Eksperimentelt arbeid med transplantasjon av allogene keratinocytter på kunstig skapte arr av hvite rotter

Ønsket om å bruke cellepotensialet og behovet for å finne nye og effektive metoder for å forbedre det estetiske utseendet på arr førte til ideen om å prøve å utforske muligheten for å transplantere keratinocytter arr på overflaten.

For å bevise muligheten for å bruke keratinocyttkulturmedium å forbedre utseendet på arr eksperimentelt arbeid har blitt gjort på hvite laboratorierotter, som ble opprettet arr overflaten. Modellen av rotens rumen ble oppnådd som følge av helbredelse av kunstig påførte sår på ryggen langs ryggraden. Rotter ble skåret stykker av samme lær, størrelse på 2x3 cm. Etter 2,5 måneder etter operasjon "simulering scarring" rotter ble utført dermabrasjon kirurgi (fjernelse av de øvre lagene via ignioperation rumen) og transplanterte allogene keratinocytter, isolert fra huden hos unge rotter av 2-4 dager etter fødselen.

Isolering og vekst av rotteepidermocytter ble utført i laboratoriet for cellulære teknologier ved Institutt for cytologi RAS av følgende teknologi.

Huden ble vasket i Hanks saltoppløsning inneholdende 200 U / ml gentamicin, kuttet i små biter, et område på 0,2-0,5 cm ². Hudbiter ble inkubert i en 0,5% oppløsning av disaspase i en balansert saltvannsfosfatbuffert løsning ved 37 ° C i en time. Brikkene ble så overført til Dulbeccos fosfatbuffede saltvann og epidermis ble separert fra dermis. Epidermis ble inkubert i en 0,125% trypsinløsning i 10-15 minutter under omrøring ved 50 rpm, hvoretter enzymets virkning ble stoppet ved tilsetning av 5% føtalt bovint serum. En tredjedel av den resulterende cellesuspensjonen ble benyttet i ren form for ett av alternativene for å transplantere arr, andre tredje dyrket på innenlands bioforlikelig film coating "Polipor", den tredje - på en petriskål uten et substrat. Operasjonen av dermabrasjonen av de oppnådde arr på rotter med påfølgende transplantasjon av rotte-epidermocytter på dem ble utført under eterbedøvelse ved bruk av en varmekreft.

Den første gruppen av rotter etter dermabrasjon på polert, vasket med saltvann og tørket overflate sterile vommen lagret stykker av plenen, som ble deponert egge allogen rotte epidermotsitov oppslemming ved en konsentrasjon på 1,5 millioner celler pr 1 ml (i henhold til Institute of Cytology). Cambric stykkene stablet på polert arr, slik at cellene som dannes på overflaten av arret. Bandasje på toppen av flere lag osteklede, som er sydd til kantene av arret.

En del av den resulterende cellesuspensjonen ble plettet i petriskåler på sterile Polypore-filmer kuttet i form av kopper, den andre delen på petriskåler uten film. Kultiveringen ble utført i et FAD-medium bestående av en blanding av DMEM og F12 i et forhold på 3: 1. Med tilsetning av 10% føtalt bovint serum, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0,5 μg / ml hydrokortisonhemisuksinat (Sigma). 10 μg / ml epidermal vekstfaktor EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Den andre og tredje gruppen av rotter med 7 personer ble operert 6 dager etter den første. På denne tiden ble flerskiktslag dannet fra suspensjonen av sådde keratinocytter i petriskål, som ble transplantert til rotter. Den andre gruppen ble transplantert med epidermocytter på filmen, den tredje gruppen - med et flerlagslag uten substrat. Etter 7 dager ble de flerlagslagene av alogiske keratinocytter (MPALK), sådd på Polypore-filmer, transplantert av kultur direkte på såroverflaten. Over, ble filmen festet med en flerlags gaze dressing og syet til huden på rotter for å unngå ripping.

Før transplantasjonen keratinocytter tredje gruppen av rotter, dyrket uten substrat, produserer en separasjon av PAC fra bunnen av petriskålen dispase behandling, som har evnen til selektivt å bryte den dermo-epidermale kommunikasjon. Under virkningen av et flerlags reservoar dispase ødelegger forbindelse av basalcellelaget til bunnen av petriskålen, og i mye mindre grad, det påvirker intercellulær kommunikasjon, som gjør det mulig å "fjerne" hele laget. Løsningen av flerlagscellestraten ved disposisjon ble utført som følger. Fra petriskåler blandet transportmedium, ble celle arkene vasket tre ganger med medium inneholdende antibiotika, spesielt - gentamycin (0,2 mg / ml). Flerlags lag ble hellet 0,125% dispase oppløsning ( «Sigma») og plassert i en inkubator hvor de ble inkubert ved t = 37 ° C i 20-30 minutter. Utseendet av hvite kronen, peeling rundt periferien av reservoaret - en indikator på begynnelsen av prosessen med å skille det fra kantene og bunnen av petriskålen. Noen få minutter etter starten på separasjonsprosessen ble dispase oppløsningen tømt 2-3 ganger epitele sjikt ble vasket med medium. På overflaten av den epidermale lag ble påført, skåret i størrelse kopp stykke sterilt sårbandasje "Leith-farge, som spaltes separeres dispase formasjon, ytterligere delaminering av bunnen av skålen med en spatel. Ved hjelp av oftalmiske pinsett laget sammen med belegget av bindet" Leith-farge "(russisk ) brøt ut fra bunnen av en petriskål og forsiktig overført til den preparerte overflaten av arret. Servietter "Lita-color", inneholder i sin sammensetning og gentamicin eksolin (kollagen ekstrakt), som når det er vått miljø forblir spire i fremtiden Shem saltløsning svellet og ble moderne sår belegg som gir god beskyttelse mot ekstern infeksjon og rask helbredelse på grunn av begynnende fukting med struktur.

Polypropfilmer og Lita-fargede servietter var lagdelt med gasbind bandasjer som ble syet på huden på rotter for mer holdbar fiksering. Hver rotte ble plantet i en separat bur, for å skape optimale forhold for vedlikehold og engraftment av transplanterte keratinocytter. Bandasjer rotter som transplanterte suspensjon og flerlags reservoar epidermotsitov skudd dispase, hver dag flere ganger om dagen som er fuktet med sterilt saltvann for å skape de mest gunstige forhold cellene for innpoding. Med tanke på at filmen "Polypor" var ugjennomtrengelig for vann, fukte rotter i den andre gruppen ikke forbindelsene, noe som var en av fordelene ved transplantasjoner uten filmer. Etter 10 dager ble bandasjerene fjernet. Det kliniske bildet av arr etter celletransplantasjon var lite forskjellig fra arr uten transplantasjon, bortsett fra mer rosa fargestoffer (på grunn av dermabrasjon) og større peeling. Dette faktum antyder at. At umiddelbart etter at sårforekliningene forsvunnet med IPC, oppsto det ingen endringer i vommen.

Tar biopsi materiale i rotter

Etter 1, 2, 5 og 9 måneder etter overføring av rotte alogiske keratinocytter til bakken arr av hvite rotter ble materialet tatt for histologisk, cytomorfologisk og elektronmikroskopisk undersøkelse. Som kontrollprøver av normal rottehud og arr ble tatt uten transplantasjon av celler. Anestesi hos rotter ble utført med eterbedøvelse.

Etter anestesi, fra de markerte områdene, inn i hvilke keratinocytter ble transplantert, en biopsi piercer med en diameter på 2 mm. Biter av arrvæv ble tatt og plassert i en 2,5% glutaraldehydløsning for å fremstille materialet for elektronmikroskopi. Stykker av vev tatt for histologisk undersøkelse ble plassert i 10% nøytralt formalin-oppløsning, etterfulgt av ledninger gjennom alkoholer og fylt i parafin, fulgt av kutting av ultratynne snitt og vise dem i den lyst optisk mikroskop.

Kontroll I. Normal rottehud.

For å se forskjellen mellom det mikroskopiske bildet av den normale arr-endrede huden på rotter og arr på bestemte tidspunkter etter IPC-transplantasjonen, vises fotografier og beskrivelser til dem i alle stadier av denne studien.

Den epidermis av normal hud består av 7-9 lag celler. Kåt lag med moderat tykkelse. På steder består det av 6-8 lag av kåte skalaer. Basallaget er representert av celler av sylindrisk form med stort lys, regelmessige kjerner og flere nukleoler. Desmosomale forbindelser mellom cellene og basalmembranen er tydelig uttrykt. Under veldefinerte basalmembranen som har fine fremspring i subepidermal lag ligger parallelt med den milde bunter av kollagen og elastin fibre, herunder langstrakte fibroblaster, små fartøyer. I dypere lag ligger buntene av kollagen og elastinfibrer i forskjellige retninger. Blant dem er det mange fartøy med tynne vegger av samme kaliber, cellulære elementer (fibroblaster, mastceller, leukocytter). I et stort antall hårfollikler, sebaceous kjertler.

Kontroll 2. Ar av en rotte 2 måneder gammel.

Klinisk bilde. Arter blekrosa, med peeling, på steder forblir skorpeene. Deres område er redusert på grunn av sammentrekning av kollagenfibre og blir tilnærmet 3,0-3,5 cm ^:. Hud vedlegg er fraværende.

Mikroskopisk bilde. Epidermis består av 3-5 lag av celler, foldede representert ved avrundede basalceller, en rad subulate, 1-2 rader keratohyalin granulat med korn i det øvre lag, er det deler av intracellulær ødem. Hornhinnen lagres heterogent fra meget tynt til fortykket. Det er en folding av rommen på grunn av (sammentrekning) av arrvev. Brettene trer inn i papillærlaget og gir inntrykk av papiller. Grensen mellom epidermis og dermis er en rett linje. Den basale membranen kan ikke spores overalt. I den nedre delen av de subepidermale og dypere lagene - kar med tykk, løsnet vegg, mange øde, med stasisfenomener. Rundt fartøyene - en klynge av makrofager, fibroblaster. Makrofager omgir erytrocytene som kommer fra kapillærene og fagocytter dem. I de mer overfladiske lagene - små kapillærer. Under epidermis er kollagenfibrene løs. I det dypere lag av rummen - grove bunter av kollagenfibre, blant hvilke det er mange fibroblaster.

Arr av en rotte en måned etter transplantasjon av MPAl rotte rotte keratinocytter.

Klinisk bilde. Ärrrosa, deres areal har redusert, spesielt i diameter og gjennomsnitt 2,5-3 cm ². Hår og talgkjertler er fraværende.

Disse mikroskopisk undersøkelse av det erholdte materiale fra rotter med overføring MPAlK MPAlK på filmen og substratet uten i det vesentlige identiske. Men teknisk sett, arbeide med MPAlK støttes mye mer vanskelig og arbeidskrevende enn da vokst MPAlK på underlaget, slik at videre studier av problemet på transplantasjon kertainotsitov arr vi brukt som grunnlag for dyrking ( "underlaget") lagdelt plenen.

Mikroskopisk bilde. Det er en fortykning av epidermis til 15-20 lag, nesten til midten av hvilken keratinocyttene har en smal, langstrakt, vertikal form og et kompakt arrangement. Basalcellene er anordnet i en ujevn linje. Kjernene deres er lette, store, runde i form med en eller to nukleoler, noe som indikerer deres høye syntetiske og proliferative aktivitet. Grensen mellom epidermis og dermis er en rett linje. Det tornete laget er godt utviklet, består av 3-5 lag celler med rund form, det er 2 nukleolceller.

Umiddelbart under basalmembranen - tett bundne tynne bunter av kollagenfibre, parallelt med dem et stort antall tomme kar, dypere kollagenfibre er grovere, oppsamlet i tette bunter. Mange store fibroblaster, mastceller (2-3 i synsfeltet), makrofager, leukocytter og tomme kar, hvor veggene løsnes, rundt dem er løst lokaliserte kollagenfibre. I enkelte fartøyer - stasis, diapedesis av ensartede elementer. Rundt fartøyene - fibroblaster, enkelt lymfocytter. Hud vedlegg er fraværende.

Når en keratinocytoppløsning transplanteres til et polert arr, varierer det mikroskopiske bildet fra den forrige. I de fleste dyr er epidermis tynn, består av 5-6 lag celler. Det nedre laget består av celler av uregelmessig, polygonal form med avrundede uregelmessig formede kjerner. Tilstanden til det subepidermale lag er lik det i gruppen av dyr uten transplantasjon.

I dette tilfellet kan man tale om forsinkelse av prosessene som følger med celletransplantasjon, eller av et stort tap av celler transplantert i form av en suspensjon. Derfor ble det konkludert med at korreksjonen av arrdannelse ved keratinocyttransplantasjon i form av en suspensjon er upassende.

Scarring av rotte 2 måneder etter transplantasjonen av MPAl rotte rotte keratinocytter.

Klinisk bilde. Arret ser tynt, ømt ut. På steder er det en eksdysis, skalaer.

Mikroskopiske bilder. Stratum corneum er tykkere, på steder - hyperkeratose. Den epidermis er tykkere, den består av 12-20 rader celler. Grensen mellom epidermis og dermis er en rett linje. Delikate kollagenfibre under epidermis ligger ganske tett. I dypere lag av rummen samles de i grove store bunter. I det subepidermale laget vises en ny formasjon av kar. I de nedre lagene av arrvæv - mange tomme kar, som ligger parallelt med overflaten av epidermis. Store fibroblaster er jevnt fordelt i tykkelsen av rummen, det er gigantiske, flerfasetterte, mange makrofager.

Arring av rotte 5 måneder etter transplantasjon av MP av rotte spermocytter.

Klinisk bilde. Arr ser glatt, jevn, uten avskalling, er det enkelt hår av deres større tetthet på periferien av arr, som viser kant innvokste hårsekker i vommen og svulst i hårsekkene. Området av arr fortsetter å synke.

Mikroskopisk bilde. Den epidermis er fortsatt tykk (15-20 lag, noen ganger opptil 30) i de øvre lagene er fylt med keratogialinkorn. Den basale membranen er tydelig synlig. Under hennes kollagenfibrer ligger løs. I de nedre lagene er kollagen kraftigere og tett pakket. Blant strålene av kollagen er det mange kapillærer. I de øvre lagene reduseres antall tomme kar. Den epidermis og dermis er litt bølgete. Det er dype epidermale utvekster i arrvevet. Blant kollagenfibrene er synlige nyformede kar. Vis enkelt hårfollikler og talgkjertler.

Scarring av rotte 9 måneder etter transplantasjonen av IPA rotte rotte epidermocytter.

Klinisk bilde. Arter ble mye mindre i forhold til tidligere vilkår, deres areal er omtrent 1,5-2,0 cm ². Arr er ujevnt dekket med tynt hår, spesielt rundt omkretsen. Mindre liten tallerken skalering beholdes.

Mikroskopisk bilde.

Den epidermis ble tynnere, representert fra 6-8 rader av celler, som minner om epidermal struktur av normal hud av rotter, kun tetthet av celler med 1 mm. Høyere og de er mindre. Basal laget består av små celler med rund sylindrisk form. Den basale membranen er veldefinert, hemidesmosomer er tydelig synlige. Tilstedeværelsen av epidermale utvekster i det subepidermale lag er notert. Papillærlaget uttrykkes langs hele lengden på arret. Disse fakta viser at i løpet av denne tidsperioden har adhesjonen av de transplanterte keratinocyttene blitt mye mer holdbare med vevets underliggende vev. Følgelig, omsorg for arr av mennesker med MALC transplantasjon 9 måneder etter IPC transplantasjon kan være tradisjonell. Under epidermis er mer delikate kollagenfibrer enn i de dype lagene. Det var mange fartøy, spesielt overfladisk plassert. I større fartøy er veggene tykkere. Hårfollikler og sebaceous kjertler i store mengder. Det mikroskopiske mønsteret ligner et dermalt vev.

Resultater av eksperimentelt arbeid og deres diskusjon.

I løpet av dette arbeidet på kunstig hud arr av rotter etter operasjon dermabrasjon, transplanterte keratinocytter i ulike formah- på såroverflater, som en suspensjon i cambric og lagdelt formasjon uten et substrat. Arbeidet ble utført for å oppnå morfologiske data om effekten av transplanterte allogene keratinocytter på arr, samt å bestemme de optimale transplantasjonsvarianter.

Det ble funnet at alle tre transplantasjonsmetoder er ekte, men transplantasjon av IPAA uten substrat er en svært arbeidskrevende prosedyre, der IPAC kan bli skadet, noe som påvirker transplantasjonens resultater. Videre utelukker denne metoden for transplantasjon arbeid på store overflater.

Transplantasjon keratinocytt-suspensjon - er betydelig mer økonomisk metode ikke krever en lang dyrking av celler og enkel i den foreliggende utførelse, ved hjelp av kontakt sterile cambric fiberemner, hvis dimensjoner svarer til verdien av arrdannelse. Reserve terapeutisk effekt når transplantasjonen cellesuspensjon i omtrent en måned, sammenlignet med IPC på sårbandasjen - ikke en signifikant øyeblikk da varigheten av behandlings beløper seg til mange måneder. Det er kjent at under transplantasjonen av IPC for å brenne pasienter, skjedde transformasjonen av hudstruktureringen gradvis og i flere år. Transplantasjon av keratinocytkulturen på sårbekledning er den mest praktiske og lovende metoden, men det er også mye dyrere. I tillegg krever søk etter dag forbedret varianter belegg, som bør være bøyelige, hygroskopiske, har bakteriostatiske eller baktericide egenskaper, og for å være biologisk nøytralt for celler. Filmen "Polipor" - en mellomversjon av det innenlandske film såret dekning, til tross for noen svakheter, har tillatt oss å studere eksperimentelt keratinocytt transplantasjon rotter på arr og til å trekke konklusjoner om effekten av denne retningen tiltrekning arrdannelse.

Forfatterne som utførte IPC-transplantasjonen på brente sår, bemerket at i løpet av den første uken etter transplantasjon av flerlags keratinocytlaget på de sanitiserte sårene, ble epidermiene fortykket og stratifisert. Alle lag av epidermis var veldefinert. Det er interessant at antall cellelag i transplantasjoner er 10-30% større enn i hudbiopsiprøver. Forfatterne bemerket utseendet av granulater av keratogialin på den femte dagen etter transplantasjonen av MPA, basalmembranen og hemidesmosomene - allerede på den tredje dagen.

J. Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) fant at under de tidlige perioder etter transplantasjon BMD-pasienter med polnosloynymi hud defekter etter forbrenninger, er kommunikasjon mellom dermis og epidermis meget svak og er en rett linje, er papillær lag fraværende. Ved slutten av den andre måneden begynner dannelsen av grunne papiller og appendages av huden, forbindelsen mellom dermis og epidermis blir mer holdbar. Litteraturdataene snakker om transplantasjon av allogene keratinocytter på sårene av brente pasienter, som en lovende metode. Til tross for det faktum at avvisning av allogene keratinocytter oppstår innsendt av forskjellige forfattere i perioden fra 10 dager til 3 måneder, men de har en rolle i helingen av såret overflate, frigjør vekstfaktorer og mekanisk lukking av defekten. Det antas at MPALK har en redusert antigene aktivitet, siden Langerhans-cellene, under dyrking in vitro, taper, noe som gjør at de kan eksistere lenge i mottakerorganismen. I tillegg har den allogene kulturen som er oppnådd fra huden av unge friske mennesker, et ujevnt større biologisk potensiale enn den autologe kulturen til pasienter etter traumer.

Hovedmålet med studien var å finne ut om allogene keratinocytter vil overleve på arrene og hva vil være endringene i arrvævet under påvirkning av slik biologisk aktiv "sårbelegg". I tilfelle et positivt resultat, utarbeide den mest effektive og minst arbeidskraftintensive teknologien innen dette rehabiliteringsmedisinske området.

Dataene som vi oppnådde på mange måter viste seg å være lik litteraturdata om de morfologiske forandringene som forekom i den menneskelige epidermis etter overføring av allogene keratinocytter til å brenne sår. Men det er betydelige forskjeller, både når det gjelder det morfologiske substratet, som transplanteres, og når det gjelder teknologi. So. Prosessen med dannelse av basalmembran og dermo-epidermale forbindelser (hemidesmosomer, papiller) oppstår på et senere tidspunkt enn i keratinocyttransplantasjonen til sårflatene uten arr-endringer. Dette ser ut til å skyldes dårlig næring av vevets vev i forhold til dermis eller muskel fascia. Arret, spesielt det gamle, er et tett bindevev med et svært lite antall kar, bunnen av brennsåret er et granulasjonsvev som er rik på blodkar. Således er det åpenbart at betingelsene under hvilke transplantasjon og engraftment av keratinocytter forekommer, er helt forskjellige. Jo mer vascularized området transplantasjon av celler, jo lettere er det å behandle dem. Fra dette postulatet er det en konklusjon om preferansen for å arbeide med unge arr, hvor bindevevet fortsatt er løs nok og rik på blodkar.

Som et resultat av dette eksperimentelle arbeidet er det bevist at:

1. En transplantasjon av MALK til arr er mulig. 
2. Den optimale transplantasjonsmetoden er transplantasjonen av keratinocytter på sårdekselet.
3. Overflaten av arret skal males ved bruk av en operativ dermabrasjon ved bruk av Schumanns laser eller en kutter.
4. Under påvirkning av MPALK forekommer hurtig epithelisering av bakken av bakken.
5. Jo bedre vaskulært arrvev, det vil si jo yngre arr, desto bedre blir resultatet av keratinocyttransplantasjon.
6. Arvevevet under påvirkning av transplanterte keratinocytter blir gradvis forvandlet og blir til et hudlignende (mer løst arrvev med hudens vedlegg).
7. Gradvis løsning av arrvæv begynner med subepidermisk lag. Forbedrer sin vaskularisering, bunter av kollagenfibre i de øvre og nedre delene av rummen tar en mer sprø plass enn i arrvevet uten transplantasjon av celler. Det er hårfollikler og sebaceous kjertler. Epidermis i sin struktur, nærmer seg fasen av hypertrofi, nærmer seg epidermis av normal hud.
8. De observerte endringene er assosiert med keratinocytt-avledede vekstfaktorer, cytokiner, som forbedrer trofismen i arrvevet og letter transformasjonen fra grovt fibrøst vev til en mer løs, noe som fører til en forbedring av arrartypen.

På bakgrunn av denne studien kan det derfor konkluderes med at den fordelaktige effekten av transplanterte keratinocytter på arrvæv, noe som kan være av praktisk betydning for rehabilitering av pasienter med ulike typer arr.

Dette arbeidet med rotter har også lov til å formulere krav. Til sårbekledning, på hvilke keratinocytter blir dyrket.

Sårbelegg skal være:

• biokompatibel med celler,
• pustende,
• ha en elastisk, formbyggingsbase,
• være hydrofil,
• som medisinske tilsetningsstoffer inneholder antibakterielle stoffer og antioksidanter er ikke giftige for dyrkede celler.

Kliniske resultater av bioteknologisk behandling av arr.

Tidligere, N. Carver et al. (1993) fant at okklusive dressinger er best for å feste seg på keratinocytteres sår og overlevelse, men tillater ikke dannelse av en stratifisert (moden) epidermis. For å danne stratifisert epidermis, er et luftmiljø nødvendig. Derfor, etter å ha festet flerlagslaget, ble det foreslått et okklusivt sårdekning etter 7-10 for å fjerne og utføre sår under tørre bandager eller vannløselige salver. Vi kan si at kvaliteten og egenskapene til "substratet" som cellene dyrkes på, er svært viktige for effektiviteten av transplantasjon av det cellulære materialet, og følgelig for resultatene av legemidlets arbeid. Men det finnes ingen ideell sårdekning i dag, til tross for overfloden av de foreslåtte alternativene (kunstskinn, ikke-vevet karboxymetylcellulose, fibrinbelegg, semipermeable polyuretanfilmer). Ikke ubetydelig øyeblikk i denne saken er kostnaden for "substrater" (spesielle sårbelegg), da deres høye kostnader øker den totale kostnaden for bioteknologisk behandling.

Effektiviteten av cellebehandling til dags dato bevist, men, dessverre, disse teknologiene er svært dyrt, spesielt i land der det ikke er industriell produksjon av mobilnettet komposisjoner. Likevel har land som USA lenge etablert en industri for produksjon av cellulært materiale for transplantasjon av brent. Spesielt selskapet BioSurface Technology Inc, siden 1989, hevet 37.000 laminerte lag av keratinocytter, som har vært brukt til behandling av 240 pasienter i 79 land rundt om i verden (R.Odessey, 1992) med en cm ² cellekultur koster ca 7-8 $ US.

Teknologien til å behandle ulike sykdommer og hudproblemer har en rekke forskjeller, men i hjertet av enhver behandling med celler er produksjonen av kvalitetscellemateriale og dets transplantasjon.

Denne prosessen består av følgende trinn:

• utvalg av hud fra de berørte (eller fra givere),
• transport av hudflapper til bioteknologisenteret,
• isoleringen av celler i basalaget og deres multiplikasjon,
• oppbygging av flerlagslag av keratinocytter (IPC).
• transplantasjon av cellekulturer.

Hovedproblemet i behandlingen med transplantasjonen av flerlags keratinocytlag er behovet for levedyktige celler i alle stadier av celletransplantasjon. Hudstykker for isolering av autologe eller allogene celler bør være så tynne som mulig, siden i dette tilfellet er de lettere å separere ved hjelp av mekaniske og enzymatiske metoder og for å oppnå en suspensjon av levende celler for vekst. De kan oppnås ved å kutte av dermatomet eller ved å bruke huden på øyelokkene, forhuden, den indre overflaten av skulderen. Gitt at cellene er følsomme overfor halogener (klor, jod), hydrogenperoksid, kan de ikke brukes til behandling av huden når stoffet tas.

Det kvantitative og kvalitative utbyttet av celler fra hudtransplantater og effektiviteten av dyrkningen avhenger også av helsestatus og alder av giveren. I tillegg skal hudbiopsiprøver leveres til laboratoriet så snart som mulig og i passende forhold (miljø, temperatur) levert til et sertifisert og akkreditert laboratorium.

Eagle's medium eller medium 199 med tilsetning av 10% bovint serum, DMEM medium tilsatt 5% føtalt bovint serum og antibiotika kan brukes til å lagre og transportere hudflapper.

I det cytologiske laboratoriet blir kutan biopsi først mekanisk delt inn i små stykker, deretter behandles hudfragmenter ved hjelp av enzymer: trypsin, kollagenase, dyspase, etc.

Under virkningen av enzymer finner destruksjon av desmosomer sted og keratinocytter blir frigjort i mediet som separate celler eller aggregater som består av forskjellige antall celler. For kultur brukes kun basale keratinocytter som dyrkes på spesialmedier i inkubatorer som inneholder 5% CO., I petriskål eller i hetteglass ved t = 37 ° C. Innen 48 timer observeres dannelsen av keratinocytkolonier som gradvis konvergerer til et monolag. Etter oppnåelse av et tilstrekkelig antall celler, blir den resulterende suspensjon spredt på sårdekslene tilberedt for dette formål og plassert i petriskål. Fra suspensjonen dannes først et monolag og deretter et flerlagslag av keratinocytter. Skjematisk er stadiene av keratinocytkultiveringsprosessen vist i fig. 12 (33,43,54,65).

Dannelsen av en flerlags keratinocytformasjon egnet for transplantasjon tar vanligvis 7-10 dager. Noen ganger er denne perioden lengre, som avhenger av kvaliteten på kildematerialet (alder, donorhelse, materialets korrekthet, kvaliteten på mediene som brukes, etc.). Hvis flerlagslaget overgås, kan det på sine overflater være celler med apoptosefenomener som er uegnet til transplantasjon. Petriskål, med vokse i dem på sårbekledning av flerlagslag av keratinocytter (IPC), leveres til klinikken i spesielle beholdere ved en temperatur ikke lavere enn + 15 ° C.

Den modifiserte grønns metode for å dyrke IPC

I vårt arbeid som sårbelegg brukte vi en flerlags-kambric, forlot polyporfilmene som vi begynte å jobbe med i et eksperiment med rotter. Således ble flerlags keratinocyttlag dannet av oss på prefat og steril batiste, selv om det heller ikke er det optimale sårdekning.

Kliniske studier ble utført på frivillige med overholdelse av de nødvendige etiske normer: signering av en traktat og informert samtykke.

1. Kulturen av egen (autolog) og tatt fra bankcellene (allogene) keratinocytter ble påført.
2. Ekte keratinocytter ble oppnådd fra et stykke hudskåret fra innsiden av pasientens skulder.
3. Dermabrasjon av arr ble utført ved hjelp av termokobling, roterende disker og erbium laser.
4. Grupper av pasienter med normotrofisk, hypotrofisk og hypertrofisk arr ble tatt.

Den teknologiske prosessen for anvendelse av mobilteknologi for å forbedre typen hud arr besto av følgende stadier:

1. Utvalg av pasienter.
2. Forklar essensen av behandlingen, tidspunktet for å oppnå de forventede resultatene, signeringen av en traktat og informert samtykke.
3. Utnevnelse av pasienter i 2-3 uker før kirurgi selmevit med 1t. 3 ganger om dagen, zinkteral på 1t. 3 ganger om dagen.
4. Ta et stykke hud 2,0 cm langt og 0,7-1,0 cm bredt fra skulderens innsideoverflate, høyt, nesten på bunnen av akselområdet, for å oppnå autologe keratinocytter.
5. I tilfelle pasienter som nekter å isolere sine egne keratinocytter på grunn av muligheten for å få en lineær arr på skulderens indre overflate, ble cellematerialet tatt fra en cellebank (allogene keratinocytter).
6. Keratinocytter ble isolert og dyrket under betingelser for et laboratorium sertifisert for denne type arbeid.
7. Etter å ha fått en IPC tilstrekkelig til transplantasjon, ble det administrert en kirurgi til arrene på klinikken, hvor materialet ble brakt i spesielle beholdere i petriskål.
8. Operasjonen av dermabrasjon av rummen, hemostase ble utført, bakken ble vasket med steril saltoppløsning, tørket, hvorpå IPC ble transplantert på sterile batistiske "celler ned". Det vil si at cellene som var øvre i MIC var lavere, ved siden av den polerte overflaten.
9. En steril film ble lagt på toppen, som ble festet til huden med elastisk bandasje eller Omnifix elastisk båndstøtte. I stedet for filmen kan også likegyldige sårbelegg som inneholder silikon, for eksempel Mepitel, Mepiform, silikongelplater, benyttes.

Etter 5-7 dager fjernes film- eller silikonbelegget. Ved dette tidspunktet må alle keratinocytter krype på det polerte arret og feste til overflaten.

10. Det våte miljøet skapt under film og silikonbelegg bidrar aktivt til dette. Baptisten som gjenstår i arret fra dette punktet kan impregneres med curiose eller chitosan gel. Som et resultat, er det på den andre dagen en tett skare opprettet, noe som for pasientens bekvemmelighet er bedre å fikse med en elastisk, luftgjennomtrengelig gips, for eksempel Omnifix. Den pustende skorpe gjør det mulig for nyopprettede epidermier å skille seg og bli en moden.

Avhengig av typen arr og dybden av sliping avvises dressingen etter 8-10 dager. Den epidermis på denne tiden har 30-40% mer cellulære lag enn i normal hud. Den basale membranen dannes ikke. Keratinocytter av den fortykkede epidermis frigjør en masse biologisk aktive molekyler i arrvævet.

Suksessen til bioteknologisk behandling av arr er i stor grad avhengig av hvordan de blir tatt vare på i den postoperative perioden. Cellekulturer er en "øm" slags sårdeksel, og i de tidlige perioder etter transplantasjon kan BMD enkelt løsnes fra det underliggende vevet. Derfor anbefales pasienter å ta vare på arr etter operasjon. I 8-9 måneder må du ikke gni og lett arbeide med kaldt kokt vann for å unngå å rive av en tynn, nyopprettet epidermis som ikke har et tett grep med det underliggende vevet.

Merk.

Før kirurgi og under dermabrasion bruk av halogenerte oksydasjonsmidler og konserveringsmidler (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, klorheksidin, hydrogenperoksid) er tillatt før transplantasjonen kletok- absolutt kontra på grunn av deres cytotoksiske effekter. Giftig for celler er også metylenblå. Strålende grønn.

For å unngå infeksjon, spesielt når man arbeider med hypertrofiske arr, er det mulig å behandle operasjonsfeltet med neomycinsulfat, polymyksin eller gentamicin. De utøver ikke en cytotoksisk effekt på keratinocytter.

Som et resultat av denne behandlingen oppnås en trippel effekt.

1. Justering av romens overflate.
2. Lag et lag over det av en ny epidermis, normal tykkelse.
3. Omdannelsen av arrvæv til dermoid-lignende på grunn av virkningen av cytokiner, vekstfaktorer og andre biologisk aktive molekyler, utskilt av transplanterte celler og stimulert av dem keratinocytter, fibroblaster og makrofager.

Arret blir mindre merkbart, mer elastisk, porer vises i det, puff hår, pigmentering kan gjenopprettes på grunn av tilstedeværelsen av melanocytter i MPC.

Men alle disse positive øyeblikkene i cicatrix kommer ikke umiddelbart. I denne forbindelse er det nødvendig å advare pasienter. At prosessen med transformasjon av arrvæv i dermis er langsom og det optimale resultatet av en slik behandling kan forventes ikke tidligere enn 10-14 måneder. Umiddelbart etter at dressingen er avvist, har de polerte overflatene et utpreget polychrom, jo lysere er slipingsprosessen. Den minste skaden på huden oppstår når man sliper de normotrofiske arr med en erbiumlaser. Fargen på arr og omkringliggende hud ble restaurert i perioden fra 3 til 8 uker. Til tross for slike forholdsregler, er det noen ganger postoperativ hyperpigmentering, som kan fortsette uavhengig i flere måneder.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]