten av stamceller på pasienten, men det finnes fortsatt ingen informasjon om de langsiktige effektene av celletransplantasjon. Litteraturen var i utgangspunktet dominert av rapporter om positive resultater av transplantasjon av embryonale hjernefragmenter ved Parkinsons sykdom, men deretter begynte data å dukke opp som benektet den effektive terapeutiske effekten av embryonalt eller føtalt nervevev transplantert inn i hjernen til pasienter.

På midten av 1900-tallet ble restaurering av hematopoiesen hos dødelig bestrålte dyr etter intravenøs transfusjon av benmargsceller først oppdaget, og i 1969 utførte den amerikanske forskeren D. Thomas den første benmargstransplantasjonen hos mennesker. Mangelen på kunnskap om mekanismene for immunologisk inkompatibilitet mellom donor- og mottakerbenmargsceller på den tiden førte til høy dødelighet på grunn av hyppig transplantasjonssvikt og utvikling av graft-versus-host-reaksjon. Oppdagelsen av det viktigste histokompatibilitetskomplekset, som inkluderer humane leukocyttantigener (HbA), og forbedringen av deres typemetoder gjorde det mulig å øke overlevelsen betydelig etter benmargstransplantasjon, noe som førte til utbredt bruk av denne behandlingsmetoden i onkohematologi. Et tiår senere ble de første transplantasjonene av hematopoietiske stamceller (HSC) oppnådd fra perifert blod ved hjelp av leukaferese utført. I 1988 ble navlestrengsblod først brukt som kilde til HSC-er i Frankrike for å behandle et barn med Fanconis anemi, og siden slutten av 2000 har det dukket opp rapporter i pressen om HSC-ers evne til å differensiere til celler av forskjellige vevstyper, noe som potensielt utvider omfanget av deres kliniske anvendelse. Det viste seg imidlertid at transplantasjonsmaterialet, sammen med HSC-er, inneholder et betydelig antall ikke-hematopoietiske celleforurensninger av ulik natur og egenskaper. I denne forbindelse utvikles metoder for rensing av transplantatet og kriterier for å vurdere dets cellulære renhet. Spesielt brukes positiv immunseleksjon av CD34+ celler, noe som muliggjør isolering av HSC-er ved bruk av monoklonale antistoffer.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Komplikasjoner av stamcellebehandling

Komplikasjoner ved benmargstransplantasjon er oftest hematologiske og forbundet med en lang periode med iatrogen pancytopeni. Infeksiøse komplikasjoner, anemi og blødninger utvikler seg oftest. I denne forbindelse er det ekstremt viktig å velge den optimale metoden for innsamling, prosessering og lagring av benmarg for maksimal bevaring av stamceller, noe som vil sikre rask og stabil gjenoppretting av hematopoiesen. Ved karakterisering av en transplantasjon vurderes følgende parametere for tiden vanligvis: antall mononukleære og/eller kjerneholdige celler, kolonidannende enheter og innholdet av CD34-positive celler. Dessverre gir disse indikatorene bare en indirekte vurdering av den reelle hematopoietiske kapasiteten til stamcellepopulasjonen i transplantatet. I dag finnes det ingen absolutt nøyaktige parametere for å bestemme hvorvidt et transplantat er tilstrekkelig for langsiktig gjenoppretting av hematopoiesen hos pasienter, selv med autolog benmargstransplantasjon. Utviklingen av generelle kriterier er ekstremt vanskelig på grunn av mangelen på strenge standarder for prosessering, kryokonservering og testing av transplantatet. I tillegg er det nødvendig å ta hensyn til hele spekteret av faktorer som påvirker parameterne for vellykket gjenoppretting av hematopoiesen hos hver enkelt pasient. Ved autolog benmargstransplantasjon er de viktigste antall tidligere cellegiftkurer, egenskapene til kondisjoneringsregimet, sykdomsperioden der benmargen ble samlet inn, og ordningene for bruk av kolonistimulerende faktorer i perioden etter transplantasjon. I tillegg bør man ikke glemme at cellegift før transplantasjonsinnsamlingen kan ha en negativ effekt på benmargsstamceller.

Forekomsten av alvorlige toksiske komplikasjoner øker betydelig under allogen benmargstransplantasjon. I denne forbindelse er statistiske data om allogen benmargstransplantasjon ved talassemi av interesse. Rapportene fra European Bone Marrow Transplantation Group har registrert rundt 800 benmargstransplantasjoner til pasienter med thalassemi major. Allogen transplantasjon ved talassemi utføres i de aller fleste tilfeller fra HLA-identiske søsken, noe som er assosiert med alvorlige komplikasjoner og høy dødelighet under transplantasjon av stamcellemateriale fra delvis kompatible beslektede eller kompatible ubeslektede donorer. For å minimere risikoen for fatale infeksjonskomplikasjoner plasseres pasientene i isolerte aseptiske bokser med laminær luftstrøm og får et lav- eller abakterielt kosthold. For bakteriell dekontaminering av tarmen foreskrives ikke-resorberbare former for antibiotika og soppdrepende medisiner per os. For profylakse administreres amfotericin B intravenøst. Forebygging av systemiske infeksjoner forsterkes med amikacin og ceftazidim, som foreskrives dagen før transplantasjon, og behandlingen fortsetter til pasienten er utskrevet. Alle blodprodukter bestråles med en dose på 30 Gy før transfusjon. Parenteral ernæring under transplantasjon er en nødvendig betingelse og starter umiddelbart etter restriksjon av matinntaket på en naturlig måte.

En rekke komplikasjoner er forbundet med den høye toksisiteten til immunsuppressive legemidler, som ofte forårsaker kvalme, oppkast og mukositt, nyreskade og interstitiell lungebetennelse. En av de alvorligste komplikasjonene ved cellegiftbehandling er venokklusiv leversykdom, som fører til død tidlig etter transplantasjon. Risikofaktorer for trombose i venene i leverportalsystemet inkluderer pasientenes alder, tilstedeværelse av hepatitt og leverfibrose, samt immunsuppressiv behandling etter benmargstransplantasjon. Venokklusiv sykdom er spesielt farlig ved talassemi, som er ledsaget av hemosiderose i leveren, hepatitt og fibrose - hyppige følgesvenner av transfusjonsbehandling. Trombose i venene i leverportalsystemet utvikler seg 1-2 uker etter transplantasjon og er preget av en rask økning i innholdet av bilirubin og transaminaseaktivitet i blodet, progresjon av hepatomegali, ascites, encefalopati og smerter i øvre del av magen. Histologisk avslører obduksjonsmateriale endotelskade, subendotelblødninger, skade på sentrilobulære hepatocytter, trombotisk obstruksjon av venoler og sentrale vener i leveren. Tilfeller av dødelig hjertestans assosiert med toksiske effekter av cytostatika er beskrevet hos pasienter med talassemi.

I perioden før transplantasjon forårsaker cyklofosfamid og busulfan ofte toksisk-hemorragisk blærekatarr med patologiske forandringer i uroepitelceller. Bruk av cyklosporin A ved benmargstransplantasjon er ofte ledsaget av nefro- og nevrotoksisitet, hypertensjonssyndrom, væskeretensjon i kroppen og hepatocytcytolyse. Seksuell og reproduktiv dysfunksjon observeres oftere hos kvinner. Hos små barn påvirkes vanligvis ikke pubertetsutviklingen etter transplantasjon, men hos eldre barn kan patologien i utviklingen av den seksuelle sfæren være svært alvorlig - opptil sterilitet. Komplikasjoner som er direkte relatert til selve transplantasjonen inkluderer avstøtning av allogene benmargsceller, ABO-inkompatibilitet, akutte og kroniske former for graft-versus-host-sykdom.

Hos pasienter med ABO-inkompatibel benmargstransplantasjon produseres vert-versus-ABO-donor-isoagglutininer i 330–605 dager etter transplantasjon, noe som kan føre til langvarig hemolyse og dramatisk øke behovet for blodtransfusjoner. Denne komplikasjonen forebygges ved kun å transfusere type 0-røde blodlegemer. Etter transplantasjon opplever noen pasienter autoimmun nøytropeni, trombocytopeni eller pancytopeni, som krever splenektomi for å korrigere.

Hos 35–40 % av mottakerne utvikles akutt graft-versus-host-sykdom innen 100 dager etter allogen HLA-identisk benmargstransplantasjon. Graden av hud-, lever- og tarmpåvirkning varierer fra utslett, diaré og moderat hyperbilirubinemi til hudavskalling, tarmobstruksjon og akutt leversvikt. Hos pasienter med talassemi er forekomsten av grad I akutt graft-versus-host-sykdom etter benmargstransplantasjon 75 %, og grad II og høyere er 11–53 %. Kronisk graft-versus-host-sykdom som et systemisk multiorgansyndrom utvikles vanligvis innen 100–500 dager etter allogen benmargstransplantasjon hos 30–50 % av pasientene. Hud, munnhule, lever, øyne, spiserør og øvre luftveier er påvirket. Det skilles mellom en begrenset form for kronisk graft-versus-host-sykdom, når hud og/eller lever er påvirket, og en utbredt form, når generaliserte hudlesjoner kombineres med kronisk aggressiv hepatitt, lesjoner i øyne, spyttkjertler eller andre organer. Død er ofte forårsaket av infeksiøse komplikasjoner som følge av alvorlig immunsvikt. Ved talassemi forekommer en mild form for kronisk graft-versus-host-sykdom hos 12 %, en moderat form hos 3 % og en alvorlig form hos 0,9 % av mottakerne av allogen HLA-kompatibel benmarg. En alvorlig komplikasjon ved benmargstransplantasjon er graftavstøtning, som utvikler seg 50–130 dager etter operasjonen. Hyppigheten av avstøtning avhenger av kondisjoneringsregimet. Spesielt hos pasienter med talassemi som kun fikk metotreksat i forberedelsesperioden, ble avstøtning av benmargstransplantasjonen observert i 26 % av tilfellene, med en kombinasjon av metotreksat og ciklosporin A – i 9 % av tilfellene, og med administrering av kun ciklosporin A – i 8 % av tilfellene (Gaziev et al., 1995).

Infeksiøse komplikasjoner etter benmargstransplantasjon er forårsaket av virus, bakterier og sopp. Utviklingen av disse komplikasjonene er assosiert med dyp nøytropeni indusert av cellegift i kondisjoneringsperioden, skade på slimhinner forårsaket av cytostatika og graft-versus-host-reaksjon. Avhengig av utviklingstidspunktet skilles det mellom tre faser av infeksiøse komplikasjoner. I den første fasen (utvikles i den første måneden etter transplantasjon) dominerer skade på slimhinner og nøytropeni, ofte ledsaget av virusinfeksjoner (herpes, Epstein-Barr-virus, cytomegalovirus, Varicella zoster), samt infeksjoner forårsaket av grampositive og gramnegative bakterier, Candida-sopp, aspergilli. I den tidlige perioden etter transplantasjon (den andre og tredje måneden etter transplantasjon) er den alvorligste infeksjonen cytomegalovirus, som ofte fører til død hos pasienter i den andre fasen av infeksiøse komplikasjoner. Ved talassemi utvikler cytomegalovirusinfeksjon etter benmargstransplantasjon seg hos 1,7–4,4 % av mottakerne. Den tredje fasen observeres sent etter transplantasjon (tre måneder etter operasjonen) og er preget av alvorlig kombinert immunsvikt. Infeksjoner forårsaket av Varicella zoster, streptokokker, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae og hepatotrope virus er vanlige i denne perioden. Ved talassemi er dødeligheten hos pasienter etter benmargstransplantasjon assosiert med bakteriell og soppsepsis, idiopatisk interstitiell og cytomegalovirus-pneumoni, akutt respiratorisk distresssyndrom, akutt hjertesvikt, hjertetamponade, hjerneblødning, venookklusiv leversykdom og akutt graft-versus-host-sykdom.

For tiden er det oppnådd visse suksesser i utviklingen av metoder for å isolere rene populasjoner av hematopoietiske stamceller fra benmarg. Teknikken for å utvinne fosterblod fra navlestrengen er forbedret, og det er utviklet metoder for å isolere hematopoietiske celler fra navlestrengsblod. Det finnes rapporter i vitenskapelig presse om at hematopoietiske stamceller er i stand til å formere seg når de dyrkes i medier med cytokiner. Ved bruk av spesialdesignede bioreaktorer for ekspansjon av hematopoietiske stamceller øker biomassen av hematopoietiske stamceller isolert fra benmarg, perifert eller navlestrengsblod betydelig. Muligheten for å ekspandere hematopoietiske stamceller er et viktig skritt mot den kliniske utviklingen av celletransplantasjon.

Før in vitro-formering av hematopoietiske stamceller er det imidlertid nødvendig å isolere en homogen populasjon av hematopoietiske stamceller. Dette oppnås vanligvis ved bruk av markører som tillater selektiv merking av hematopoietiske stamceller med monoklonale antistoffer kovalent bundet til en fluorescerende eller magnetisk markør, og isolering av disse ved hjelp av en passende cellesorterer. Samtidig er ikke spørsmålet om fenotypiske egenskaper ved hematopoietiske stamceller endelig løst. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) anser celler med CD34-, AC133- og Thyl-antigener på overflaten og ingen CD38-, HLA-DR- eller andre differensieringsmarkører (celler med CD34+Liir-fenotypen) som kandidater for hematopoietiske stamceller. Avstamningsmarkører (Lin) inkluderer glykoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Celler med CD34+CD45RalüW CD71low-fenotypen, samt CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low-fenotypen, anses som lovende for transplantasjon.

Spørsmålet om hvor mange hematopoietiske stamceller som er tilstrekkelige for effektiv transplantasjon er fortsatt problematisk. For tiden er kildene til hematopoietiske stamceller benmarg, perifert blod og navlestrengsblod, og embryonal lever. Ekspansjon av hematopoietiske stamceller oppnås ved å dyrke dem i nærvær av endotelceller og hematopoietiske vekstfaktorer. I ulike protokoller brukes myeloproteiner, SCF, erytropoietin, insulinlignende vekstfaktorer, kortikosteroider og østrogener for å indusere HSC-proliferasjon. Ved bruk av kombinasjoner av cytokiner in vitro er det mulig å oppnå en betydelig økning i HSC-bassenget med en topp i produksjonen deres på slutten av den andre uken med dyrking.

Tradisjonelt brukes hematopoietiske stamceller fra navlestrengsblod hovedsakelig for hemoblastoser. Minimumsdosen av hematopoietiske celler som kreves for vellykket navlestrengsblodtransplantasjon er imidlertid 3,7 x 107 ^{kjerneholdige} celler per 1 kg mottakerens kroppsvekt. Bruk av et mindre antall hematopoietiske stamceller fra navlestrengsblod øker risikoen for transplantatsvikt og tilbakefall av sykdommen betydelig. Derfor brukes hematopoietiske stamceller fra navlestrengsblod hovedsakelig til å behandle hemoblastoser hos barn.

Dessverre finnes det fortsatt ingen standarder for anskaffelse eller standardiserte protokoller for klinisk bruk av hematopoietiske celler fra navlestrengsblod. Følgelig er ikke stamceller fra navlestrengsblod i seg selv en juridisk anerkjent kilde til hematopoietiske celler for transplantasjon. I tillegg finnes det ingen etiske eller juridiske normer som regulerer aktivitetene og organiseringen av navlestrengsblodbanker, som finnes i utlandet. For sikker transplantasjon må alle navlestrengsblodprøver overvåkes nøye. Før blod tas fra en gravid kvinne, må hennes samtykke innhentes. Hver gravid kvinne må undersøkes for HBsAg-bærerskap, tilstedeværelse av antistoffer mot hepatitt C, HIV og syfilisvirus. Hver navlestrengsblodprøve må testes som standard for antall kjerneholdige celler, CD34+ og kolonidannende kapasitet. I tillegg utføres HbA1c-typing, bestemmelse av blodgruppen ved ABO og dens tilhørighet ved Rh-faktor. De nødvendige testprosedyrene er bakteriologisk kultur for sterilitet, serologisk testing for HIV-1- og HIV-2-infeksjoner, HBsAg, viral hepatitt C, cytomegalovirusinfeksjon, HTLY-1 og HTLY-II, syfilis og toksoplasmose. I tillegg utføres polymerasekjedereaksjon for å påvise cytomegalovirus- og HIV-infeksjoner. Det synes tilrådelig å supplere testprotokollene med en analyse av navlestrengsblod GSC for å påvise slike genetiske sykdommer som α-thalassemia, sigdcelleanemi, adenosindeaminasemangel, Brutons agammaglobulinemi, Hurlers og Ponters sykdommer.

Det neste trinnet i forberedelsene til transplantasjon er spørsmålet om å bevare de hematopoietiske stamcellene. De farligste prosedyrene for cellenes levedyktighet under fremstillingen er frysing og tining. Ved frysing av hematopoietiske celler kan en betydelig del av dem bli ødelagt på grunn av krystalldannelse. Spesielle stoffer - kryoprotektorer - brukes for å redusere prosentandelen celledød. Oftest brukes DMSO som kryoprotektor i en sluttkonsentrasjon på 10 %. Imidlertid er DMSO i en slik konsentrasjon preget av en direkte cytotoksisk effekt, som manifesterer seg selv under forhold med minimal eksponering. En reduksjon i den cytotoksiske effekten oppnås ved streng opprettholdelse av nulltemperatur i eksponeringsmodusen, samt overholdelse av forskriftene for behandling av materialet under og etter tining (hastighet på alle manipulasjoner, bruk av flere vaskeprosedyrer). DMSO-konsentrasjoner på mindre enn 5 % bør ikke brukes, da dette forårsaker massiv død av hematopoietiske celler i løpet av fryseperioden.

Tilstedeværelsen av erytrocyttforurensninger i suspensjonsblandingen av hematopoietiske stamceller skaper en risiko for å utvikle en inkompatibilitetsreaksjon for erytrocyttantigener. Samtidig, når erytrocytter fjernes, øker tapet av hematopoietiske celler betydelig. I denne forbindelse er det foreslått en metode for ufraksjonert isolering av hematopoietiske stamceller. I dette tilfellet brukes en 10 % DMSO-løsning og konstant kjølehastighet (GS/min) til -80 °C for å beskytte kjerneholdige celler mot de skadelige effektene av lave temperaturer, hvoretter cellesuspensjonen fryses i flytende nitrogen. Det antas at denne kryokonserveringsmetoden resulterer i delvis lysis av erytrocytter, slik at blodprøver ikke krever fraksjonering. Før transplantasjon tines cellesuspensjonen, vaskes fra fritt hemoglobin og DMSO i en løsning av humant albumin eller i blodserum. Bevaringen av hematopoietiske forløpere ved bruk av denne metoden er riktignok høyere enn etter fraksjonering av navlestrengsblod, men risikoen for transfusjonskomplikasjoner på grunn av transfusjon av ABO-inkompatible erytrocytter er fortsatt til stede.

Etablering av et banksystem for lagring av HLA-testede og typede HSC-prøver kan løse problemene ovenfor. Dette krever imidlertid utvikling av etiske og juridiske normer, som for øyeblikket bare diskuteres. Før man oppretter et banknettverk, er det nødvendig å vedta en rekke forskrifter og dokumenter om standardisering av prosedyrer for innsamling, fraksjonering, testing og typing, samt kryokonservering av HSC. En obligatorisk forutsetning for effektiv drift av HSC-banker er organisering av en database for samhandling med registrene til World Marrow Donor Association (WMDA) og National Marrow Donor Program of the United States (NMDP).

I tillegg er det nødvendig å optimalisere og standardisere metodene for in vitro HSC-ekspansjon, først og fremst hematopoietiske celler fra navlestrengsblod. Ekspansjon av HSC fra navlestrengsblod er nødvendig for å øke antallet potensielle mottakere som er kompatible med HLA-systemet. På grunn av de små volumene av navlestrengsblod, er antallet HSC-er som finnes i det vanligvis ikke i stand til å sikre benmargsrepopulasjon hos voksne pasienter. Samtidig er det nødvendig å ha tilgang til et tilstrekkelig antall typede HSC-prøver (fra 10 000 til 1 500 000 per mottaker) for å utføre urelaterte transplantasjoner.

Transplantasjon av hematopoietiske stamceller eliminerer ikke komplikasjonene som følger med benmargstransplantasjon. Analyser viser at ved transplantasjon av navlestrengsblodstamceller utvikles alvorlige former for akutt graft-versus-host-sykdom hos 23 % av mottakerne, og kroniske former hos 25 % av mottakerne. Hos onkohematologiske pasienter observeres tilbakefall av akutt leukemi i løpet av det første året etter transplantasjon av navlestrengsblodstamceller i 26 % av tilfellene.

I de senere årene har metoder for transplantasjon av perifere hematopoietiske stamceller blitt intensivt utviklet. Innholdet av HSC i perifert blod er så lite (1 HSC per 100 000 blodceller) at det ikke gir mening å isolere dem uten spesiell forberedelse. Derfor får donoren først en kur med medikamentell stimulering av frigjøring av hematopoietiske celler fra benmargen til blodet. For dette formålet brukes så langt fra ufarlige legemidler som cyklofosfamid og granulocyttkolonistimulerende faktor. Men selv etter prosedyren for mobilisering av HSC til perifert blod, overstiger ikke innholdet av CD34+ celler i den 1,6 %.

For mobilisering av hematopoietiske stamceller i klinikken brukes oftest S-SEC, som kjennetegnes av relativt god toleranse, med unntak av den nesten naturlige forekomsten av beinsmerter. Det skal bemerkes at bruk av moderne blodseparatorer muliggjør effektiv isolering av hematopoietiske stamceller. Under normale hematopoieseforhold må imidlertid minst 6 prosedyrer utføres for å oppnå et tilstrekkelig antall hematopoietiske stamceller som er sammenlignbare i repopulasjonskapasitet med benmargssuspensjon. Hver slik prosedyre krever at 10-12 liter blod behandles på separatoren, noe som kan forårsake trombocytopeni og leukopeni. Separasjonsprosedyren innebærer introduksjon av et antikoagulant (natriumcitrat) til donoren, noe som imidlertid ikke utelukker kontaktaktivering av blodplater under ekstrakorporal sentrifugering. Disse faktorene skaper betingelser for utvikling av infeksiøse og hemorragiske komplikasjoner. En annen ulempe med metoden er den betydelige variasjonen i mobiliseringsresponsen, som krever overvåking av innholdet av HSC-er i det perifere blodet til donorer, noe som er nødvendig for å bestemme deres maksimale nivå.

Autogen transplantasjon av hematopoietiske stamceller, i motsetning til allogen transplantasjon, eliminerer fullstendig utviklingen av avstøtningsreaksjoner. En betydelig ulempe med autotransplantasjon av hematopoietiske stamceller, som begrenser indikasjonsområdet for implementeringen, er imidlertid den høye sannsynligheten for reinfusjon av leukemiske klonceller med transplantatet. I tillegg øker fraværet av den immunmedierte "graft versus tumor"-effekten hyppigheten av tilbakefall av ondartet blodsykdom betydelig. Derfor er den eneste radikale metoden for å eliminere neoplastisk klonal hematopoiese og gjenopprette normal polyklonal hematopoiese ved myelodysplastiske syndromer fortsatt intensiv polykjemoterapi med transplantasjon av allogen hematopoiese.

Men selv i dette tilfellet er behandlingen for de fleste hemoblastoser kun rettet mot å øke pasientenes overlevelsestid og forbedre livskvaliteten. I følge flere store studier oppnås langsiktig tilbakefallsfri overlevelse etter allotransplantasjon av HSC-er hos 40 % av onkohematologiske pasienter. Ved bruk av stamceller fra en HLA-kompatibel søsken observeres de beste resultatene hos unge pasienter med kort sykdomshistorie, et blastcelletall på opptil 10 % og gunstig cytogenetikk. Dessverre er dødeligheten forbundet med prosedyren for allotransplantasjon av HSC-er hos pasienter med myelodysplastiske sykdommer fortsatt høy (i de fleste rapporter - ca. 40 %). Resultatene av 10-årig arbeid fra National Bone Marrow Donor Program i USA (510 pasienter, medianalder - 38 år) indikerer at den tilbakefallsfrie overlevelsen i to år er 29 % med en relativt lav sannsynlighet for tilbakefall (14 %). Dødeligheten forbundet med prosedyren med allotransplantasjon av HSC-er fra en ubeslektet donor er imidlertid ekstremt høy og når 54 % over en toårsperiode. Lignende resultater ble oppnådd i en europeisk studie (118 pasienter, medianalder - 24 år, toårig tilbakefallsfri overlevelse - 28 %, tilbakefall - 35 %, dødelighet - 58 %).

Under intensive cellegiftkurer med påfølgende gjenoppretting av hematopoiesen med allogene hematopoietiske celler, oppstår det ofte immunhematologiske komplikasjoner og transfusjonskomplikasjoner. Disse skyldes i stor grad at menneskelige blodgrupper arves uavhengig av MHC-molekyler. Derfor, selv om donor og mottaker er kompatible for de viktigste HLA-antigenene, kan erytrocyttene deres ha forskjellige fenotyper. Det skilles mellom «alvorlig» inkompatibilitet, når mottakeren har eksisterende antistoffer mot donorens erytrocyttantigener, og «mindre» inkompatibilitet, når donoren har antistoffer mot mottakerens erytrocyttantigener. Tilfeller av en kombinasjon av «alvorlig» og «mindre» inkompatibilitet er mulige.

Resultatene av en sammenlignende analyse av den kliniske effektiviteten av allotransplantasjon av hematopoietiske stamceller fra benmarg og navlestrengsblod ved hemoblastoser indikerer at hos barn etter allotransplantasjon av hematopoietiske stamceller fra navlestrengsblod er risikoen for å utvikle en graft-versus-host-reaksjon betydelig redusert, men det observeres en lengre periode med gjenoppretting av antall nøytrofiler og blodplater med en høyere forekomst av dødelighet 100 dager etter transplantasjon.

Studien av årsakene til tidlig dødelighet gjorde det mulig å avklare kontraindikasjonene for allogen HSC-transplantasjon, blant hvilke de viktigste er:

• tilstedeværelse av positive tester for cytomegalovirusinfeksjon hos mottaker eller donor (uten forebyggende behandling);
• akutt strålesyke;
• tilstedeværelsen av eller til og med mistanke om en soppinfeksjon hos en pasient (uten å utføre systemisk tidlig profylakse med soppdrepende legemidler);
• hemoblastoser, der pasientene fikk langvarig behandling med cytostatika (på grunn av høy sannsynlighet for plutselig hjertestans og multippel organsvikt);
• transplantasjon fra HLA-ikke-identiske donorer (uten profylakse av akutt graft-versus-host-reaksjon med ciklosporin A);
• kronisk viral hepatitt C (på grunn av høy risiko for å utvikle venookklusiv leversykdom).

HSC-transplantasjon kan dermed forårsake alvorlige komplikasjoner, som ofte fører til død. I den tidlige perioden (opptil 100 dager etter transplantasjon) inkluderer disse infeksjonskomplikasjoner, akutt graft-versus-host-sykdom, transplantatavstøtning (svikt i donor-HSC-er), venookklusiv leversykdom, samt vevsskade forårsaket av toksisiteten til kondisjoneringsregimet, som er preget av en høy ombyggingsrate (hud, vaskulært endotel, tarmepitel). Komplikasjoner i den sene perioden etter transplantasjon inkluderer kronisk graft-versus-host-sykdom, tilbakefall av den underliggende sykdommen, veksthemming hos barn, dysfunksjon i reproduksjonssystemet og skjoldbruskkjertelen, og øyeskade.

Nylig, i forbindelse med publikasjoner om plastisiteten til benmargsceller, har ideen om å bruke HSC-er til å behandle hjerteinfarkt og andre sykdommer dukket opp. Selv om noen dyreforsøk støtter denne muligheten, må konklusjonene om plastisiteten til benmargsceller bekreftes. Dette forholdet bør tas i betraktning av de forskere som mener at transplanterte menneskelige benmargsceller lett transformeres til skjelettmuskulatur, hjerteinfarkt eller sentralnervesystemceller. Hypotesen om at HSC-er er en naturlig cellulær kilde til regenerering av disse organene krever seriøs bevisførsel.

Spesielt har de første resultatene fra en åpen, randomisert studie av V. Belenkov (2003) blitt publisert. Formålet var å studere effekten av C-SvK (dvs. mobilisering av autologe HSC-er i blodet) på den kliniske, hemodynamiske og nevrohumorale statusen til pasienter med moderat til alvorlig kronisk hjertesvikt, samt å evaluere sikkerheten mot bakgrunnen av standardbehandling (ACE-hemmere, betablokkere, diuretika, hjerteglykosider). I den første publikasjonen av studieresultatene bemerker forfatterne av programmet at det eneste argumentet for O-SvK er resultatene av behandling av én pasient, som viste en udiskutabel forbedring i alle kliniske og hemodynamiske parametere mot bakgrunnen av behandling med dette legemidlet. Teorien om HSC-mobilisering i blodet med påfølgende myokardregenerering i postinfarktsonen ble imidlertid ikke bekreftet - selv hos en pasient med positiv klinisk dynamikk avslørte ikke stressekkokardiografi med dobutamin forekomsten av soner med levedyktig myokard i arrområdet.

Det bør bemerkes at det for øyeblikket er klart utilstrekkelig med data til å anbefale erstatningscelleterapi for utbredt implementering i daglig klinisk praksis. Veldesignede og høykvalitets kliniske studier er nødvendige for å bestemme effektiviteten av ulike alternativer for regenerativ celleterapi, utvikle indikasjoner og kontraindikasjoner for den, samt retningslinjer for kombinert bruk av regenerativ-plastisk terapi og tradisjonell kirurgisk eller konservativ behandling. Det finnes fortsatt ikke noe svar på spørsmålet om hvilken bestemt populasjon av benmargsceller (hematopoietiske stamceller eller stromale celler) som kan gi opphav til nevroner og kardiomyocytter, og det er også uklart hvilke forhold som bidrar til dette in vivo.

Arbeid på disse områdene utføres i mange land. I sammendraget av symposiet om akutt leversvikt fra National Institutes of Health i USA, nevnes blant lovende behandlingsmetoder, sammen med levertransplantasjon, transplantasjon av xeno- eller allogene hepatocytter og ekstrakorporal tilkobling av bioreaktorer med leverceller. Det finnes direkte bevis for at bare fremmede funksjonelt aktive hepatocytter er i stand til å gi effektiv støtte til mottakerens lever. For klinisk bruk av isolerte hepatocytter er det nødvendig å opprette en cellebank, noe som vil redusere tiden mellom isolering av celler og bruk av dem betydelig. Den mest akseptable metoden for å opprette en bank av isolerte hepatocytter er kryokonservering av leverceller i flytende nitrogen. Ved bruk av slike celler i klinikken hos pasienter med akutt og kronisk leversvikt, er det vist en ganske høy terapeutisk effekt.

Til tross for de optimistiske og oppmuntrende resultatene av levercelletransplantasjon i eksperimenter og klinisk praksis, er det fortsatt mange problemer som langt fra er løst. Disse inkluderer et begrenset antall organer som er egnet for å utvinne isolerte hepatocytter, utilstrekkelig effektive metoder for isolering av disse, mangel på standardiserte metoder for å bevare leverceller, uklare ideer om mekanismene for vekst- og proliferasjonsregulering av transplanterte celler, mangel på tilstrekkelige metoder for å vurdere innpoding eller avstøting av allogene hepatocytter. Dette inkluderer også tilstedeværelsen av transplantasjonsimmunitet ved bruk av allogene og xenogene celler, selv om det er mindre enn ved ortotopisk levertransplantasjon, men som krever bruk av immunsuppressiva, innkapsling av isolerte hepatocytter eller deres spesielle behandling med enzymer. Hepatocyttransplantasjon fører ofte til en immunkonflikt mellom mottaker og giver i form av en avstøtningsreaksjon, som krever bruk av cytostatika. En løsning på dette problemet kan være bruk av polymere mikroporøse bærere for å isolere leverceller, noe som vil forbedre overlevelsen deres, siden kapselmembranen effektivt beskytter hepatocytter til tross for vertsimmunisering.

Ved akutt leversvikt er imidlertid slik hepatocyttransplantasjon ineffektiv på grunn av den relativt lange tiden som kreves for leverceller å innpodes i et nytt miljø og nå stadiet med optimal funksjon. En potensiell begrensning er utskillelsen av galle under ektopisk transplantasjon av isolerte hepatocytter, og ved bruk av bioreaktorer er en betydelig fysiologisk barriere artsforskjellen mellom humane proteiner og proteinene produsert av xenogene hepatocytter.

Det finnes rapporter i litteraturen om at lokal transplantasjon av stromale stamceller fra benmarg muliggjør effektiv korrigering av beinfeil, og at restaurering av beinvev i dette tilfellet foregår mer intensivt enn ved spontan reparativ regenerering. Flere prekliniske studier på eksperimentelle modeller viser overbevisende muligheten for å bruke stromale celletransplantasjoner fra benmarg i ortopedi, selv om det er behov for ytterligere arbeid for å optimalisere disse metodene, selv i de enkleste tilfellene. Spesielt er optimale forhold for ekspansjon av osteogene stromale celler ex vivo ennå ikke funnet, og strukturen og sammensetningen av deres ideelle bærer (matrise) forblir uutviklet. Minimumsantallet celler som kreves for volumetrisk beinregenerering er ikke bestemt.

Det er bevist at mesenkymale stamceller viser transgermal plastisitet, dvs. evnen til å differensiere til celletyper som fenotypisk er ubeslektet med cellene i den opprinnelige linjen. Under optimale dyrkingsforhold kan polyklonale stromale stamcellelinjer fra benmarg tåle mer enn 50 delinger in vitro, noe som gjør det mulig å oppnå milliarder av stromale celler fra 1 ml benmargsaspirat. Populasjonen av mesenkymale stamceller er imidlertid heterogen, noe som manifesterer seg både ved variasjon i kolonistørrelser, ulik dannelsesrate og morfologisk mangfold av celletyper, fra fibroblastlignende spindelformede til store flate celler. Fenotypisk heterogenitet observeres etter bare 3 uker med dyrking av stromale stamceller: noen kolonier danner knuter av beinvev, andre danner klynger av adipocytter, og andre, mer sjeldne, danner øyer av bruskvev.

Transplantasjon av embryonalt nervevev ble opprinnelig brukt til å behandle degenerative sykdommer i sentralnervesystemet. I de senere år har cellulære elementer fra nevrosfærer hentet fra nevrale stamceller blitt transplantert i stedet for embryonalt hjernevev (Poltavtseva, 2001). Nevrosfærer inneholder dedikerte forløpere til nevroner og nevroglia, noe som gir håp om gjenoppretting av tapte hjernefunksjoner etter transplantasjon. Etter transplantasjon av dispergerte nevrosfæreceller til striatumregionen i rottehjernen, ble det observert deres proliferasjon og differensiering til dopaminerge nevroner, noe som eliminerte motorisk asymmetri hos rotter med eksperimentell hemiparkinsonisme. Imidlertid utviklet det seg i noen tilfeller svulster fra nevrosfæreceller, noe som førte til dyrenes død (Bjorklund, 2002).

I klinikken ga nøye studier av to pasientgrupper, der verken pasientene eller legene som observerte dem visste (dobbeltblind studie), uventede resultater at én pasientgruppe ble transplantert med embryonalt vev med nevroner som produserte dopamin, og den andre pasientgruppen gjennomgikk en simulert operasjon. Pasienter som ble transplantert med embryonalt nervevev følte seg ikke bedre enn pasientene i kontrollgruppen. I tillegg utviklet 5 av 33 pasienter vedvarende dyskinesi 2 år etter transplantasjon av embryonalt nervevev, som ikke var tilstede hos pasientene i kontrollgruppen (Stamceller: vitenskapelig fremgang og fremtidige forskningsretninger. Nat. Inst, of Health. USA). Et av de uløste problemene i klinisk forskning på nevrale stamceller i hjernen er fortsatt analysen av de reelle utsiktene og begrensningene ved transplantasjon av deres derivater for korrigering av CNS-lidelser. Det er mulig at nevrogenese i hippocampus indusert av langvarig anfallsaktivitet, som fører til strukturell og funksjonell reorganisering, kan være en faktor i den progressive utviklingen av epilepsi. Denne konklusjonen fortjener spesiell oppmerksomhet, siden den peker på mulige negative konsekvenser av genereringen av nye nevroner i den modne hjernen og dannelsen av avvikende synaptiske forbindelser av dem.

Det bør ikke glemmes at dyrking i medier med cytokiner (mitogener) bringer stamcellenes egenskaper nærmere tumorcellenes, siden lignende endringer i reguleringen av cellesykluser forekommer i dem, noe som bestemmer evnen til ubegrenset deling. Det er uforsvarlig å transplantere tidlige derivater av embryonale stamceller inn i en person, siden risikoen for å utvikle ondartede neoplasmer i dette tilfellet er svært høy. Det er mye tryggere å bruke deres mer engasjerte avkom, det vil si forløperceller fra differensierte linjer. Imidlertid er det for øyeblikket ikke utviklet en pålitelig teknikk for å oppnå stabile linjer av menneskelige celler som differensierer i ønsket retning.

Bruken av molekylærbiologiske teknologier for korrigering av arvelig patologi og menneskelige sykdommer ved å modifisere stamceller er av stor interesse for praktisk medisin. Egenskapene til stamcellegenomet gjør det mulig å utvikle unike transplantasjonsordninger for å korrigere genetiske sykdommer. Det er imidlertid en rekke begrensninger på dette området som må overvinnes før den praktiske anvendelsen av genteknologi for stamceller. Først og fremst er det nødvendig å optimalisere prosessen med ex vivo-modifisering av stamcellers genom. Det er kjent at langvarig (3-4 uker) proliferasjon av stamceller reduserer transfeksjonen deres, så flere transfeksjonssykluser er nødvendige for å oppnå et høyt nivå av genetisk modifisering. Hovedproblemet er imidlertid knyttet til varigheten av terapeutisk genuttrykk. Til nå har ingen studier i noen studie overskredet perioden med effektiv uttrykk etter transplantasjon av modifiserte celler. I 100 % av tilfellene reduseres uttrykket av transfekterte gener over tid på grunn av inaktivering av promotorer og/eller død av celler med et modifisert genom.

Et viktig spørsmål er kostnadene ved bruk av celleteknologi i medisin. For eksempel er det anslåtte årlige behovet for å finansiere kun de medisinske utgiftene til en benmargstransplantasjonsenhet som er utformet for å utføre 50 transplantasjoner per år, omtrent 900 000 amerikanske dollar.

Utviklingen av celleteknologier i klinisk medisin er en kompleks og flertrinnsprosess som involverer konstruktivt samarbeid mellom tverrfaglige vitenskapelige og kliniske sentre og det internasjonale samfunnet. Samtidig krever spørsmål om vitenskapelig organisering av forskning innen celleterapi spesiell oppmerksomhet. De viktigste av disse er utvikling av kliniske forskningsprotokoller, kontroll over påliteligheten til kliniske data, dannelse av et nasjonalt studieregister, integrering i internasjonale programmer for multisenter kliniske studier og implementering av resultater i klinisk praksis.

Som avslutning på innledningen til problemene innen celletransplantasjon, vil jeg uttrykke håp om at en forening av innsatsen til ledende ukrainske spesialister fra ulike vitenskapsfelt vil sikre betydelige fremskritt innen eksperimentell og klinisk forskning, og vil gjøre det mulig i de kommende årene å finne effektive måter å yte bistand til alvorlig syke mennesker som trenger organ-, vevs- og celletransplantasjon.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]