Krystallavleiringenes rolle i patogenesen ved artrose

Basiske kalsiumfosfatkrystaller (BCP-krystaller) finnes i synovialvæsken hos 30–60 % av pasienter med slitasjegikt. Ifølge A. Swan et al. (1994) finnes kalsiumholdige krystaller i synovialvæsken hos et mye større antall pasienter med slitasjegikt. På grunn av krystallenes ekstremt lille størrelse eller deres lave antall identifiseres de imidlertid ikke ved hjelp av konvensjonelle teknikker. Tilstedeværelsen av BCP-krystaller i synovialvæsken korrelerer med radiografiske tegn på leddbruskdegenerasjon og er assosiert med et større volum av effusjon sammenlignet med effusjon i kneledd uten krystaller. En studie av faktorer som påvirker den radiografiske progresjonen av gonartrose viste at avsetning av kalsiumpyrofosfatdihydratkrystaller (CPPD-krystaller) er en prediktor for et ugunstig klinisk og radiografisk utfall. I en studie av eldre pasienter ble slitasjegikt funnet å være assosiert med kondrokalsinose, spesielt i det laterale tibiofemorale kammeret i kneet og de tre første metakarpofalangeale leddene. Det er ikke uvanlig at begge typer krystaller, OFC og PFC, finnes hos pasienter med slitasjegikt.

Klinisk sett er leddbruskdegenerasjon forårsaket av kalsiumkrystallavsetning forskjellig fra det som sees ved primær artrose. Hvis krystaller var et enkelt epifenomen for bruskdegenerasjon, ville de blitt funnet i leddene som oftest er rammet av primær artrose, dvs. knær, hofter og små ledd i hendene. I motsetning til dette rammer krystallavsetningssykdommer oftest ledd som ikke er typiske for primær artrose, som skulder, håndledd og albue. Tilstedeværelsen av krystaller i leddvæsken (effusjonsvæsken) er assosiert med mer alvorlig leddbruskdegenerasjon. Spørsmålet om hva som er årsaken og hva som er effekten, krystallavsetning eller bruskdegenerasjon, diskuteres. En mellomliggende posisjon inntas av følgende antagelse: en primær anomali i bruskmetabolismen fører til degenerasjon, og sekundær avsetning av krystaller akselererer nedbrytningen (den såkalte amplifiseringsløyfeteorien).

Den nøyaktige mekanismen som kalsiumkrystaller bruker for å skade leddbrusk er ukjent og oppsummeres nedenfor. Teoretisk sett kan kalsiumkrystaller skade kondrocytter direkte. Histologisk undersøkelse avslører imidlertid sjelden krystaller i nærheten av kondrocytter, og enda sjeldnere inntas de av dem. Den mest sannsynlige mekanismen er fagocytose av krystaller av synovialforingsceller, etterfulgt av frigjøring av proteolytiske enzymer eller utskillelse av cytokiner som stimulerer frigjøring av enzymer fra kondrocytter. Dette konseptet støttes av en studie av rollen til PFKD-indusert synovitt i utviklingen av raskt progressiv artrose ved pyrofosfatartropati. I denne studien ble kalsiumpyrofosfatdihydratkrystaller (1 eller 10 mg) injisert ukentlig i høyre kne hos kaniner med artrose indusert av delvis lateral meniskektomi. Det viste seg at etter 8 injeksjoner viste høyre kneledd betydelig mer alvorlige endringer sammenlignet med det venstre. Intensiteten av synovial betennelse korrelerte med intraartikulære injeksjoner av kalsiumpyrofosfatdihydratkrystaller og deres dose. Til tross for at dosene av CPPD-krystaller som ble brukt i denne studien overstiger de in vivo, indikerer resultatene rollen til CPPD-indusert betennelse i progresjonen av slitasjegikt ved pyrofosfatartropati.

Potensielle mekanismer for induksjon av leddbruskskade av kalsiumholdige krystaller er assosiert med deres mitogene egenskaper, evnen til å indusere MMP-er og stimulere prostaglandinsyntese.

Mitogen effekt av kalsiumholdige krystaller. Ved krystallassosierte artropatier observeres ofte proliferasjon av synoviale slimhinneceller, hvor krystallene i seg selv bare delvis er ansvarlige for denne prosessen. Økningen i antall synovialceller er ledsaget av økt sekresjon av cytokiner, som fremmer kondrolyse og induserer sekresjon av proteolytiske enzymer. OFC-krystaller i konsentrasjoner funnet i menneskelig leddpatologi stimulerer doseavhengig mitogenesen av hvilende hudfibroblastkulturer og synoviale fibroblaster fra hund og mus. Krystaller av kalsiumpyrofosfatdihydrat, urat, sulfat, karbonat og kalsiumfosfat stimulerer cellevekst. Starten og toppen av ( ^3H )-tymidin-inkorporering indusert av disse krystallene forskyves med 3 timer sammenlignet med stimulering av celler med blodserum. Denne tidsperioden kan være nødvendig for fagocytose og oppløsning av krystaller. Tilsetning av kontrollkrystaller av samme størrelse (f.eks. diamantstøv eller latekspartikler) stimulerte ikke mitogenesen. Natriumuratmonohydratkrystaller hadde svake mitogene egenskaper og var betydelig dårligere enn kalsiumurat, noe som indikerer viktigheten av kalsiuminnholdet i krystallene i mitogenesen. Syntetiske OFC-krystaller hadde de samme mitogene egenskapene som krystaller oppnådd fra pasienter med kondrokalsinose. Den mitogene effekten av kalsiumholdige krystaller var ikke et resultat av en økning i kalsiuminnholdet i det omkringliggende næringsmediet in vitro, siden oppløsning av basiske kalsiumfosfatkrystaller i næringsmediet ikke stimulerte inkorporeringen av ( ^3H )-tymidin av fibroblaster.

En foreslått mekanisme for OFC-indusert mitogenese er at unormal synovialcelleproliferasjon kan skyldes, i det minste delvis, endocytose og intracellulær oppløsning av krystaller, noe som øker cytoplasmatiske Ca2 ⁺ -konsentrasjoner og aktiverer den kalsiumavhengige banen som fører til mitogenese. Dette konseptet støttes av kravet om direkte celle-krystallkontakt for å stimulere mitogenese, siden eksponering av cellekulturer for krystaller induserte cellevekst, mens eksponering av celler fratatt slik kontakt ikke gjorde det. For å studere kravet om krystallfagocytose etter celle-krystall-interaksjon ble celler dyrket med ^45Ca -OPC og ( ^3H )-tymidin. Det ble funnet at celler som inneholdt ^45Ca -OPC inkorporerte betydelig mer ( ^3H )-tymidin enn celler uten basisk kalsiumfosfatmerking. I makrofagkulturer resulterte hemming av krystallendocytose av cytochalasin i hemming av krystalloppløsning, noe som ytterligere understreker nødvendigheten av fagocytose.

Kalsiumholdige krystaller er løselige i syre. Etter fagocytose løses krystallene opp i det sure miljøet i makrofagfagolysosomer. Klorokin, ammoniumklorid, bafilomycin A1 og alle lysosomotrofe midler som øker lysosomal pH, hemmer doseavhengig intracellulær krystalloppløsning og (3H)-tymidinopptak ⁱ fibroblaster dyrket med basiske kalsiumfosfatkrystaller.

Tilsetning av OFC-krystaller til en monolags fibroblastkultur forårsaket en umiddelbar tifoldig økning i intracellulært kalsium, som returnerte til baseline etter 8 minutter. Kalsiumkilden var hovedsakelig ekstracellulært ion, siden de basiske kalsiumfosfatkrystallene ble tilsatt et kalsiumfritt kulturmedium. Den neste økningen i intracellulær kalsiumkonsentrasjon ble observert etter 60 minutter og varte i minst 3 timer. Her var kalsiumkilden fagocytoserte krystaller oppløst i fagolysosomer.

Det ble funnet at den mitogene effekten av OFC-krystaller er lik den til PDGF som en vekstfaktor; i likhet med sistnevnte viser OFC-krystaller synergisme med IGF-1 og blodplasma. Blokkering av IGF-1 reduserer cellemitogenese som respons på OFC. PG Mitchell et al. (1989) viste at induksjon av mitogenese i Balb/c- ₃ T3-fibroblaster _av OFC-krystaller krever tilstedeværelse av serin/treoninproteinkinase C (PKC), en av de viktigste mediatorene av signaler generert under ekstern stimulering av celler med hormoner, nevrotransmittere og vekstfaktorer. En reduksjon i PKC-aktivitet i Balb/c-3 T3-celler _hemmerOFC -mediert induksjon av proto-onkogenene c-fos og c-myc, men påvirker ikke stimuleringen av disse onkogenene mediert av PDGF.

Økningen i intracellulært kalsium etter oppløsning av fagocytiserte krystaller er ikke den eneste signalveien for mitogenese. Når vekstfaktorer som PDGF binder seg til membranreseptoren sin, stimuleres fosfolipase C (en fosfodiesterase), som hydrolyserer fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat for å danne de intracellulære budbringerne inositol-3-fosfat og diacylglycerol. Førstnevnte frigjør kalsium fra endoplasmatisk retikulum ved å modulere aktiviteten til kalsiumavhengige og kalsium/calmodulin-avhengige enzymer som proteinkinaser og proteaser.

R. Rothenberg og H. Cheung (1988) rapporterte økt nedbrytning av fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat av fosfolipase C i kanin-synovialceller som respons på stimulering med OFC-krystaller. Sistnevnte økte innholdet av inositol-1-fosfat betydelig i celler med merket ( ^3H )-inositol; toppen ble nådd innen 1 minutt og vedvarte i omtrent 1 time.

Diacylglyserol er en potensiell aktivator av kalsiumpyrofosfatdihydrat. Siden OFC-krystaller øker fosfolipase C-aktiviteten, noe som fører til akkumulering av diacylglycerol, kan man følgelig forvente en økning i PKC-aktivering. PG Mitchell et al. (1989) sammenlignet effektene av OFC-krystaller og PDGF på DNA-syntese av Balb/c- _{3T3-fibroblaster}. I cellekultur ble PKC inaktivert ved inkubasjon av celler med tumorstøttende forboldiester (TPD), en diacylglycerolanalog. Langtidsstimulering med lave doser TPD reduserte PKC-aktiviteten, mens en enkelt stimulering med en høy dose aktiverte den. Stimulering av DNA-syntese av OFC-krystaller ble undertrykt etter PKC-inaktivering, noe som indikerer viktigheten av dette enzymet i OFC-indusert mitogenese. Tidligere demonstrerte GM McCarthy et al. (1987) en sammenheng mellom den mitogene responsen til humane fibroblaster på OFC-krystaller og PKC-aktivering. OFC-krystaller aktiverer imidlertid ikke fosfatidylinositol 3-kinase eller tyrosinkinaser, noe som bekrefter at mekanismen for celleaktivering av OFC-krystaller er selektiv.

Celleproliferasjon kontrolleres av en gruppe gener kalt proto-onkogener. Proteinene foe og mye, produkter av proto-onkogenene c-fos og c-myc, er lokalisert i cellekjernen og bundet til spesifikke DNA-sekvenser. Stimulering av 3T3-fibroblaster med OFC-krystaller resulterer i c-fos-ekspresjon innen få minutter, som når maksimalt 30 minutter etter stimulering. Induksjon av c-myc-transkripsjon av OFC-krystaller eller PDGF skjer innen 1 time og når maksimalt 3 timer etter stimulering. Cellene opprettholder et forhøyet nivå av c-fos- og c-myc-transkripsjon i minst 5 timer. I celler med inaktivert PCD er stimuleringen av c-fos og c-myc av OFC- eller TFD-krystaller betydelig undertrykt, mens induksjonen av disse genene av PDGF ikke endres.

Medlemmer av mitogenaktivert proteinkinase (MAP K)-familien er nøkkelregulatorer av ulike intracellulære signalkaskader. En underklasse av denne familien, p42/p44, regulerer celleproliferasjon gjennom en mekanisme som involverer aktivering av proto-onkogenene c-fos og c-jun. OFC- og PFKD-krystaller aktiverer en proteinkinasesignalvei som involverer både p42 og p44, noe som tyder på en rolle for denne signalveien i kalsiumholdig krystallindusert mitogenese.

Til slutt involverer OFC-indusert mitogenese transkripsjonsfaktoren kjernefaktor κB (NF-κB), som først ble beskrevet som immunoglobulin κ lettkjede (IgK)-genet. Det er en induserbar transkripsjonsfaktor som er viktig i mange signalveier fordi den regulerer uttrykket av forskjellige gener. NF-κB-induksjon er vanligvis koblet til frigjøring av hemmende proteiner kalt IκB fra cytoplasmaet. NF-κB-induksjon etterfølges av translokasjon av den aktive transkripsjonsfaktoren til kjernen. OFC-krystaller induserer NF-κB i Balb/c- _3T3- fibroblaster og humane hudfibroblaster.

Flere signalveier kan være involvert i signaltransduksjon etter NF-κB-aktivering, men alle involverer proteinkinaser som fosforylerer (og dermed degraderer) IκB. Basert på in vitro-studier ble IκB tidligere antatt å tjene som et substrat for kinaser (f.eks. PKC og proteinkinase A). Imidlertid har et IκB-kinasekompleks med stor molekylvekt nylig blitt identifisert. Disse kinasene fosforylerer spesifikt serinrester av IκB. NF-κB-aktivering av TNF-α og IL-1 krever effektiv virkning av NF-κB-induserende kinase (NIK) og IκB-kinase. Den molekylære mekanismen for NIK-aktivering er foreløpig ukjent. Selv om OFC-krystaller aktiverer både PKC og NF-κB, er det ukjent i hvilken grad disse to prosessene kan være knyttet sammen. Siden GκB-kinasemodifisering skjer via fosforylering, kan det ikke utelukkes en rolle for PKC i induksjonen av NF-κB av OFC-krystaller via fosforylering og aktivering av GκB-kinase. Dette konseptet støttes av hemmingen av OFC-krystallindusert mitogenese og NF-κB-ekspresjon av PKC-hemmeren staurosporin. På samme måte kan staurosporin hemme GκB-kinase, og dermed hemme proteinkinase A og andre proteinkinaser.

Dermed inkluderer mekanismen for OFC-krystallindusert mitogenese i fibroblaster minst to forskjellige prosesser:

• en rask membranbundet hendelse som resulterer i aktivering av PKC og MAP K, induksjon av NF-κB og proto-onkogener,
• langsommere intracellulær oppløsning av krystaller, noe som fører til en økning i det intracellulære innholdet av Ca2 ⁺, og deretter til aktivering av en rekke kalsiumavhengige prosesser som stimulerer mitogenese.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Induksjon med MMP-kalsiumholdige krystaller

Mediatorene for vevsskade forårsaket av kalsiumholdige krystaller er MMP-er - kollagenase-1, stromelysin, 92 kD gelatinase og kollagenase-3.

Gitt forholdet mellom OFC-krystallinnhold og ødeleggelse av leddvev, ble det fremsatt en hypotese om at OFC-krystaller og muligens noen kollagener fagocyteres av synovialceller. Stimulerte synovocytter prolifererer og utskiller proteaser. Denne hypotesen ble testet in vitro ved å tilsette naturlige eller syntetiske OFC, PFCD og andre krystaller til dyrkede synovocytter fra mennesker eller hunder. Aktiviteten til nøytrale proteaser og kollagenaser økte doseavhengig og var omtrent 5–8 ganger høyere enn for kontrollcellekulturen dyrket uten krystaller.

I celler dyrket i et krystallholdig medium ble det påvist ko-induksjon av kollagenase-1, stromelysin og gelatinase-92 kDa mRNA, etterfulgt av utskillelse av enzymer i mediet.

OFC-krystaller induserte også akkumulering av kollagenase-1 og kollagenase-2 mRNA i modne svinekondrocytter, etterfulgt av utskillelse av enzymene i mediet.

GM McCarty et al. (1998) studerte rollen til intracellulær krystalloppløsning i krystallindusert MMP-produksjon. Forhøyelse av lysosomal pH med bafilomycin A hemmet intracellulær krystalloppløsning og dempet også den proliferative responsen til humane fibroblaster på OFC-krystaller, men hemmet ikke MMP-syntese og -sekresjon.

Verken basisk kalsiumfosfat eller PFCD-krystaller induserte IL-1-produksjon in vitro, men natriumuratkrystaller gjorde det.

Nåværende data indikerer tydelig direkte stimulering av MMP-produksjon av fibroblaster og kondrocytter ved kontakt med kalsiumholdige krystaller.

Symptomer på slitasjegikt indikerer en betydelig rolle MMP spiller i sykdomsprogresjonen. Tilstedeværelsen av kalsiumholdige krystaller øker degenerasjonen av vev i de berørte leddene.

Stimulering av prostaglandinsyntese

Sammen med stimulering av cellevekst og utskillelse av enzymer, forårsaker kalsiumholdige krystaller frigjøring av prostaglandiner fra pattedyrcellekulturer, spesielt PGE2 _. Frigjøring av PGE2 skjer _i alle tilfeller innen den første timen etter at cellene har blitt eksponert for krystallene. R. Rothenberg (1987) bestemte at hovedkildene til arakidonsyre for syntesen av PGE2 _er fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin, og bekreftet også at fosfolipase A2 _og NOX er de dominerende veiene for PGE2- _produksjon.

PGE1 kan også frigjøres som respons på OFA-krystaller. GM McCarty et al. (1993, 1994) studerte effektene av PGE2 _, PGE og dets analog misoprostol på den mitogene responsen til humane fibroblaster på OFA-krystaller. Alle tre stoffene hemmet den mitogene responsen på en doseavhengig måte, der PGE og misoprostol viste mer uttalt hemmende aktivitet. PGE2 og misoprostol, men ikke PGE2 _, hemmet akkumuleringen av kollagenase mRNA som respons på OFA-krystaller.

MG McCarty og H. Cheung (1994) undersøkte mekanismen bak OFC-mediert aktivering av celler av PGE. Forfatterne viste at PGE, en kraftigere induser av intracellulær cAMP enn PGE2 _, og PGE, hemmer OFC-indusert mitogenese og MMP-produksjon via en cAMP-avhengig signaltransduksjonsvei. Det er mulig at økningen i PGE-produksjon indusert av OFC-krystaller svekker deres andre biologiske effekter (mitogenese og MMP-produksjon) via en tilbakekoblingsmekanisme.

Krystallindusert betennelse

Kalsiumholdige krystaller finnes ofte i synovialvæsken hos pasienter med slitasjegikt. Imidlertid er episoder med akutt betennelse med leukocytose sjeldne både ved slitasjegikt og ved krystallassosierte artropatier (for eksempel Milwaukee-skuldersyndrom). Krystallenes flogistiske potensial kan modifiseres av en rekke hemmende faktorer. R. Terkeltaub et al. (1988) demonstrerte blodserums og plasmas evne til å hemme responsen til nøytrofile granulocytter på basiske kalsiumfosfatkrystaller betydelig. Faktorene som forårsaker slik hemming er krystallbindende proteiner. En studie av et av disse proteinene, et ₂ -HS-glykoprotein (AHSr), viste at AHSr er den mest potente og spesifikke hemmeren av responsen til nøytrofile granulocytter på OFC-krystaller. AHSr er et serumprotein av leveropprinnelse. Det er kjent at det, sammenlignet med andre serumproteiner, finnes i relativt høye konsentrasjoner i bein og mineraliserende vev. I tillegg finnes AHSr i «ikke-betent» synovialvæske og har også blitt påvist på basiske kalsiumfosfatkrystaller i naturlig synovialvæske. Dermed kan ikke muligheten for at AHSr modulerer det flologene potensialet til basiske kalsiumfosfatkrystaller in vivo utelukkes.

For å oppsummere alt ovenfor presenterer vi to skjemaer for artrosepatogenese foreslått av WB van den Berg et al. (1999) og M. Carrabba et al. (1996), som kombinerer mekaniske, genetiske og biokjemiske faktorer.