Ikke-viral genterapi gir håp for kroniske korsryggsmerter

I en fersk studie publisert i tidsskriftet Biomaterials utviklet forskere en ny ikke-viral genterapi for å behandle diskogene ryggsmerter (DBP) ved å levere transkripsjonsfaktoren Forkhead Box F1 (FOXF1) ved hjelp av konstruerte ekstracellulære vesikler (eEV-er) inn i degenerative mellomvirvelskiver (IVD-er) in vivo.

Kroniske korsryggsmerter er et voksende globalt problem på grunn av en aldrende befolkning og forverrede opioidproblemer. Nåværende behandlinger inkluderer kortvarig lindring eller dyre operasjoner, noe som understreker behovet for ikke-avhengighetsskapende og mindre invasive behandlinger.

Nåværende biologiske tilnærminger, inkludert vekstfaktoradministrasjon, celleterapi og viral genterapi, kan redusere degenerasjon i dyre- og menneskemodeller. Imidlertid kan problemer som kortsiktige effekter, dårlig langsiktig effekt og unødvendig immunogenisitet og onkogenisitet hindre direkte anvendelse av disse tilnærmingene.

I denne studien etablerte forskerne en ikke-viral genterapi for degenerasjon av mellomvirvelskive (IVD) ved bruk av FOXF1-eEV.

Forskerne transfekterte primære museembryonale fibroblaster (PMEF) med plasmider som inneholdt FOXF1 eller pCMV6 som kontroll og karakteriserte eEV-prøver ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA).

De vurderte effektiv lasting av molekylær last i eEV-er ved hjelp av kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) og konvensjonell PCR. Western blot-analyse identifiserte FOXF1 og EV-spesifikke proteiner i eEV-formasjoner. Teamet brukte plasmider som forsterker de øvre og nedre polylinkerregionene for å bestemme tilstedeværelsen av FOXF1-plasmid-DNA i donorceller og genererte eEV-er.

De undersøkte mRNA i full lengde produsert fra plasmid-DNA i eEV-er og donorceller.

Forskere laget ekstracellulære vesikler med transkripsjonsfaktorer for å gjenopprette vevsfunksjon og endre smerteresponser i en dyremodell av DBP.

De identifiserte EV-er for transport og distribusjon av FOXF1 til skadede mellomvirvelskiver i en musemodell av diskogene ryggsmerter for å bestemme FOXF1 eEV-hemming av degenerasjon av mellomvirvelskiver.

Teamet kombinerte biomekanisk testing av mellomvirvelskiver hos mus med avbildning, endringer i ekstracellulær matriks (ECM) og smerteresponser vurdert etter 12 uker for å bekrefte endringer i struktur og funksjon, samt smerte, indusert av den terapeutiske intervensjonen.

Preoperative og postoperative smertevurderinger inkluderte mikro-computertomografi (mikro-CT), magnetisk resonansavbildning (MR), mekanisk testing, Alcianblått (AB) og picrosiriusrødt (PSR) farging, dimetylmetylenblått-test og immunhistokjemi (IHC).

Studien involverte en kirurgisk teknikk der forskere administrerte buprenorfin ER subkutant til mus for å kontrollere postoperative smerter.

Teamet gjennomførte atferdsvurderinger før operasjonen og annenhver uke fra fire til tolv uker etter operasjonen, ved hjelp av en rekke metoder, inkludert åpenfelttest, kaldplate, haleoppheng og wireoppheng.

Åpenfelttesten vurderte den spontane aktiviteten til mus; kalde platetester målte termisk hyperalgesi; haleopphengstester målte aksial smerte; og trådopphengstester målte styrke.

Tolv uker etter operasjonen dissekerte teamet dyrenes korsryggsøyler ved hjelp av lårbensnerve- og arteriesporing for å identifisere mellomvirvelskiver mellom L4 og L5, L5 og L6, og L6 og S1 IVD. De brukte L5/L6 IVD til å vurdere histologi og bestemme glykosaminoglykan (GAG)-innhold.

FOXF1 eEV-er reduserte smerteresponsene betydelig samtidig som de gjenopprettet IVD-struktur og -funksjon, inkludert forbedret skivehøyde, vevshydrering, proteoglykaninnhold og mekaniske egenskaper.

Studien fokuserte på frigjøring av FOXF1-lastede eEV-er fra primære fibroblaster transfektert med transkripsjonsfaktoren FOXF1. Kvantitativ RT-PCR viste en signifikant økning i FOXF1 mRNA-transkriptnivåer og fulllengde-transkriberte FOXF1 mRNA-nivåer sammenlignet med pCMV6-transfekterte celler.

FOXF1 eEV-terapi kan redusere smerteresponser i en lumbal diskpunksjonsmodell hos mus i opptil 12 uker. Hunnmus viste lengre anfallstider i FOXF1-behandlede grupper enn i den skadde gruppen, som varte i minst 12 uker etter behandling.

FOXF1 eEV-terapi forbedret hydrering og høyde i IVD-vev hos skadde og degenerative dyr in vivo, samtidig som hydreringsnivåer og T2-vektet bildeintensitet i IVD-disken ble opprettholdt.

Teamet observerte imidlertid en reduksjon i skivehøyde hos skadde dyr og dyr behandlet med pCMV6 eEV. Mus behandlet med FOXF1 eEV hadde ingen reduksjon i skivehøyde 12 uker etter behandling. Kjønn påvirket ikke funksjonelle utfall.

FOXF1 eEV-er gjenopprettet den mekaniske funksjonen til skadede og degenererte IVD-er in vivo. Under aksial belastning viste FOXF1 eEV-behandlede IVD-er høyere normalisert NZ-stivhet sammenlignet med skadede IVD-er.

Under krypforhold viste skadede IVD-er økte normaliserte krypforskyvninger, noe som indikerer en reduksjon i normalisert krypelastisk stivhet.

Resultatene viser at reduksjon av GAG-innhold i skadede IVD-er øker mekanisk fleksibilitet, men eEV-behandling forhindrer tap av glykosaminoglykaner og påfølgende endringer i mekanisk funksjon.

FOXF1 eEV-er induserte strukturelle og funksjonelle endringer i IVD ved å øke proteoglykan- og GAG-nivåene.

Resultatene av studien viste at eEV-er lastet med utviklingsmessige transkripsjonsfaktorer kan behandle smertefulle leddsykdommer som DBP ved å levere disse transkripsjonsfaktorene til degenerative og smertefulle ledd via IVD.

Denne strategien kan bidra til å redusere strukturelle og funksjonelle abnormaliteter forårsaket av sykdommen og regulere smerteresponser på en kjønnsspesifikk måte.

Forskerne anbefalte også å bruke utviklingsmessige transkripsjonsfaktorer som FOXF1 for å flytte degenerative NP-celler til en pro-anabol tilstand in vivo. Ytterligere studier er nødvendige for å bestemme den terapeutiske effekten.