Eksperimentelt arbeid med transplantasjon av allogene keratinocytter på kunstig skapte arr hos hvite rotter

Ønsket om å utnytte det cellulære potensialet og behovet for å finne nye effektive metoder for å forbedre arrs estetiske utseende førte til ideen om å prøve å studere muligheten for å transplantere keratinocytter på arroverflater.

For å bevise sannsynligheten for å bruke keratinocyttkultur for å forbedre arrs utseende, ble det utført en eksperimentell studie på hvite laboratorierotter, hvor det ble laget arroverflater. Rottearrmodellen ble oppnådd som et resultat av heling av kunstig påførte sår på ryggen, langs ryggraden. Rottene ble kuttet ut identiske hudbiter, 2x3 cm store. 2,5 måneder etter "arrmodellerings"-operasjonen gjennomgikk rottene dermabrasjon (fjerning av de øvre lagene av arret ved hjelp av termokaustik), og allogene keratinocytter ble transplantert, isolert fra huden til rotteunger 2-4 dager etter fødselen.

Isolering og dyrking av rotteepidermalceller ble utført i laboratoriet for celleteknologier ved Institutt for cytologi ved Det russiske vitenskapsakademiet ved bruk av følgende teknologi.

Huden ble vasket i Hanks saltvannsløsning som inneholdt 200 U/ml gentamicin og kuttet i små biter, 0,2–0,5 cm2 i areal ^. Hudbitene ble inkubert i 0,5 % dispaseløsning i balansert saltfosfatbufret løsning ved 37 °C i 1 time. Bitene ble deretter overført til Dulbeccos fosfatbufret saltvann, og epidermis ble separert fra dermis. Epidermis ble inkubert i 0,125 % trypsinløsning i 10–15 minutter under omrøring ved 50 o/min, hvoretter enzymvirkningen ble stoppet ved å tilsette 5 % føtalt bovint serum. En tredjedel av den resulterende cellesuspensjonen ble brukt i ren form for et av alternativene for transplantasjon til arr, den andre tredjedelen ble dyrket på biokompatible huslige filmbelegg "Polypor", og den tredjedelen - på petriskåler uten substrat. Operasjonen med dermabrasjon av de resulterende arrene hos rotter med påfølgende transplantasjon av rotteepidermalceller på dem ble utført under eterbedøvelse ved bruk av termisk kauterisering.

I den første gruppen rotter, etter dermabrasjon, ble sterile biter av kambrisk materiale plassert på den polerte overflaten av arret, vasket med fysiologisk løsning og tørket, hvorpå en ristet suspensjon av allogene rotte-epidermocytter ble påført i en konsentrasjon på 1,5 millioner celler per 1 ml (ifølge Institutt for cytologi). Kambriskmaterialene ble plassert på det polerte arret slik at cellene lå på overflaten av arret. En bandasje av flere lag gasbind ble plassert på toppen, som ble sydd til kantene av arret.

En del av den oppnådde cellesuspensjonen ble sådd i petriskåler på sterile Polypore-filmer kuttet til formen på skålene, den andre delen - på petriskåler uten film. Dyrkingen ble utført i FAD-medium, bestående av en blanding av DMEM og F12-medium i forholdet 3:1, med tilsetning av 10 % føtalt bovint serum, 5 μg/ml insulin (Sigma), 0,5 μg/ml hydrokortisonhemisuccinat (Sigma), 10 μg/ml epidermal vekstfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Den andre og tredje gruppen med rotter, 7 individer hver, ble operert 6 dager etter den første. På dette tidspunktet var flerlagslag dannet fra suspensjonen av sådde keratinocytter i petriskålene, som ble transplantert inn i rottene. Den andre gruppen ble transplantert med epidermocytter på en film, den tredje - med et flerlagslag uten substrat. Etter 7 dager ble de oppnådde flerlagslagene av allogene keratinocytter (MPALK), sådd på "Polypore"-filmene, transplantert som en kultur direkte på såroverflaten. På toppen ble filmen, for å unngå at den rev av, festet med en flerlags gasbindbandasje og sydd til rottens hud.

Før transplantasjon av keratinocytter til den tredje gruppen rotter dyrket uten substrat, ble PAC separert fra bunnen av petriskålen ved å behandle den med dispase, som har evnen til selektivt å forstyrre dermal-epidermal bindinger. Når dispasen virker på et flerlagslag, forstyrrer den forbindelsen mellom basallagscellene og bunnen av petriskålen og har en mye mindre effekt på de intercellulære forbindelsene, noe som gjør det mulig å "fjerne" laget helt. Løsning av det flerlagslags cellelaget med dispase ble utført som følger. Transportmediet ble drenert fra petriskålene, cellelagene ble vasket tre ganger med et næringsmedium som inneholdt antibiotika, spesielt gentamicin (0,2 mg/ml). De flerlagslagene ble fylt med 0,125 % dispaseløsning ("Sigma") og plassert i en termostat, hvor de ble inkubert ved t=37 °C i 20–30 minutter. Utseendet til en hvit kant som flasser av langs lagets periferi er en indikator på begynnelsen av prosessen med å løsne fra kantene og bunnen av petriskålen. Noen få minutter etter at separasjonsprosessen startet, ble dispase-løsningen tappet ut, epitellagene ble vasket 2-3 ganger med mediet. Et stykke steril sårbandasje "Lita-color", kuttet til størrelsen på koppen, ble påført overflaten av det epidermale laget, hvorpå laget som ble separert med dispase, i tillegg skrellet av fra bunnen av koppen med en slikkepott, ble festet. Ved hjelp av en øyepinsett ble laget sammen med belegget av servietten "Lita-color" (Russland) revet av fra bunnen av petriskålen og forsiktig overført til den forberedte overflaten av arret. Serviettene "Lita-color" inneholder gentamicin og eksolin (kollagenekstrakt), som, når de ble fuktet med restene av vekstmediet og deretter med en fysiologisk løsning, svulmet opp og ble en moderne sårbandasje, som gir god beskyttelse mot ekstern infeksjon og rask helbredelse på grunn av den fuktighetsabsorberende strukturen.

Flerlags gasbind ble påført Polypore-filmene og Lita-color-serviettene og sydd til rottens hud for sterkere fiksering. Hver rotte ble plassert i et separat bur for å skape optimale forhold for vedlikehold og innpoding av de transplanterte keratinocyttene. Bandasjene til rottene som suspensjonen og flerlagslaget av epidermocytter fjernet ved dispase ble transplantert til, ble fuktet med sterilt saltvann flere ganger om dagen for å skape de gunstigste forholdene for innpoding av cellene. Siden Polypore-filmen var ugjennomtrengelig for vann, ble ikke bandasjene til rottene i den andre gruppen fuktet, noe som var en av fordelene fremfor transplantasjoner uten filmer. Bandasjene ble fjernet etter 10 dager. Det kliniske bildet av arr etter celletransplantasjon skilte seg lite fra arr uten transplantasjon, bortsett fra deres rosa farge (på grunn av dermabrasjon) og større avskalling. Dette faktum tyder på at det ikke skjedde noen endringer i arret umiddelbart etter at sårbandasjene falt av med MPC.

Ta biopsimateriale fra rotter.

Etter 1, 2, 5 og 9 måneder etter transplantasjon av allogene keratinocytter fra rotte til polerte arr fra hvite rotter, ble det tatt materiale for histologisk, cytomorfologisk og elektronmikroskopisk undersøkelse. Prøver av normal rottehud og arr uten celletransplantasjon ble tatt som kontroll. Anestesi av rotter ble utført med eterbedøvelse.

Etter anestesi ble det tatt biter av arrvev fra de markerte områdene der keratinocyttene ble transplantert ved hjelp av en biopsipunch med 2 mm diameter, og disse ble plassert i en 2,5 % glutaraldehydløsning for å forberede materialet til elektronmikroskopisk undersøkelse. Vevsbiter tatt for histologisk undersøkelse ble plassert i en 10 % nøytral formalinløsning, deretter ført gjennom alkoholer og innstøpt i parafin, deretter kuttet ultratynne snitt og undersøkt i et lysoptisk mikroskop.

Kontroll I. Normal rottehud.

For å se forskjellen mellom det mikroskopiske bildet av normal arrforandret rottehud og arr på visse tidspunkter etter transplantasjon av MPC, vises fotografier og beskrivelser av dem i alle stadier av denne studien.

Epidermis i normal hud består av 7–9 cellelag. Stratum corneum er av moderat tykkelse. Noen steder består den av 6–8 lag med hornskjell. Basallaget er representert av sylindriske celler med store, lette, regelmessig formede kjerner og flere nukleoler. Desmosomale forbindelser mellom cellene og med basalmembranen er tydelig uttrykt. Under den veldefinerte basalmembranen, som har små utvekster i det subepidermale laget, parallelt med den, ligger delikate bunter av kollagen- og elastinfibre, blant hvilke er langstrakte fibroblaster, små kar. I dypere lag ligger bunter av kollagen- og elastinfibre i forskjellige retninger. Blant dem er mange kar med tynne vegger av samme kaliber, cellulære elementer (fibroblaster, mastceller, leukocytter). Et stort antall hårsekker, talgkjertler.

Kontroll 2. Rottearr, 2 måneder gammel.

Klinisk bilde. Arrene er blekrosa, med avskalling, og det finnes skorper på enkelte steder. Arret har blitt redusert på grunn av sammentrekning av kollagenfibre og har blitt omtrent 3,0–3,5 cm ^. Hudvedheng er fraværende.

Mikroskopisk bilde. Epidermis består av 3–5 lag med foldede celler, representert av avrundede basalceller, én rad med subulatceller, 1–2 rader med granulære celler med keratohyalinkorn i det øvre laget, med områder med intracellulært ødem. Stratum corneum er ujevnt endret fra veldig tynt til fortykket. Arrfolding er observert på grunn av (sammentrekning) av arrvev. Foldene trenger inn i papillærlaget og skaper inntrykk av papiller. Grensen mellom epidermis og dermis er en rett linje. Basalmembranen er ikke sporet overalt. I den nedre delen av subepidermalt og dypere lag er det kar med en tykk, løs vegg, mange er øde, med stase. Rundt karene er det en opphopning av makrofager, fibroblaster. Makrofager omgir erytrocyttene som frigjøres fra kapillærene og fagocyterer dem. I de mer overfladiske lagene er det små kapillærer. Under epidermis er kollagenfibre løst plassert. I det dypere laget av arret er det grove bunter av kollagenfibre, blant hvilke det er mange fibroblaster.

Rottearr én måned etter transplantasjon av rottekeratinocytter.

Klinisk bilde. Arrene er rosa, arealet er redusert, spesielt i diameter, og er i gjennomsnitt 2,5–3 cm² ^. Hår og talgkjertler er fraværende.

Dataene fra mikroskopisk undersøkelse av materialet oppnådd fra rotter med transplantasjon av MPaLK på film og MPaLK uten substrat er praktisk talt identiske. Rent teknisk er det imidlertid mye mer komplisert og omhyggelig å arbeide med MPaLK uten substrat enn når man dyrker MPaLK på et substrat. Derfor brukte vi flerlags kambrisk materiale som grunnlag for dyrking ("substrater") i videre studier av spørsmålet om transplantasjon av keratinocytter.

Mikroskopisk bilde. Det observeres en fortykkelse av epidermis til 15–20 lag, nesten i midten av hvilken keratinocyttene har en smal, langstrakt, vertikal form og kompakt arrangement. Basalcellene er plassert i en ujevn linje. Kjernene deres er lette, store, avrundede med en eller to nukleoler, noe som indikerer deres høye syntetiske og proliferative aktivitet. Grensen mellom epidermis og dermis er en rett linje. Det tornformede laget er godt utviklet og består av 3–5 lag med avrundede celler, det er 2 nukleolære celler.

Rett under basalmembranen er det tett plasserte tynne bunter av kollagenfibre, parallelt med dem er det et stort antall forlatte kar, dypere kollagenfibre er grovere, samlet i tette bunter. Mange store fibroblaster, mastceller (2-3 i synsfeltet), makrofager, leukocytter og forlatte kar, hvis vegger er løsnet, rundt dem er det løst plasserte kollagenfibre. I noen kar er det stase, diapedese av dannede elementer. Rundt karene er det fibroblaster, enkeltlymfocytter. Hudvedheng er fraværende.

Når man transplanterer en keratinocytsuspensjon på et polert arr, er det mikroskopiske bildet forskjellig fra det forrige. Hos de fleste dyr er epidermis tynn og består av 5–6 lag med celler. Det nedre laget består av celler med uregelmessig, polygonal form med kjerner med rund-uregelmessig form. Tilstanden til det subepidermale laget ligner på tilstanden i gruppen av dyr uten MPALK-transplantasjon.

I dette tilfellet kan vi enten snakke om en forsinkelse i prosessene som følger med celletransplantasjon, eller om et stort tap av celler transplantert i form av en suspensjon. Derfor ble det trukket en konklusjon om hvor uhensiktsmessig det er å korrigere arr ved å transplantere keratinocytter i form av en suspensjon.

Rottearr 2 måneder etter transplantasjon av rottekeratinocytter.

Klinisk bilde. Arret ser tynt og delikat ut. Stedvis observeres avskalling og skjellende flekker.

Mikroskopisk bilde. Stratum corneum er fortykket, stedvis - hyperkeratose. Epidermis er fortykket og består av 12–20 rader med celler. Grensen mellom epidermis og dermis er en rett linje. Delikate kollagenfibre under epidermis ligger ganske tett. I de dypere lagene av arret er de samlet i store, grove bunter. I det subepidermale laget oppstår ny vaskulær formasjon. I de nedre lagene av arrvev er det mange øde kar som ligger parallelt med overflaten av epidermis. Store fibroblaster er jevnt fordelt i arrets tykkelse, det er gigantiske, flergrenede, mange makrofager.

Rottearr 5 måneder etter transplantasjon av rotteepidermalceller.

Klinisk bilde. Arret ser jevnt ut, glatt uten å flassing, det er enkeltstående hår, tettheten deres er større i utkanten av arrene, noe som indikerer marginal innvekst av hårsekker i arret og nydannelse av hårsekker. Arrets areal fortsetter å minke.

Mikroskopisk bilde. Epidermis er fortsatt tykk (15–20 lag, noen steder opptil 30). I de øvre lagene er den fylt med keratohyalinkorn. Basalmembranen er tydelig synlig. Under den ligger kollagenfibrene løst. I de nedre lagene er kollagenet kraftigere og tettere pakket. Det er mange kapillærer blant kollagenbuntene. I de øvre lagene har antallet øde kar redusert. Overgangen mellom epidermis og dermis er litt bølget. Noen steder er det dype epidermale utvekster i arrvevet. Nydannede kar er synlige blant kollagenfibrene. Enkle hårsekker og talgkjertler dukker opp.

Rottearr 9 måneder etter transplantasjon av epidermale MPA-celler fra rotte.

Klinisk bilde. Arrene har blitt betydelig mindre i størrelse sammenlignet med tidligere perioder, arealet er i gjennomsnitt omtrent 1,5–2,0 cm² ^. Arrene er ujevnt dekket med fine hår, spesielt i periferien. Mindre finflaskede overflater gjenstår.

Mikroskopisk bilde.

Epidermis har blitt tynnere, er representert av 6-8 rader med celler, ligner epidermis i normal rottehud i struktur, bare celletettheten er 1 mm høyere og de er mindre. Basallaget består av små rundsylindriske celler. Basalmembranen er godt uttrykt, hemidesmosomer er tydelig synlige. Tilstedeværelsen av epidermale utvekster i det subepidermale laget er bemerket. Papillarlaget er uttrykt langs hele arrets lengde. Disse faktaene indikerer at adhesjonen av de transplanterte keratinocyttene på dette tidspunktet har blitt mye sterkere med det underliggende arrvevet. Derfor kan arrbehandling hos personer med MPALK-transplantasjon 9 måneder etter MPC-transplantasjon være tradisjonell. Under epidermis er kollagenfibre mer delikate enn i de dype lagene. Mange kar har dukket opp, spesielt overfladiske. Veggene i større kar er tykkere. Hårsekker og talgkjertler er i store mengder. Det mikroskopiske bildet ligner dermallignende vev.

Resultater av eksperimentelt arbeid og diskusjon av disse.

I løpet av dette arbeidet ble keratinocytter i ulike former transplantert på kunstig laget rottehudarr etter dermabrasjonskirurgi – på sårbelegg, som en suspensjon på cambric og som et flerlagslag uten substrat. Arbeidet ble utført med mål om å innhente morfologiske data om effekten av transplanterte allogene keratinocytter på arr, samt å bestemme optimale transplantasjonsalternativer.

Det ble funnet at alle tre transplantasjonsmetodene er gjennomførbare, men transplantasjon av MPAC uten substrat er en svært arbeidskrevende prosedyre, der MPAC kan bli skadet, noe som påvirker resultatene av transplantasjonen. Dessuten utelukker denne transplantasjonsmetoden arbeid på store overflater.

Transplantasjon av keratinocyttsuspensjon er en mye mer kostnadseffektiv metode, krever ikke langvarig celledyrking og er enkel i den versjonen vi foreslår ved bruk av sterile kambriske blanker, hvis størrelser tilsvarer størrelsen på arrene. Forsinkelsen i den terapeutiske effekten ved transplantasjon av en cellesuspensjon på omtrent en måned sammenlignet med MPC på et sårbelegg er ikke et betydelig poeng med en behandlingsvarighet på mange måneder. Det er kjent at når MPC transplanteres til brannskadepasienter, skjer transformasjonen av hudstrukturen gradvis og over flere år. Transplantasjon av keratinocyttkultur på sårbelegg er den mest praktiske og lovende metoden, men også betydelig dyrere. I tillegg krever det for tiden et søk etter mer avanserte beleggalternativer som skal være fleksible, hygroskopiske, ha bakteriostatiske eller bakteriedrepende egenskaper og være biologisk nøytrale for celler. Filmen "Polypor" - en mellomversjon av den innenlandske filmsårbelegget, tillot oss, til tross for noen ufullkommenheter, å studere transplantasjon av rottekeratinocytter på arr i eksperimentet og trekke konklusjoner om effektiviteten av denne retningen for arrbehandling.

Forfatterne som transplanterte MPC på brannsår bemerket at epidermis tyknet og lagdelte seg i løpet av den første uken etter transplantasjon av et flerlags lag med keratinocytter på desinfiserte sår. Alle lag i epidermis var tydelig synlige. Interessant nok var antallet cellelag i transplantatene 10–30 % større enn i hudbiopsier. Forfatterne bemerket forekomsten av keratohyalingranuler på den femte dagen etter MPC-transplantasjon, og basalmembranen og hemidesmosomer – allerede på den tredje dagen.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) fant at i de tidlige stadiene etter transplantasjon av MPC til pasienter med fullhudsdefekter etter brannskader, er forbindelsen mellom dermis og epidermis svært svak og er en rett linje, papillærlaget er fraværende. Ved slutten av den andre måneden begynner grunne papiller og hudvedheng å dannes, og forbindelsen mellom dermis og epidermis blir sterkere. Litteraturdata indikerer at transplantasjon av allogene keratinocytter på sår hos brannskadepasienter er en lovende metode. Til tross for at avstøtning av allogene keratinocytter skjer, ifølge forskjellige forfattere, innen 10 dager til 3 måneder, spiller de likevel en rolle i helbredelsen av såroverflaten, utskillelse av vekstfaktorer og mekanisk lukking av defekten. Det antas at MPALC har redusert antigenaktivitet, siden de under in vitro-dyrking mister Langerhans-celler, noe som gjør at de kan eksistere i mottakerens kropp i lang tid. I tillegg har en allogen kultur hentet fra huden til unge, friske mennesker et usammenlignelig større biologisk potensial enn en autolog kultur av pasienter etter en skade.

Hovedmålet med studien vår var å finne ut om allogene keratinocytter vil slå rot i arr og hvilke endringer som vil skje i arrvevet under påvirkning av et slikt biologisk aktivt "sårbelegg". Ved et positivt resultat, å utvikle den mest effektive og minst arbeidskrevende teknologien for dette området innen rehabiliteringsmedisin.

Dataene vi innhentet var på mange måter like litteraturdataene om morfologiske endringer som oppstår i den menneskelige epidermis etter transplantasjon av allogene keratinocytter til brannsår. Det er imidlertid også betydelige forskjeller, både når det gjelder det morfologiske substratet som transplantasjonen skjer på og når det gjelder teknologi. Dermed skjer prosessen med dannelse av basalmembranen og dermal-epidermale forbindelser (hemidesmosomer, papiller) på et senere stadium sammenlignet med transplantasjon av keratinocytter til såroverflater uten arrforandringer. Tilsynelatende skjer dette på grunn av dårligere ernæring av arrvevet sammenlignet med dermis eller muskelfascien. Et arr, spesielt et gammelt, er et tett bindevev med et svært lite antall kar, mens bunnen av et brannsår er granulasjonsvev rikt på kar. Det er derfor åpenbart at forholdene som transplantasjon og innpoding av keratinocytter skjer under er helt forskjellige. Jo mer vaskularisert celletransplantasjonsområdet er, desto enklere er prosessen med innpoding. Fra dette postulatet følger konklusjonen om preferansen for å arbeide med unge arr, der bindevevet fortsatt er ganske løst og rikt på kar.

Som et resultat av dette eksperimentelle arbeidet ble det bevist at:

1. Transplantasjon av MPALK til arr er mulig.
2. Den optimale transplantasjonsmetoden er transplantasjon av keratinocytter på sårbelegget.
3. Arroverflaten bør poleres med kirurgisk laserdermabrasjon eller en Schumann-kutter.
4. Under påvirkning av MPALK skjer rask epitelisering av den polerte overflaten av arret.
5. Jo bedre vaskularisert arrvevet er, det vil si jo yngre arret er, desto bedre blir resultatene av keratinocytttransplantasjon.
6. Under påvirkning av transplanterte keratinocytter transformeres arrvevet gradvis og blir til et dermallignende (mer løst arrvev med hudvedheng).
7. Gradvis løsning av arrvev, startende med det subepidermale laget. Vaskulariseringen forbedres, kollagenfiberbunter i øvre og nedre del av arret får en løsere ordning enn i arrvev uten celletransplantasjon. Hårsekker og talgkjertler dukker opp. Epidermis, etter å ha passert hypertrofifasen, nærmer seg i sin struktur epidermis av normal hud.
8. De observerte endringene er assosiert med vekstfaktorer og cytokiner som skilles ut av keratinocytter, som ved å forbedre trofismen til arrvev fremmer dets transformasjon fra grovt fibrøst vev til løsere vev, noe som fører til en forbedring av arrets utseende.

Basert på denne studien kan det dermed konkluderes med at transplanterte keratinocytter har en gunstig effekt på arrvev, noe som kan ha praktiske implikasjoner for rehabilitering av pasienter med ulike typer arr.

Dette arbeidet på rotter tillot oss også å formulere kravene til sårbelegg som keratinocytter dyrkes på.

Sårbandasjer bør være:

• biokompatibel med celler,
• pustende,
• ha en elastisk, formdannende base,
• være hydrofil,
• ettersom medisinske tilsetningsstoffer inneholder antibakterielle legemidler og antioksidanter som ikke er giftige for dyrkede celler.

Kliniske resultater av bioteknologisk behandling av arr.

Tidligere fant N. Carver et al. (1993) at okklusive bandasjer best fremmer feste til såret og overlevelse av keratinocytter, men ikke tillater dannelse av lagdelt (moden) epidermis. Et luftig miljø er nødvendig for dannelse av lagdelt epidermis. Derfor, etter festing av et flerlagslag, ble det foreslått å fjerne den okklusive sårbandasjen etter 7-10 dager og behandle sår under tørre bandasjer eller vannløselige salver. Det kan sies at kvaliteten og egenskapene til "substratet" som cellene dyrkes på er et svært viktig punkt for effektiviteten av transplantasjon av cellemateriale, og dermed for resultatene av legenes arbeid. Men det finnes ingen ideell sårbandasje i dag, til tross for overfloden av foreslåtte alternativer (kunstig hud, ikke-vevd stoff laget av karboksymetylcellulose, fibrinbelegg, semipermeable polyuretanfilmer). Et viktig poeng i denne saken er kostnaden for "substrater" (spesielle sårbelegg), siden deres høye kostnad øker den totale kostnaden for bioteknologisk behandling.

Effektiviteten til celleteknologier har blitt bevist til dags dato, men dessverre er disse teknologiene svært dyre, spesielt i land der industriell produksjon av celleblandinger ikke er etablert. Land som USA har imidlertid lenge etablert en industri for produksjon av cellemateriale for brannskadetransplantasjon. Spesielt selskapet BioSurface Technology Inc. har siden 1989 dyrket 37 000 flerlags keratinocyttlag, som ble brukt til å behandle 240 pasienter i 79 land rundt om i verden (R. Odessey, 1992), mens 1 cm² ^cellekultur koster omtrent 7–8 amerikanske dollar.

Teknologien for behandling av ulike hudsykdommer og -problemer har en rekke forskjeller, men enhver cellebehandling er basert på å skaffe cellemateriale av høy kvalitet og transplantasjon av dette.

Denne prosessen består av følgende trinn:

• å ta hud fra ofre (eller fra donorer),
• transport av hudlapper til et bioteknologisenter,
• isolering av basallagsceller og deres proliferasjon,
• vekst av flerlags keratinocyttlag (MLK).
• cellekulturtransplantasjon.

Hovedproblemet med å utføre behandling med transplantasjon av flerlags keratinocyttark er behovet for levedyktige celler i alle stadier av celletransplantasjonen. Hudbiter for isolering av autologe eller allogene celler bør være så tynne som mulig, siden de i dette tilfellet er lettere å separere ved hjelp av mekaniske og enzymatiske metoder og få en suspensjon av levende celler for dyrking. De kan oppnås ved å skjære med et dermatom eller ved å bruke huden på øyelokkene, forhuden og den indre overflaten av skulderen. Siden cellene er følsomme for halogener (klor, jod) og hydrogenperoksid, kan de ikke brukes ved behandling av huden under materialinnsamling.

Det kvantitative og kvalitative utbyttet av celler fra hudtransplantater og effektiviteten av dyrkingen avhenger også av giverens helse og alder. I tillegg må hudbiopsier leveres så raskt som mulig og under passende forhold (miljø, temperatur) til et laboratorium som er sertifisert og akkreditert for disse formålene.

For oppbevaring og transport av hudlapper kan Eagle's medium eller medium 199 med tilsetning av 10 % bovint serum, DMEM-medium med tilsetning av 5 % føtalt bovint serum og antibiotika brukes.

I cytologilaboratoriet deles hudbiopsien først mekanisk i små biter, deretter bearbeides hudbitene ved hjelp av enzymer: trypsin, kollagenase, dispase, etc.

Under påvirkning av enzymer ødelegges desmosomer, og keratinocytter frigjøres til mediet i form av individuelle celler eller aggregater bestående av ulikt antall celler. Kun basale keratinocytter brukes til dyrking, og disse dyrkes på spesielle medier i termostater som inneholder 5 % CO₂, i petriskåler eller i kolber ved t = 37 °C. Allerede etter 48 timer observeres dannelsen av keratinocyttkolonier, som gradvis smelter sammen og blir til et monolag. Etter å ha mottatt et tilstrekkelig antall celler, sås den resulterende suspensjonen på sårbandasjer som er fremstilt for dette formålet og plasseres i petriskåler. Først dannes et monolag og deretter et flerlagslag av keratinocytter fra suspensjonen. Stadiene i keratinocyttdyrkingsprosessen er skjematisk vist i figur 12 (33,43,54,65).

Dannelsen av et flerlags keratinocyttlag som er egnet for transplantasjon tar vanligvis 7–10 dager. Noen ganger er denne perioden lengre, noe som avhenger av kvaliteten på kildematerialet (alder, giverens helsetilstand, korrekt materialinnsamling, kvaliteten på mediet som brukes, osv.). Hvis flerlagslaget vokser for mye, kan celler med apoptosefenomener som ikke er egnet for transplantasjon, dukke opp på overflaten. Petriskåler med flerlags keratinocyttlag (MLK) dyrket i dem på sårbelegg leveres til klinikken i spesielle beholdere ved en temperatur på minst +15 °C.

Modifisert Greens metode for dyrking av MPC

I vårt arbeid brukte vi flerlags kambric som sårbelegg, og forlot «Polypor»-filmene som vi begynte å jobbe med i forsøket med rotter. Dermed dyrket vi flerlags keratinocyttlag på forhåndsavfettet og steril kambric, selv om det heller ikke er et optimalt sårbelegg.

Kliniske studier ble utført på frivillige i samsvar med nødvendige etiske standarder: signering av en avtale og informert samtykke.

1. En kultur av pasientens egne (autologe) og lagrede (allogene) keratinocytter ble brukt.
2. Pasientenes egne keratinocytter ble hentet fra et hudstykke kuttet fra innsiden av overarmene deres.
3. Arrdermabrasjon ble utført ved hjelp av termokauteri, roterende skiver og en erbiumlaser.
4. Grupper av pasienter med normotrofiske, hypotrofiske og hypertrofiske arr ble tatt.

Den teknologiske prosessen for anvendelse av cellulær teknologi for å forbedre utseendet på hudarr besto av følgende trinn:

1. Pasientutvalg.
2. Forklaringer av behandlingens essens, tidsrammen for å oppnå forventede resultater, signering av kontrakt og informert samtykke.
3. Forskriv til pasienter 2-3 uker før operasjonen Selmevit 1 tablett 3 ganger daglig, Zinctheral 1 tablett 3 ganger daglig.
4. Ta et hudstykke 2,0 cm langt og 0,7-1,0 cm bredt fra skulderens indre overflate, høyt oppe, nesten i den nedre delen av aksillærområdet for å oppnå autologe keratinocytter.
5. I tilfeller der pasienter nektet å få isolert sine egne keratinocytter på grunn av muligheten for et lineært arr på skulderens indre overflate, ble cellemateriale tatt fra en cellebank (allogene keratinocytter).
6. Keratinocytter ble isolert og dyrket i et laboratorium som er sertifisert for denne typen arbeid.
7. Etter å ha innhentet tilstrekkelig mengde MPC for transplantasjon på arrene, ble det satt en dag for operasjonen på klinikken, hvor materialet ble brakt i spesielle beholdere i petriskåler.
8. En arrdermabrasjonsoperasjon ble utført, hemostase, den polerte overflaten ble vasket med en steril saltløsning, tørket, hvoretter MPC-ene ble transplantert på den på sterile kambriske "celler ned". Det vil si at cellene som var øvre i MPC-en viste seg å være nedre, ved siden av den polerte overflaten.
9. En steril film ble påført på toppen, som ble festet til huden med en elastisk bandasje eller elastisk Omnifix-plaster. I stedet for filmen kan det brukes likegyldige sårbandasjer som inneholder silikon, for eksempel Mepitel, Mepiform, silikongelark.

Etter 5–7 dager fjernes filmen eller silikonbelegget. På dette tidspunktet skal alle keratinocyttene ha krøpet opp på det polerte arret og festet seg til overflaten.

10. Det fuktige miljøet som skapes under filmen og silikonbelegget bidrar aktivt til dette. Kambrikkelaget som blir igjen på arret fra dette tidspunktet kan fuktes med curiosin eller kitosan gel. Som et resultat dannes det en tett skorpe på den andre dagen, som for pasientens bekvemmelighet best festes med en elastisk, pustende plaster, for eksempel Omnifix. Den pustende skorpen lar den dannede epidermis differensieres og bli moden.

Avhengig av arrtypen og hvor dypt det er gnidd, blir bandasjen avvist etter 8–10 dager. På dette tidspunktet har epidermis 30–40 % flere cellelag enn i normal hud. Basalmembranen er ikke dannet. Keratinocytter i den fortykkede epidermis skiller ut mye biologisk aktive molekyler i arrvevet.

Suksessen med bioteknologisk arrbehandling avhenger i stor grad av behandlingsmetoden i den postoperative perioden. Cellekulturer er en "skånsom" type sårbelegg, og i de tidlige stadiene etter transplantasjon kan IPC-ene enkelt skrelles av fra det underliggende vevet. Derfor anbefales pasienter å håndtere arret forsiktig etter operasjonen. Ikke gni og behandle forsiktig med kaldt kokende vann i 8–9 måneder for å unngå å rive av den tynne, nyopprettede epidermisen, som ikke har en tett binding til det underliggende vevet.

Note.

Før kirurgi og under dermabrasjon er bruk av halogenerte antiseptiske midler og oksidasjonsmidler (jodopyron, suliodopyron, jodinol, jodinat, klorheksidin, hydrogenperoksid) tillatt, før celletransplantasjon - er strengt kontraindisert på grunn av deres cytotoksiske effekt. Metylenblått og briljantgrønt er også giftige for celler.

For å unngå infeksjon, spesielt når man arbeider med hypertrofiske arr, kan det kirurgiske feltet behandles med neomycinsulfat, polymyksin eller gentamicin. De har ingen cytotoksisk effekt på keratinocytter.

Som et resultat av slik behandling oppnås en trippel effekt.

1. Utjevning av arroverflaten.
2. Dannelse av et lag med ny epidermis med normal tykkelse over den.
3. Transformasjon av arrvev til dermallignende vev på grunn av virkningen av cytokiner, vekstfaktorer og andre biologisk aktive molekyler som skilles ut av transplanterte celler og stimuleres av dem – keratinocytter, fibroblaster og makrofager.

Arret blir mindre synlig, mer elastisk, porer og vellushår vises i det, og pigmentering kan gjenopprettes på grunn av tilstedeværelsen av melanocytter i IPC.

Alle disse positive aspektene ved arret oppstår imidlertid ikke umiddelbart. I denne forbindelse er det nødvendig å advare pasientene om at prosessen med transformasjon av arrvev til hudvev skjer sakte, og det optimale resultatet av slik behandling kan forventes tidligst etter 10–14 måneder. Umiddelbart etter at bandasjene er fjernet, har de polerte overflatene en uttalt polykromi, jo lysere desto dypere poleringen ble utført. Minst mulig skade på huden observeres ved polering av normotrofiske arr med en erbiumlaser. Fargen på arrene og den omkringliggende huden ble gjenopprettet innen 3 til 8 uker. Til tross for slike forholdsregler oppstår det noen ganger postoperativ hyperpigmentering, som kan forsvinne av seg selv i løpet av noen få måneder.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]